Serotoninergic innervation of the frog spinal cord and involvement of 5-HT5A receptors in the modulation of miniature glycinergic postsynaptic potentials of lumbar motoneurons

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Функциональное значение семейств и подтипов серотониновых рецепторов, модулирующих моторный выход спинного мозга изучено недостаточно. Это касается 5-НТ₅, одного из семейств серотониновых рецепторов, обнаруженного в конце прошлого столетия [1]. Его два подтипа: 5-НТ_5A R и 5-НТ_5BR выявлены у грызунов, у человека описан только один – 5-НТ_5AR [2–4]. По данным атласа протеинов человека (НРА – The version 21, www.proteinatlas.org). экспрессия РНК 5-НТ_5A рецептора присутствует в тормозных и возбуждающих нейронах, а также в глиальных клетках, причем наибольший базовый уровень экспрессии отмечен в мозжечке, наименьший – в спинном мозге.

Распределение 5-HT_5AR- like иммунореактивности в разных отделах мозга крысы было успешно картировано иммуногистохимически [5]. С помощью световой и электронной микроскопии в спинном мозгу крыс распределение 5-НТ_5AR выявлено иммуноцитохимически [6, 7]. Доли с соавторами описано заметное присутствие 5-НТ_5AR в нейронах дорсальных рогов и редкое – в немиелинизированных и миелинизированных волокнах в области входа дорсальных корешков в мозг. Ими высказана гипотеза, что рецепторы 5-НТ_5A согласно их обильному распределению в нейронах поверхностных пластин дорсального рога, возможно участвуют в контроле ноцицепции. Кроме экспрессии 5-НТ_5AR в дорсальных рогах спинного мозга показана экспрессия в дорсолатеральном моторном ядре поясничного сегмента L6. Слабая экспрессия рецептора выявлена во всех группах мотонейронов пластинки IX других сегментов и в интермедиолатеральной области, что предполагает постсинаптическое участие 5-НТ_5AR в контроле моторных и вегетативных функций [6].

Известно, что успешная расшифровка функции рецепторов возможна с применением селективных лигандов. Ранее была установлена высокая аффинность агониста серотониновых рецепторов 5-СТ (5-carboxamidotryptamine) к 5-НТ_5AR при изучении его путей сигнализации [3, 8–10], а позже были разработаны селективные антагонисты, SВ699551 [11, 12] и ASP5736 [13]. Исследования боли на крысах в моделях с использованием формалинового и других тестов с параллельной оценкой экспрессии 5-HT_5AR в спинном мозгу и в спинномозговых ганглиях привели ряд авторов к констатации антиноцицептивной роли 5-HT_5AR [14–16]. В результате было сделано заключение, что 5-HT_5AR могут служить терапевтической мишенью для разработки анальгетиков.

Другой аспект изучения 5-HT_5AR – его функциональное значение при регуляции возбудимости в сенсомоторных цепочках, например, в слуховой цепи при реакции вздрагивания, испуга в ответ на звуковой стимул. Пластичность реакции вздрагивания обычно изучается с помощью определения преимпульсного торможения (PPI) [17]. Дефицит преимпульсного торможения связан с нарушениями обработки информации, особенно при шизофрении [18, 19]. Важно отметить, что при этом заболевании обнаружены вариации генов 5-HT_5A рецепторов, которые могут являться потенциальными клиническими мишенями [11, 20]. Сенсомоторные проявления участия 5-HT_5AR в регуляции возбудимости в слуховой цепи успешно анализировались на низших позвоночных: фaрмакологические и электрофизиологические исследования функции 5-HT_5AR с тестированием поведения проводились in vivo на золотой рыбке [17]. Экспрессия 5-HT_5AR документирована в маутнеровском нейроне рыбки тиляпии [21]. Однако вопросы функционирования 5-HT_5AR в нейронных цепях спинного мозга, в СРG (Central Pattern Generator) и их роль в модуляции активности мотонейронов остаются невыясненными.

Попытка раскрыть возможное участие 5-НТ_5AR в модуляции тормозной глицинергической миниатюрной активности (глимТПСП) мотонейронов поясничного отдела спинного мозга предпринята нами на изолированном спинном мозге одного из представителей наземных тетрапод, взрослой озерной лягушки Rana ridibunda.

Мы выполняли исследование с помощью двух подходов: электрофизиологического с внутриклеточной регистрацией миниатюрных глицинергических тормозных постсинаптических потенциалов (глимТПСП) мотонейронов лягушки, модулируемых лигандами серотониновой передачи, и флуоресцентного иммуногистохимического для выявления серотонинергической иннервации, а также возможного присутствия в поясничных сегментах 5-HT_5A R.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Электрофизиология

Электрофизиологические исследования совместно с фармакологическими тестами проводили на суперфузируемых поясничных сегментах изолированного спинного мозга взрослых озерных лягушек Rana ridibunda, животных обоего пола массой тела 70–160 г.

После эфирного наркоза животного проводили дорсальную ламинэктомию до зрительных бугров с непрерывным орошением по ходу операции физиологическим раствором, вырезали костную пластинку со спинным и продолговатым мозгом и погружали в предварительную камеру с охлажденным раствором, где высвобождали корешки 8–10-го поясничных сегментов. Затем переносили мозг в экспериментальную камеру. Поперечными разрезами выделяли сегменты толщиной около 2.5–3 мм, которые использовали последовательно. С помощью тонких иголок тестируемый срез фиксировали в камере с дном, покрытым силгардом, ростральной поверхностью вверх. Нормальный суперфузирующий раствор имел следующий состав в мМ: NaCl 98, KCl 2.0, NaHCO₃9.3, MgCl₂0.5, глюкоза 5, CaCl₂ 1.1, Трис (pH 7.4–7.6) и постоянно аэрировался карбогеном (98% О₂ и 2% СО₂). Температуру раствора в камере поддерживали в диапазоне 15–18 °C.

Внутриклеточное отведение от мотонейронов производили с помощью стеклянных микроэлектродов из боросиликатных трубочек (SUTTER INSTRUMENT), заполненных 3 М раствором KCl, с диаметром кончика 1–1.5 мкм и сопротивлением 10–20 МОм. Мотонейроны идентифицировали по антидромным потенциалам действия (АПД), вызываемым раздражением вентрального корешка (через всасывающий электрод одиночными стимулами (0.1 мс, 10–15 мкА)). Уровень мембранного потенциала покоя (МПП) измеряли цифровым вольтметром. Потенциалы регистрировали через аналогово-цифровой преобразователь на персональный компьютер с выхода микроэлектродного усилителя с автоматической стабилизацией нулевой линии, разработанного в лаборатории. Записывали пробеги длительностью 250 мс с частотой 1 с^-1 при регистрации АПД (5–10 пробегов) и с частотой 3 с^-1 при регистрации спонтанной (сПСП) и миниатюрной постсинаптической активности мотонейронов (мПСП) по 300 пробегов. Время отведений активности мотонейронов длилось от одного (в случае быстрого установления стабильных показаний МПП, до двух часов. Обусловленные спонтанным выделением медиаторов мПСП регистрировали в условиях блока проведения импульсов по пресинаптическим волокнам через 15–20 мин после добавления в суперфузирующий раствор 1.0 мкМ тетродотоксина (ТТх). Затем для выделения тормозной фракции мПСП в раствор добавляли блокатор NMDA-рецепторов (D-AP5, 50 мкМ) и блокатор AMПA- и каинатных рецепторов (CNQX, 25 мкМ), таким образом исключая возбуждающую синаптическую активность, опосредованную глутаматом. Для выделения глимТПСП апплицировали бикукуллин (20 мкМ) – избирательный антагонист ГАМК_А-рецепторов, для идентификации глимТПСП – стрихнин (Str) (1мкМ), блокатор глициновых рецепторов.

Для проведения работы использовали следующие вещества от фирмы Sigma (США): ТТх, стрихнин – Str, серотонин, (5-hydroxytryptamine) – 5-НТ, (10 мкМ) и лиганды серотониновых рецепторов: агонист 5-НТ рецепторов – 5-СТ с высокой аффинностью к 5-НТ_5A рецептору (1 и 10 мкМ); высокоселективный антагонист 5-НТ_5A рецепторов – SВ699551 (3-cyclopentyl-N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-[(4’-{[(2-phenylethyl)amino]methyl}-4-biphenylyl)methyl]propanamide dihydrochloride), (10 мкМ); антагонист 5-НТ_1,2 рецепторов – метисергидмалеат (МS) [8β(S)]-9,10-Didehydro-N-[1-(hydroxymethyl)propyl]-1,6-di- methylergoline-8-carboxamide maleate, (10 мкМ).

D-AP5 и CNQX получены от фирмы RBI (США); бикукуллин метахлорид – от фирмы Tocris bioscience (Великобритания).

Анализ параметров потенциалов проводили с помощью компьютерных программ пакета POTENTL и программы Сlampfit 8.2 пакета Pclamp 8.2 Axon instruments. Компьютерный анализ мПСП осуществляли с помощью программы Pick6, являющейся модифицированной программой Анкри [22], дополненной блоком селекции потенциалов по заданным амплитудным и временным характеристикам. Статистический анализ и графические построения выполняли с помощью пакета программ Sigma Plot 2.0 и 12.0. Результаты представлены в виде m ± SD или m ± SE. Значимость действия лигандов выявляли с помощью t-критерия Стьюдента, а также с помощью оценки распределений по Колмогорову–Смирнову.

Иммуногистохимия

Для иммуногистохимического изучения серотониновой иннервации в экспериментальной камере подготавливали не только отдельные сегменты, но и весь препарат изолированного спинного мозга с продолговатым мозгом. Маркирование мотонейронов осуществляли двумя способами: ретроградным и антероградным. Ретроградное маркирование мотонейронов дало возможность выявлять моторные ядра и области распространения дендритов мотонейронов, чтобы в них проследить распределение серотониновых терминальных ветвлений. При ретроградном способе маркеры апплицировали через всасывающий электрод на филаменты вентральных корешков вырезанного поясничного сегмента или одного из сегментов полного препарата изолированного спинного мозга: декстран, конъюгированный с флуоресцирующим родамином (DRh) (Dextran Rhodamine Green, 3000 MW, Invitrogen, Molecular Probes, США), биоцитин (В) (Biocytin, SIGMA, США) или нейробиотин (NB), (Neurobiotin, Vector Labs, Burlingame, CA, США) в концентрации 1–5% в физиологическом растворе. Биоцитин и нейробиотин апплицировали с подачей чередующихся депо- и гиперполяризующих толчков тока через всасывающий электрод. Время аппликации маркеров на вентральный корешок в камере с протоком физиологического раствора составляло от 2-х до 4-х ч.

При антероградном мечении мотонейронов маркер, биоцитин или нейробиотин 3–10% в 2М КСl, инъецировали в мотонейроны с помощью внутриклеточных микроэлектородов с диаметром кончика около 1 мкм. Мечение мотонейронов проводили после антидромной идентификации мотонейронов. Инъекция маркера осуществлялась подачей депополяризующих толчков тока силой 3–5 нА, длительностью 60 мс с частотой 10 Гц или 600 мс с частотой 1 Гц в течение 10–20 мин.

Для дальнейшего транспорта маркера в дистальные отделы дендритного дерева мотонейронов мозг, погруженный в аэрированный физиологический раствор, помещали на ночь в холодильник (+4 °C), после чего сутки фиксировали в растворе параформальдегида 4% на 0.1 М фосфатном буфере рН 7.4, затем последовательно погружали в 20%, затем 30% раствор сахарозы в 0.1 М фосфатном буфере на 1–3 дня для криопротекции ткани. В изопентане, охлажденном жидким азотом, блоки продолговатого мозга и спинного замораживали. Фронтальные, сагиттальные и горизонтальные срезы толщиной 14–50 мкм, готовили на криостате или на замораживающем микротоме. Реакции проводили либо на тонких (толщиной 14–20 мкм) серийных срезах, смонтированных на стеклах (Superfrost® Plus, Menzel), либо на свободноплавающих (толщиной 40–50 мкм), в отдельных случаях также серийных, для изучения распространения ветвей дендритного дерева мотонейронов. В качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела против серотонина (5-НТ) (Immunostar, cat# 20080, США) в разведении 1:20000 и против 5-НТ_5AR (Immunostar, cat# 24429, США) в разведении 1:200/400 в течение 48 часов при t +4 °C. В части опытов без мечения мотонейронов для картирования в срезе клеточных элементов в раствор с антителом к 5-НТ добавляли мышиное моноклональное антитело к кальций-связывающему белку, парвальбумину (PV), (Sigma, cat# P3088, США) в разведении 1:1000. В контрольной процедуре без введения первичных антител (негативный контроль) проверяли их специфичность. Вторичные козьи антитела против Ig кролика, конъюгированные с Alexa Fluor 568 (Invitrogen, cat# A-11036, США), применяли для выявления 5-НТ, 5-НТ_5AR, для выявления PV – козьи антитела против Ig мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (Invitrogen, cat# A-11029, США). Нейробиотин и биоцитин меченых внутриклеточно мотонейронов выявляли для флуоресцентной микроскопии реактивом Alexa- Fluor 488, конъюгированным со стрептавидином (Invitrogen, Molecular Probes, США) или для изучения в световом микроскопе с авидин-биотин-пероксидазным комплексом (ABC; Vector) и реакцией Ni-DAB [23].

После завершения процедур выявления и промывки свободноплавающие срезы монтировали на стекла, заключали в нефлуоресцирующую среду мовиоль (Mowiol, Calbiochem) или в энтелан под покровное стекло. Классические гистологические методы окрашивания по Нисслю и импрегнации препаратов по Быстрому методу Гольджи [24] применяли для получения общих морфологических характеристик срезов и выявления глиальных элементов (2 животных). Изучение препаратов проводили на микроскопе фирмы Zeiss (AxioImager A1, Germany) и конфокальном микроскопе Leica SP5 MF, (Leica Microsystems, Германия). С помощью программного обеспечения AxioVision AC проводили морфометрию структурных элементов в срезах мозга. С помощью программы ImageJ оценивали сравнительную плотность распределения 5-НТ ветвлений. Для этого цветные изображения срезов поясничного утолщения толщиной 40 мкм (по три от трех животных) переводили в черно-белый режим. Выбранную площадку 20×50 мкм помещали на белый фон изображения, а затем устанавливали по разным участкам срезов с разной плотностью реакции. Полученные значения плотности в условных единицах уровня серого усредняли по участкам, строили гистограмму для представления контрастной неоднородности серотониновой иннервации поясничного отдела спинного мозга.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Электрофизиология

Результаты исследования участия 5-HT_5A рецепторов в модуляции миниатюрной глицинергической передачи, (глимТПСП) в поясничных мотонейронах получены в 21 эксперименте на срезах спинного мозга 15 животных обоего пола. Мотонейроны идентифицировали по наличию антидромного потенциала (АПД) при раздражении вентрального корешка. В 6 нейронах в выборках по 5–10 пробегов средние значения АПД составляли 71.7 ± 7.5 мВ, (m ± SD, n = 6) со средними значениями быстрой (fAHP) и медленной следовой гиперполяризации (sAHP) 11.7 ± 3.7 и –2.4 ± 1.7 мВ, соответственно. В остальных мотонейронах анализ характеристик АПД не проводили. Установившийся МПП мотонейронов перед проведением фармакологических тестов составлял от –60 до –80 мВ, в среднем –67.6 ± 6.0 мВ (m ± SD, n = 21).

Исследование модуляции глимТПСП (в суперфузате, содержащем TTx, CNQX, D-AP5 и бикуккулин) проводили в 4-х сериях экспериментов I, II, III, IV (табл. 1): с вариацией концентрации для сопоставления эффектов 5-СТ: 10 мкМ – серии I и II, 1 мкМ – серия IV; с предварительным, до аппликации 5-СТ, введением в раствор антагониста 5-НТ_1,2 рецепторов – 10 мкМ метисергид малеата (МS) – серия II; с аппликацией селективного антагониста 5-HT_5A рецепторов, 10 мкМ SВ699551-А, после добавления в перфузат 10 мкМ 5-HT и антагониста 5-НТ_1,2 рецепторов – 10 мкМ метисергида (МS) – серия III; с аппликацией 1мкМ 5-СТ и последующей аппликации 10мкМ SВ699551, селективного антагониста 5-HT_5A рецепторов, – серия IV.

 

Таблица 1. Серии экспериментов (I, II, III, IV) изучения действия лигандов серотониновых рецепторов, 5-СТ и SВ-699551, на глимТПСП поясничных мотонейронов (n = 21) в срезах изолированного спинного мозга лягушки. Звездочкой обозначаются компоненты суперфузирующего раствора, а числами – концентрация лигандов

Серии экспериментов с числом мотонейронов	Состав раствора
	TTx, CNQX, D-AP5, bicuculline	TTx, CNQX, D-AP5, MS, bicuculline	TTx, CNQX, D-AP5, 5-HT, MS bicuculline	Агонист 5-НТ R	Антагонист 5-НТ5AR
				5-СТ (мкМ)	SB-699551 (мкМ)
I – 6 клеток	*			10
II – 5 клеток		*		10
III – 3 клетки			*		10
IV – 7 клеток	*			1	10

 

Выделенная фракция миниатюрной глициновой активности 13 мотонейронов в сериях экспериментов I и IV представляет собой колебания мембранного потенциала, амплитудой от 80 до 1500 мкВ, в среднем, 117.0 ± 45.5 мкВ (m ± SD, n = 13) и частотой событий от 1.0 до 16.8 с^-1, в среднем 4.6 ± 4.4 с^-1 (m ± SD, n = 13) со следующими значениями характеристик глимТПСП (m ± SD, n = 21): время нарастания (RT) 1.5 ± 0.2 мс, полуширина (HW) 7.6 ± 1.8 мс; время спада (DT) 8.0 ± 1.6 мс, (m ± SD, n = 13). Класс высокоамплитудных миниатюрных потенциалов со средним значением амплитуды 216,9 ± 38.1 мкВ в этой выборке был немногочислен, частота событий составляла в среднем 0.1 ± 0.06 с^-1.

В серии I определяли действие 10 мкМ 5-СТ на глимТПСП шести поясничных мотонейронов. Средние значения характеристик миниатюрной глициновой активности мотонейронов не отличались от приведенных выше данных двух серий. Действие раствора, содержащего 10 мкм 5-СТ, уже в течение 5–10 мин приводило к подавлению глимТПСП с сокращением частоты событий в среднем на 85.7 ± 5.5% (m ± SE, n = 6) (рис. 1а). Через 30 мин продолжения подачи раствора с агонистом наблюдали полное исчезновение высокоамплитудных миниатюрных потенциалов. (рис. 1b, c).

 

Рис. 1. Параметры глимТПСП мотонейрона, частоты и амплитуды, при аппликации 10 мкМ 5-СТ (экспериментальная серия I); (а) – примеры регистрации (полные записи из 300 пробегов) общей спонтанной активности (сПСП), выделенной фракции миниатюрных глициновых тормозных постсинаптических потенциалов (глимТПСП) и глимТПСП через 10 мин аппликации 5-СТ, агониста 5-HT рецепторов, (10 мкМ) в поясничном мотонейроне спинного мозга лягушки; (b) – фрагменты (4 сек) записей активностей мотонейрона: сПСП, глим ТПСП, их подавления через 20 и 30 минут аппликации 5-СТ и восстановление спонтанной активности с появлением высокоамплитудных событий (более 1 мВ) через 20 мин после смены экспериментального раствора на нормальный состав; (c) – гистограмма уменьшения числа и амплитуды глимТПСП в мотонейроне при действии 5-СТ (10 мкМ) (красные столбики) по сравнению с контролем (белые столбики).

 

Последующий отмыв тестового раствора раствором нормального физиологического состава через 15–20 минут привел к появлению редких спонтанных постсинаптических потенциалов амплитудой более 1 мВ.

В следующей серии II экспериментов исследовали возможность участия рецепторов семейства 5-HT₁ при действии 5-СТ. После предварительной аппликации 10 мкМ метисергид малеата (МS), смешанного блокатора серотониновых рецепторов 5-HT₁ и 5-HT₂, аппликация 10 мкМ 5-СТ также приводила к существенному подавлению глимТПСП (рис. 2).

 

Рис. 2. Действие 5-СТ (10 мкМ) на глимТПСП при дополнительном введении в суперфузирующий раствор антагониста 5-HT1,2 рецепторов метисергида (MS) (10 мкМ) (экспериментальная cерия II). (а) – регистрации глимТПСП в одном из пяти мотонейронов. В растворе с 5-СТ наблюдается уменьшение числа глимТПСП, которые блокируются при последующем введении в раствор стрихнина (Str). Отмыв препарата раствором нормального состава приводит к появлению спонтанной синаптической активности мотонейрона. (b) – распределение вероятностей встречаемости различных интервалов частоты и амплитуды глимТПСП мотонейрона до- (Контроль-черная линия) и при действии 5-СТ (10 мкМ) (красная линия) в условиях присутствия метисергида в суперфузирующем растворе. (c) – сравнение действия 5-СТ (10 мкМ) в экспериментах без присутствия в растворе метисергида и с метисергидом показывает достоверное различие в подавлении частоты глимТПСП в поясничных мотонейронах (р < 0.05, непарный критерий t – Стьюдента).

 

Среднее значение снижения частоты событий в пяти мотонейронах этой серии составляло – 66.8 ± 4.2% (m ± SE). Редкие высокоамплитудные глимТПСП со средней амплитудой 240.0 ± 31.3 (m ± SD, n = 5) и частотой событий 0.1 ± 0.86 с^-1, при действии 5-СТ оставались в незначительном числе, средняя частота событий уменьшалась до 0.02 с^-1, средняя амплитуда уменьшалась на 20%, 191.0 ± 38.0 (m ± SD, n = 5). Добавление в суперфузирующий раствор стрихнина 1 мкМ, блокатора глицинергической синаптической передачи, приводило к их исчезновению уже через 5 мин протока. Последующая смена раствора, содержащего блокатор передачи импульсов, 4 блокатора ионных каналов и лиганды серотониновых метаботропных рецепторов, на раствор нормального состава приводила к появлению спонтанных постсинаптических потенциалов мотонейронов.

В экспериментах серии III наблюдали влияние селективного антагониста 5-НТ_5AR – SВ699551 10 мкМ на глимТПСП с предварительной аппликацией 10 мкМ 5-НТ и 10 мкМ MS (табл. 1, рис. 3). Этот протокол был выбран для оценки возможного возвращения синаптической активности после действия 5-НТ на глимТПСП при заблокированных рецепторах 5-HT₁ \ 5-HT₂ антагонистом MS.

 

Рис. 3. Действие SВ‑699551, антагониста 5-HT5A рецепторов, на глимТПСП мотонейрона при суперфузии раствором без 5-СТ, содержащим 5-НТ (10 мкМ) и метисергид (экспериментальная cерия III). (а) – фрагменты регистраций в мотонейроне: 1, 2 – бурной спонтанной глициновой активности; 3, 4 – глимТПСП после добавления в раствор ТТх – контроль; 5–8 – глимТПСП при действии аппликации SВ‑699551 – в первые 5 мин и через 15 мин. (b) – распределения вероятностей встречаемости различных интервалов частоты и амплитуды глимТПСП в контроле (черная линия) и через 5 мин действия антагониста SВ‑699551 (красная линия).

 

В первые минуты суперфузии раствором с селективным антагонистом 5-HT_5A рецепторов 10 мкМ SВ-699551 регистрировали его значительное подавляющее действие на частоту глимТПСП: –85.3 ± 7.8% (m ± SE, n = 3), с заметным уменьшением числа высокоамплитудных событий в одном мотонейроне от 0.38 с^-1 до 0.02 с^-1 и их исчезновением в двух других. При дальнейшей суперфузии этим раствором отрицательная модуляция сменялась положительной, что видно на регистрациях миниатюрной активности мотонейрона через 15 мин (рис. 3а, регистрации 7 и 8).

В семи экспериментах серии IV, без предварительной аппликации MS, как и в серии I, вводили 5-СТ, но в концентрации на порядок меньшей – 1 мкМ. По сравнению с результатом экспериментов серии I, это приводило к меньшему снижению частоты событий глимТПСП (–48.6 + 8.0%, m + SE) (рис. 4).

 

Рис. 4. Действие 5-СТ и введенного в раствор антагониста 5-HT5A рецепторов SВ‑699551на глимТПСП (экспериментальная cерия IV). (а) – 5-СТ в малой концентрации (1мкМ) также подавляет частоту глимТПСП с незначительным влиянием на амплитуду глимТПСП, а антагонист 5-HT5A рецепторов восстанавливает тормозную активность (две нижние записи глимТПСП). (b) – распределение вероятностей встречаемости различных интервалов частоты и амплитуды глимТПСП в контроле (черная линия) и через 10 мин введения в раствор 5-СТ гистограмма (красная линия). (c) – снижение частоты глимТПСП при действии агониста серотониновых рецепторов 5-СТ в концентрациях 10 и 1 мкМ (n = 6 и 7 соответственно) с достоверным различием эффектов (р < 0.05, непарный критерий t–Стьюдента).

 

Высокоамплитудные события присутствовали во всех 7 случаях, что видно на записи регистраций глимТПСП и отражено на графике накопленных вероятностей частоты и амплитуды событий. При последующей аппликации в раствор антагониста 5-HT_5A рецепторов SВ-699551 в пяти экспериментах частота глимТПСП вырастала (от 10 до 112%) относительно значений уменьшенной частоты глимТПСП под действием 5-СТ (рис. 4а, 5) Действие антагониста 5-HT_5A рецепторов SВ-699551, увеличивающее частоту глимТПСП мотонейронов в этой серии экспериментов, в среднем составило 41.0 + 16.4 (m ± SE).

 

Рис. 5. Гистограммы, представляющие действие лигандов серотониновых рецепторов на частоту или мТПСП (Контроль 1) семи мотонейронов. Агонист 5-HTрецепторов 5-СТ в концентрации (1 мкМ) уменьшает частоту в среднем на –48.6 + 8.0% (Контроль 2), антагонист 5-HT5A рецепторов SВ‑699551 восстанавливает частоту событий в среднем на 41.0 + 16.4% (m + SE).

 

Иммуногистохимия

Результаты иммуногистохимического исследования серотониновой иннервации в спинном мозге лягушки получены на 16 животных обоего пола. С помощью иммунофлуоресцентного метода выявлены серотониниммунореактивные нейроны озерной лягушки: 5-НТ+ ir супраспинальные нейроны ядра шва продолговатого мозга и интраспинальные 5-НТ+ ir нейроны спинного мозга (ISN). На горизонтальных срезах дна ромбовидной ямки продолговатого мозга вдоль медиальной линии видны 2 ряда мелких 5-НТ+ ir нейронов (рис. 6а, b). Они окружены многочисленными 5-НТ+ ir терминальными ветвлениями. Латеральнее располагаются крупные нейроны гигантоклеточного ретикулярного ядра, имеющие PV+ir и 5-НТ ^–ir (рис. 6a, c). Все 5-НТ+ ir структуры в продолговатом мозгу были также PV ^– ir.

 

Рис. 6. Серотониниммунореактивные (5-НТ+ ir) нейроны в продолговатом и спинном мозге лягушки Rana ridibunda: (а – c) – три горизонтальных среза продолговатого мозга с двойным иммуномечением к 5-НТ (красный) и к PV (зеленый), представляющие расположение и сравнительные размеры 5-НТ+ ir нейронов и нейронов ретикулярного ядра парвальбуминиммунореактивных (PV+ir) без иммунореактивности к серотонину (5-НТ – ir); (d) – схема-пример расположения интраспинальных серотониновых нейронов (ISN) в одном из горизонтальных срезов грудного отдела спинного мозга (горизонтальный план); (e) – сагиттальный срез грудного отдела спинного мозга с цепочкой часто повторяющихся ISN; (f)– гистограмма среднего диаметра сом ISN в грудных и поясничных сегментах; (g) – вентромедиальный участок фронтального среза поясничного сегмента с ISN, имеющим ветвящиеся дорсальный и вентральный дендриты. Множество 5-НТ+ir терминалей окружают нейрон. Как и супраспинальные серотониновые нейроны, ISN не имеет сигнала иммунореактивности к PV (PV- ir); (h) – расположение ISN в сагиттальном срезе поясничного утолщения (2 стрелки указывают на тела ISN); (i) – изображение одного из ISN (жирная стрелка на риc. 6h) с хорошо различимыми крупным ядром и ядрышком; (j) – расположения двух ISN в сагиттальном срезе поясничного утолщения и фрагменты идущих рядом дендритов мотонейрона, меченого биоцитином (зеленый цвет). Стрелками отмечены возможные контакты 5-НТ+ir терминалей с дендритами мотонейрона; (k, l) – расположения нескольких ISN на фронтальных срезах поясничного сегмента толщиной 14 и 40 мкм: по одному нейрону в половинах мозга или по два в одной и третьим в другой половине (сс – canalis centralis). Масштаб: (а), (d), (e), (h) – 200 мкм; (b), (c) – 100 мкм; (j), (k), (l) – 40 мкм; (i) – 30 мкм; (g) – 20 мкм.

 

Интраспинальные серотониновые нейроны (ISN) обнаружены в вентромедиальной области серого вещества спинного мозга (рис. 6d – l). Они расположены вентральнее центрального канала на 100–200 мкм и латерально от медиальной линии на 50–200 мкм. Число ISN в рострокаудальном направлении мозга вариирует. В цервикальном сегменте III – единичные нейроны, в сегментах грудного отдела (IV -VII сегменты) они встречаются часто, в 1 мм протяжённости мозга в рострокаудальном направлении до сотни. Они располагаются в горизонтальном срезе мозга в виде 2х цепочек по обе стороны медиальной линии мозга без строгой симметрии (рис. 6d). Зачастую можно видеть тесно расположенные несколько клеток, есть удаленные друг от друга до 100 мкм.

В поясничном утолщении на 1 мм длины сегментов их насчитывается меньше, от 10 до 30 (рис. 6h). Как и супраспинальные 5-НТ+ ir нейроны ядер шва, ISN не имеют положительного сигнала парвальбумина (PV– ir) (рис. 6g). Это мелкие округлые клетки, средний диаметр сомы которых составляет 18.2 + 3.07мкм (n = 90) (рис. 6f). Крупное ядро с хорошо различимым ядрышком занимает большую часть сомы ISN (рис. 6i). На тонких поперечных срезах мозга толщиной 14 мкм видны иногда 1–2 дендрита. На срезах мозга разной ориентации толщиной 40–50 мкм, можно видеть их мультиполярными с 4–5 первичными дендритами, отходящими от сомы в разных направлениях и делящихся на ветви высших порядков (рис. 6j, k). Идентифицировать аксон с его терминальными разветвлениями было затруднительно или не представлялось возможным. Следует отметить, что сома и проксимальные дендриты ISN окружены многочисленными 5-НТ+ ir волокнами и утолщениями (рис. 6g, j, k).

Серотониновые терминальные ветвления обильно пронизывают спинной мозг (рис. 7).

 

Рис. 7. Распределение серотониниммунореактивных элементов в поясничных сегментах и возможные контакты 5-НТ+ir терминалей с мотонейронами, меченными внутриклеточно инъекцией нейробиотина или аппликацией маркеров на вентральный корешок: (а) – фронтальный срез поясничного сегмента IХ, окрашенный по Нисслю, для сравнительной ориентации участков срезов с 5-НТ иммунореакцией (b); (b) – фронтальный срез Х поясничного сегмента с5-НТ+ir; (c) – гистограмма интенсивностей (в условных единицах от 0 до 2.0) сигнала 5-НТ+ir участков (1–8) поясничного утолщения спинного мозга: 1– перимедуллярное сплетение (маргинальный плексус); 2 – латеральный канатик; 3 – вентральная комиссура; 4 – дорсальный рог; 5 – интермедиальная зона; 6 – моторное ядро; 7 – область входа дорсальнокорешковых волокон; 8 – вентромедиальный канатик; (d) – изображение фрагмента поясничного сегмента IХ с мотонейронами, меченными внутриклеточной инъекцией нейробиотина и последующим выявлением DAB реакцией. Реконструкция по двум фронтальным серийным срезам. Слева видна сома мотонейрона с проксимальными и дистальными участками его дендритного дерева. Справа от медиальной линии видны дендриты мотонейрона, меченного внутриклеточно в правой половине мозга. Тончайшие дистальные дендриты мотонейрона слева ветвятся в перимедулярном плексусе (область 1 на гистограмме рис. 7c). В вентральной комиссуре (область 3 – на гистограмме), где располагаются ISN, простираются дендриты мотонейронов, регистрируемых в обеих половинах спинного мозга; (e) – редкие 5-НТ+ir терминальные ветвления в моторном ядре фронтального тонкого среза мозга поясничного сегмента; (f) – 5-НТ+ir ветвления в моторном ядре на фронтальном срезе мозга толщиной 40 мкм другого препарата. Их возможные контакты видны на теле мотонейрона, меченого ретроградно декстран-родомином; (g – j) – участки сагиттальных срезов поясничного утолщения с возможными контактами 5-НТ+ir терминальных ветвлений на телах меченых биоцитином мотонейронов (g), проксимальных дендритах (h), дендритах высших порядков (i). Область наивысшей интенсивности 5-НТ+ir, перимедулярный плексус (j), пронизана тонкими дистальными дендритами многих мотонейронов, где предполагается высокая вероятность контактов с серотониниммунореактивными синаптическими бутонами. Масштаб: (а), (b) – 500 мкм; (d) – 200 мкм; (g) – 100 мкм; (e), (h – j) – 50 мкм; (f) – 20 мкм.

 

На фронтальных срезах поясничного отдела легко выделяются области с превалирующей серотониновой иннервацией: в перимедулярном сплетении и в области вентральной комиссуры (рис. 7b, c). На препаратах с поясничными мотонейронами, выявленными внутриклеточной инъекцией нейробиотина и реакцией Ni-DAB, прослеживаются тонкие дистальные дендриты мотонейронов в этих областях (рис. 7d). На препаратах с двойным флуоресцентным иммуномечением 5-НТ+ ir ветвлений и маркированных мотонейронов видно распределение серотониновых терминалей в моторном ядре вдоль профилей сом (рис. 7е, f). На сомах и проксимальных дендритах мотонейронов 5-НТ+ ir бутоны встречаются с разной частотой (рис. 7e – h). Отмечаются возможные контакты серотониновых волокон с вентромедиальными дендритами (рис. 7i), направленными к центральному каналу, реже с дендритами, идущими в латеральном канатике. Обнаружено, что контакты утолщений серотониновых волокон с мотонейронами возможны с высокой степенью вероятности в области перимедулярного плексуса, самой богатой области ветвления серотониновых окончаний. Сюда вступают, идут вдоль поверхности мозга, извиваясь и переплетаясь, тончайшие дистальные дендриты мотонейронов (рис. 7j).

Так как у низших позвоночных животных документирована экспрессия 5-HT_5AR [21, 25, 26], а присутствие 5-НТ_5AR в спинальных мотонейронах показано у крыс, мышей [6, 7], мы применили кроличье поликлональное антитело 5-НТ_5AR в экспериментах с двойным флуоресцентным иммуномечением на препаратах с моноклональным антителом к кальцийсвязывающему белку парвальбумину (PV) и с ретро- или антероградно маркированными мотонейронами. Это пробное применение поликлонального антитела для 5-НТ_5AR без предварительной расшифровки аминокислотной последовательности протеина у озерной лягушки, без использования животных с нокаутом гена 5-НТ_5AR. Сигнал флуоресценции в срезах мозга лягушки будет обозначен как положительный 5-НТ_5ARlike+ сигнал.

На фронтальных срезах поясничного утолщения с двойным иммуномечением, к 5-НТ_5AR и PV, сигнал5-НТ_5ARlike+ обнаружен в срезах с большей яркостью в белом веществе. Заметная флуоресценция видна в миелине волокон, идущих в белом веществе дорсальных и вентральных канатиков (рис. 8).

 

Рис. 8. Обнаружение 5-НТ5ARlike+ сигнала иммунореактивности в поясничном утолщении спинного мозга лягушки (области срезов представлены на схемах): (а) – область входа волокон дорсального корешка в спинной мозг, где мало терминалей с 5-НТ+ ir, но видны отчетливые профили PV+ ir афферентных волокон (зеленый цвет) и повышенная интенсивность 5-НТ5ARlike+ сигнала (красный). Стрелки указывают на сечение аксоплазмы одного из крупных афферентов с PV+ ir (зеленый цвет), на сечение его миелиновой оболочки в виде кольца (красное) и на колокализацию двух изображений со вставкой увеличенного изображения профиля аксона; (b, c) – композиции изображений медиальной области дорсального канатика (b) и медиальной области вентрального канатика (c) также представляют присутствие 5-НТ5ARlike+ сигнала в миелине волокон с PV+ ir (указано стрелками). Масштаб – 50 мкм.

 

Совмещенное изображение 2х сигналов иммунореактивностей четко представляет PV + ir аксоплазму волокон, окруженную кольцами миелина с ярким 5-НТ_5ARlike+сигналом.

На меченных биоцитином телах мотонейронов выявлен положительный 5-НТ_5ARlike+ сигнал в виде точек (рис. 9а – c).

 

Рис. 9. Ретроградно меченые биоцитином мотонейроны поясничных сегментов и 5-НТ5ARlike+ иммунореактивность на фронтальных срезах поясничного сегмента Х: (а) – фронтальный срез мозга при малом увеличении объектива с двумя сигналами флуоресценции: меченного биоцитином мотонейрона (зеленый) и 5-НТ5ARlike+ сигнала (красный) в нейропиле. Яркий контрастный 5-НТ5ARlike+ сигнал (стрелки) виден в виде колец в медиальном канатике, в виде пятен, колец, полосок – в области входа афферентных волокон в дорсальный рог, в вентральном канатике по ходу моторных аксонов; (b) – раздельные изображения участка с флуоресцирующим маркированным мотонейроном и 5-НТ5ARlike+ флуоресценцией; (c) – на совмещенном изображении видно присутствие 5-НТ5ARlike+ сигнала в виде зерен на соме и первичном вентральном дендрите мотонейрона (стрелка), в вентральной части серого вещества с яркой полоской миелиновой оболочки аксона мотонейрона; (d – i) – композиция изображений другого среза с выделенной областью (g, h, i) дорсально направленных дендритов меченого мотонейрона. На совмещенном изображении (g) можно видеть 5-НТ5ARlike+ сигнал в виде зерен на тонких дендритах мотонейрона (стрелки). В перимедулярном сплетении 5-НТ5ARlike+ сигнал отсутствует (f - малые стрелочки). Масштаб: (а), (d), (e), (f) – 100 мкм; (b), (c), (g), (h), (i) – 50 мкм.

 

На дорсально направленных дендритах мотонейронов также можно различить в виде точек или зерен 5-НТ_5ARlike+ сигналы (рис. 9g, h, i), которые присутствуют и в нейропиле. Яркие, контрастные 5-НТ_5ARlike+ сигналы обнаружены после ретроградного мечения мотонейронов биоцитином с длительной антидромной стимуляцией вентрального корешка во время аппликации. Они отмечены стрелками на рис. 9a, d. Яркий сигнал виден в вентральном канатике в миелиновых оболочках аксонов мотонейронов на всем пути до их выхода из мозга. Кроме того, в отдельных волокнах медиального канатика заметно выделяются миелиновые колечки с красным 5-НТ_5ARlike+ сигналом.

Неожиданно яркая флуоресценция видна в дорсальном роге в области входа афферентов в мозг, сходная по яркости с таковой миелина моторных аксонов (рис. 9а, d, f). Ширина светящихся полос, пятен миелина с 5-НТ_5ARlike+ сигналом в дорсальном роге, (плоскость среза совпадает с траекторией входящих афферентов) достигает 10–15 мкм, что соответствует диаметру крупных дорсальнокорешковых волокон, входящих в спинной мозг лягушки.

Не обнаружено структур, имеющих 5-НТ_5ARlike+ сигнал, с характерной формой астроцитов, детально описанных ранее в спинном мозге бесхвостых амфибий, [27, 28] и выявленных нами на гистологических препаратах с серебрением спинного мозга Rana ridibunda. Нет положительной 5-НТ_5ARlike+ флуоресценции в богатом астроцитарными отростками перимедулярном сплетении (рис. 9f), хотя в этой области нами показаны многочисленные переплетения дистальных дендритов меченых мотонейронов и самая высокая плотность 5-НТ+ ir терминальных ветвлений серотониновых волокон. (рис. 7b, c, j).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Электрофизиологические эксперименты

Рецептор 5-HT_5A, для которого пока не существует селективных агонистов, остается наименее изученным рецептором серотонина [29, 30]. Данные нашего комбинированного исследования присутствия и функции 5-HT_5A рецепторов в спинном мозге бесхвостых амфибий получены впервые, можно сделать выводы об их эволюционном значении.

Мы применили лиганды серотониновых рецепторов, 5-СТ для активации 5-HT_5AR и для их блокирования -SB-69955. 5-СТ – известный агонист серотониновых рецепторов, который несмотря на то, что он имеет аффинность к другим типам 5-НТ рецепторов, и в настоящее время успешно служит инструментом для расшифровки структуры 5-HT_5AR [30]. SB-699551, коммерческий антагонист 5-HT_5AR широко используется для исследования его функции при многих неврологических расстройствах, включая боль [11, 14–16].

В нашей работе электрофизиологические эксперименты c фармакологическими тестами в серии I в первые 5 минут аппликации 10 мкМ агониста 5-СТ в суперфузирующий раствор показали быстрое уменьшение частоты глимТПСП поясничных мотонейронов и через 20–30 минут полное исчезновение высокоамплитудных миниатюрных потенциалов, свидетельствующее о действии агониста на пре- и постсинаптические 5-HT_5A рецепторы. По литературным данным у крыс 5-HT_5A рецепторы присутствуют в дорсальном роге и в мотонейронах спинного мозга [6, 7], но столь быстрый и значительный эффект агониста возможно вызван кооперативным действием 5-СТ на другие 5-НТ рецепторы. 5-СТ проявляет разную селективность для Gi/o-связанных серотониновых рецепторов: высока аффинность к 5-HT_1A, 5-HT_1B и 5-HT_1D (pKi = 7.9–8.1) и относительно слабая к 5-HT_1E, 5-HT_1F, а также к 5-HT_5A (pKi = 5.4–7.0) [30]. В работе Калининой с соавт. показано подавляющее пресинаптическое действие 5-HT1_B/D рецепторов на глим ТПСП поясничных мотонейронов спинного мозга лягушки [31]. На основании результатов этого исследования были проведены исследования с блокированием этих рецепторов.

Вторая серия (II) экспериментов с предварительным введением в раствор метисергида, смешанного антагониста 5-HT_1,2 рецепторов, и последующей аппликации такой же концентрации 5-СТ дала не столь мощное подавление частоты глимТПСП по сравнению с результатом первой серии (86% и 67%). Значительное подавление частоты высокоамплитудных событий отмечалось вновь, в 5 раз по сравнению с контрольным значением, а уменьшением их амплитуды, в среднем на 20%.

Сравнение действия агониста серотониновых рецепторов 5-СТ в экспериментах серий I (без метисергида в растворе) и II (с метисергидом) на частоту событий показало статистически значимое различие средних величин при блокировании 5-НТ₁, что может являться свидетельством пресинаптического механизма подавления глимТПСП поясничных мотонейронов именно 5-HT_5A рецепторами (рис. 2в). Относительно исчезновения высокоамплитудных глимТПСП или уменьшения их амплитуды можно предположить участие постсинаптических 5-HT_5A рецепторов.

Аппликацию высокоселективного антагониста 5-HT_5A рецептора, SB-699551, мы проводили для предварительной проверки возможности его применения в экспериментах, так как при разработке химического зонда для исследования функции 5-HT_5A рецептора при неврологических расстройствах, включающих боль, Капланом с сотрудниками были отмечены существенные сложности молекулы SB-699551 [29]. В наших трех опытах без введения в раствор 5-СТ вектор действия SB-699551 (10 мкМ) на глимТПСП поясничных мотонейронов, регистрируемых в растворе с 5-НТ, был время зависимым (серия III): в первые 5 минут после аппликации антагониста наблюдали резкое сокращение числа событий, но через 15–20 минут предполагаемая для него функция блокирования подавляющего действия 5-HT_5A рецепторов на глимТПСП мотонейронов появлялась. Обнаруженные нами, а также Калининой и Веселкиным [32] свидетельства физиологической (функциональной) активности применяемого антагониста 5-HT_5A рецептора в препарате спинного мозга лягушки подтвердили возможность его использования в следующей серии экспериментов (IV). На порядок уменьшение концентрации 5-СТ в серии IV по сравнению с концентрацией агониста в серии I привело к меньшему подавлению частоты глимТПСП (85.7 + 5.5% и –48.6 + 8.0%) и без значимого изменения их средней амплитуды. Последующая аппликация в раствор антагониста 5-HT_5AR, SB-69955, увеличивала частоту глимТПСП в среднем на 41.0 +/- 16.4%, что также может указывать на участие пресинаптических 5-HT_5AR в торможении глимТПСП.

Таким образом, эксперименты с 10 мкМ 5-СТ в растворе свидетельствуют о пре- и постсинаптическом участии 5-HT_5AR в подавлении глимТПСП мотонейронов, а меньшая концентрация агониста с последующим введением антагониста SB-69955 о пресинаптическом участии 5-HT_5AR в модуляции глициновых миниатюрных событий.

Обсуждения требует временная зависимость действия лигандов на глимТПСП. Уже в первые минуты суперфузии срезов мозга раствором с 10 мкМ агониста или антагониста 5-HT_5AR регистрируются эффекты. Наблюдаемые эффекты одной направленности. Если действие агониста сразу оказывается подавляющим глимТПСП, что не противоречит предполагаемым механизмам его действия, то также подавляющая функция антагониста в начальный период действия остается тайной. Ранее обнаружена гетерологичная десенсибилизация другого серотонинового рецептора человека, 5-HT₇ [33]. Она вызывается стимуляцией как агонистом, так и антагонистом 5-HT₇R. Подобных сведений для HT_5AR не имеется. Более того, при анализе фармакологических средств и биологических реакций, чувствительных к фармакологическим обратным агонистам/антагонистам некоторые серотониновые рецепторы, 5-HT_5AR в том числе, не рассматривали, так как их молекулярная фармакология in vitro в системе коэкспрессии неясна [34].

Ожидаемые эффекты антагониста HT_5AR появляются позже, через 15–20 минут его аппликации в раствор: увеличение частоты глициновых миниатюрных событий. Относительно быстрого начального действия обоих лигандов на миниатюрную активность мотонейронов можно предположить, что оно возможно осуществляется в поверхностных структурах мозга лягушки – в перимедулярном сплетении. В этой области, где множество обильных дистальных ветвлений дендритного дерева мотонейронов, а по литературным данным имеются и классические синаптические контакты на тончайших дендритах [35], вполне вероятно пре- и постсинаптическое участие 5-HT_5A рецепторов в модуляции глимТПСП мотонейронов. Такое предположение было выдвинуто нами по завершению серий фармакологических тестов и выполнению первых иммуногистохимических экспериментов.

Иммуногистохимия

К настоящему времени накопилось большое число исследований серотониновой иннервации спинного мозга земноводных (Urodella, Anurae). Трейсерные методы, флуоресцентная гистохимия, применение антител к серотонину выявили распределение серотониновой иннервации в спинном мозге Rana catesbiana, R.pipiens, Xenopus laevis [36]. Однако на рисунках-схемах расположения и плотности серотониновых ветвлений в спинном мозге обнаруживаются различия. Места обитания земноводных животных, питание, размножение различны. Это приводит к разнообразным адаптационным приспособлениям особей разных видов, в том числе бесхвостых земноводных. Адаптации связаны с изменениями электрических характеристик нейронов, связей и их модуляций. Проведенное нами флуоресцентное иммуногистохимическое исследование распределения 5-НТ+ir элементов в спинном мозге озерной лягушки выявило картину, отражающую возможное интенсивное 5-НТ влияние на функционирование нервных цепей, составляющих центральные паттерн генераторы (CPG) и на активность мотонейронов.

Нами показаны источники серотонина не только супраспинальные, 5-НТ+ir нейроны ядер шва, но и интраспинальные 5-НТ+ir нейроны (ISN). Их значительное число располагается в торакальных сегментах, меньшее – в поясничном утолщении, как и у иглистого тритона Pleurodeles waltl [37]. На основании распределения ISN в спинном мозге тритона, авторы сделали вывод, что их высокая плотность в торакальном отделе не коррелирует с появлением конечностей, т. е. ISN тритона участвуют в модуляции сокращения туловищных мышц (axial CPGs). По нашим данным у озерной лягушки R. ridibunda на одном срезе области вентральной комиссуры поясничного отдела ISN встречаются по два, имеют разветвленные отростки в вентромедиальной области спинного мозга. Эта область пронизана дендритами и аксонами поясничных мотонейронов, маркированных хлоридом кобальта, пероксидазой хрена, нейробиотином или биоцитином [38–40]. Однако контакты немаркированных ISN с мотонейронами или интернейронами в нашей работе идентифицировать не представлялось возможным.

Схема распределения терминальных полей нервных волокон, содержащих индоламин и выявленных с помощью флуоресцентной иммуногистохимии в поясничном сегменте спинного мозга лягушки R. pipiens, приведена Соллером [41]. Его сравнительная оценка уровня интенсивности флуоресценции представлена в пределах относительных значений 0–4. Мы, используя реактив фирмы Immunostar (anti-5-НТ) и применяя программу ImageJ для анализа и оценки яркости флуоресценции, получили данные о более контрастных её градациях в поясничном отделе спинного мозга R. ridibunda. Например, измерен в 10 раз более яркий сигнал в латеральном перимедулярном сплетении по сравнению с сигналом в вентромедиальном канатике и в 4 раза – с сигналом области моторного ядра (рис. 7b, c). Высоковероятной зоной контактов 5-НТ+ir волокон с поясничными мотонейронами, с их тончайшими дистальными дендритами, может являться перимедулярное сплетение (рис. 7j). Эту область спинного мозга R. esculenta изучал Антал с соавт., реконструировал классические синаптические контакты неидентифицированных терминалей с дендритами меченых мотонейронов по серийным ультратонким срезам [35]. Кроме возможных контактов 5-НТ+ir волокон с дистальными участками в перимедулярном сплетении мозга R. ridibunda 5-НТ+ir утолщения или бутоны видны на телах мотонейронов, проксимальных дендритах и дендритах высших порядков ветвления в латеральном и вентральном канатике (рис. 7). По нашим наблюдениям присутствие утолщений 5-НТ волокон на соматической мембране разных мотонейронов неравномерно: у одних – редкие или почти их нет, другие окружены их цепочками.

Детальные трехмерные реконструкции расположения серотониновых бутонов на идентифицированных мотонейронах шейных мышц кошки были выполнены Монтаж и Маратта [42, 43]. Среднее число 5-НТ контактов на мотонейроне экстензора составляло1586 при общей средней длине дендритов 87 мм (87296 мкм) и площади мембраны мотонейронов 0,5 мм² (529002 мкм²) [42]. Позже Маратта на трехмерных реконструкциях мотонейронов шейной мышцы флексора привел меньшее среднее число 5-НТ контактов – 793 при средней общей длине дендритов 74 мм (74.005мкм), а площади мембраны мотонейронов также около 0.5 мм² (541921 мкм²) [43]. На удаленных участках дендритного дерева мотонейронов мышцы-флексора кошки (от 1500 до 1750 мкм от сомы) рассчитано большее нормализованное число плотности контактов – 1.5 по сравнению с зонами в радиусе до 250 мкм от сомы – 0.93. Наши трехмерные реконструкции меченых пероксидазой хрена и нейробиотином поясничных мотонейронов лягушки показали подобное значение средней длины дендритов 4-х клеток около 82 мм (81750 мкм), а так как значительная доля дендритных деревьев – тончайшие веточки, то площадь поверхностной мембраны, соответственно, в 2.5 раза меньше около 0.2 мм² (0.1972 мм²) [40]. Число и плотность распределения 5-НТ окончаний на мембране мотонейрона лягушки неизвестно. По результатам нашего иммунногистохимического исследования при высокой флуоресценции 5-НТ ветвлений в области перимедулярного плексуса закономерно предполагать высокую вероятность постсинаптического влияния 5-НТ также на дистальных дендритах мотонейронов лягушки. Есть основание предполагать и участие в серотониновой модуляции множества астроцитарных отростков, заполняющих эту область, но никаких данных о 5-НТ рецепторной оснащенности её у амфибий нет.

По литературным данным в сетчатке лягушки показано большое разнообразие различных типов рецепторов серотонина, 5-НТ_5A рецептор в том числе, не только в волокнах, нейронах, фоторецепторах, но и в глии [26]. Многочисленность рецепторов дает авторам основание считать, что сетчатка чрезвычайно чувствительна к серотонину: “создается впечатление, что сетчатка устроена так, чтобы “улавливать” каждую высвободившуюся молекулу серотонина”. Селада с соавт. по результатам многих исследований на млекопитающих представляет различное распределение двух других подтипов 5-НТ рецепторов на пирамидном нейроне медиальной префронтальной коры: апикальные дендриты обогащены рецепторами 5-HT2_A, где они могут способствовать входу AMПA, а на аксонном холмике локализуются рецепторы 5-HT1_A, возможно, вместе с ГАМК_А-рецепторами. [44].

Известно, что применение иммуногисто- и цитохимических методов исследования может давать противоречивые результаты на одном животном, в одних и тех же структурах мозга, в зависимости от используемых антител [45]. Важно также отметить, что после работ 2-х групп исследователей распределения 5-НТ_5A рецепторов в спинном мозге крысы [6, 7], эти методы не применялись на других позвоночных. Вероятно, и данные о незначительном содержании мРНК рецепторов 5-НТ_5A в спинном мозге человека не вдохновляли исследователей на решение задач об участии 5-НТ_5A рецептора в модуляции моторного выхода (НРА-2021). На рыбке тиляпии с использованием транскриптомики продемонстрировано, что можно собирать мРНК высокого качества из одиночных Маутнеровских нейронов [21]. Было показано, что у этого высокосоциального позвоночного с регулируемым преимпульсным торможением в слуховой цепи при реакции испуга и убегания среди подмножества подтипов 5HT рецепторов в латеральном дендрите Маутнеровского нейрона экспрессируется 5-НТ_5A рецептор.

В нашей работе применение кроличьих поликлональных антител против 5-НТ_5AR не показало положительную иммунореактивность в самой богатой зоне 5-НТ иннервации, перимедулярном сплетении спинного мозга лягушки (рис. 9а, d, f). Сомы и дендриты меченых биоцитином мотонейронов, которые можно проследить на срезах, имеют редкую в виде точек или зерен 5-НТ_5ARlike+ флуоресценцию (рис. 9b – c, g), возможный морфологический субстрат для экспрессии 5-НТ_5A рецепторов на мотонейронах лягушки и постсинаптического участия в подавлении глимТПСП. Общая 5-НТ_5ARlike+ зернистость видна в нейропиле серого и белого вещества, как возможное присутствие в глиальных клетках, со значительным превышением плотности сигнала в белом веществе (рис. 9). Обнаруживается четкий сигнал в отдельных миелиновых кольцах PV+ir волокон в дорсальном роге, дорсомедиальном и вентральном канатиках (рис. 8). Полоски и кольца миелина ещё более контрастно и ярко выделяются на препаратах с ретроградным маркированием мотонейронов биоцитином через всасывающий электрод с длительной стимуляцией вентрального корешка. 5-НТ_5ARlike+ миелиновые профили видны не только в вентральном канатике, но и в дорсальном роге, в области входа дорсальнокорешковых афферентов в спинной мозг (рис. 9а, d, f).

Возможно, такой способ маркирования мотонейронов выявил результат их опасной стимуляции, включающей цепь обратной связи через возвратные коллатерали мотонейронов. Возвратные коллатерали в спинном мозгу лягушек были выявлены [46], детально прослежены для их трехмерной реконструкции [44, 47, 48]. По возвратным коллатералям сигналы поступают не только ростро-каудально в моторную колонну, но и дорсально, в интермедиальную область серого вещества спинного мозга. Показано, что у крыс в этой области расположено множество тормозных глицинергических интернейронов [49]. Тормозные интернейроны V1 и V2b основные участники-компоненты СРG, который координирует активность флексор – экстензор мотонейронов [50].

В электронномикроскопическом исследовании синапсов в спинном мозге лягушки Rana temporaria с помощью метода двойной иммунной метки в сочетании с двумя антителами к гамма-аминомасляной кислоте (ГАМК) и глицину показан высокий процент распределения из найденных тормозных синапсов на сомах, дендритах мотонейронов, первичных афферентных аксонах, иммунореактивных к обеим аминокислотам [51]. Экспрессия 5-НТ_5A рецепторов в этих синапсах могла бы являться структурным базисом пресинаптического модулирующего влияния на глимТПСП в поясничных мотонейронах, выявленное нами в фармакологических тестах на срезах-сегментах спинного мозга лягушки.

Присутствие яркого сигнала именно в миелине можно объяснить, обратившись снова к цепям обратной связи активности мотонейронов в спинном мозге. Известно, что по ним не только передаются сигналы о параметрах активности мотонейронов в высшие центры, но и сигналы, вызывающие изменение активности дорсальнокорешковых афферентных волокон в случае опасности или бесполезности совершаемого движения. Модуляция возбудимости может осуществляться через сложный путь аксо-аксональных контактов афферентных волокон [52]. На личинках рыб Danio rerio с помощью кальциевого имиджининга показано критическое участие радиальной астроглии для остановки неэффективного действия и дальнейшего изменения поведения особи [49]. Другие исследования также указывают на то, что глиальные клетки являются ключевыми регуляторами функции нервной цепи, а среди них и миелинизирующая глия в ЦНС, олигодендроциты [53–55]. Суминаите с соавторами приводят схему-таблицу аксональных субдоменов, их возможные модификации и предполагаемые эффекты на физиологию аксона [54]. Олигодендроциты реагируют на активность нейронов, и, в свою очередь, настраивают нейрофизиологическую функцию, изменяя коренным образом проводящие свойства аксонов. Показано, что в нодальной-паранодальной зоне длина перехвата Ранвье и плотность ионных каналов могут меняться при изменениях в миелине. Обобщающие схемы представляют эту область аксона с экспрессией ионных каналов, транспортеров, щелевых контактов, паранодальных и околопаранодальных протеинов, нейрофасцина, контактина и протеина, связанного с контактином (Caspr). Caspr2 точно колокализуется в околопаранодальной области аксона с Shaker-подобными K+ каналами, где специфически связывается с Kv1.1, Kv1.2 и их субъединицей Kvβ2 [56]. Калво с соавт. исследовал состав и распределение калиевых каналов шейкерного типа (каналы Кv1) в пределах перехватов Ранвье миелинизированных аксонов после повреждения [57]. Они показали, что экспрессия в норме каналов Kv1.1 и 1.2, локализованных в околопаранодальном участке, после повреждения была заметно снижена. Напротив, Kv1.4 и 1.6, которые едва обнаруживались в наивном состоянии, демонстрировали повышенную экспрессию в околопаранодальном и паранодальном участках после повреждения как у крыс, так и у людей.

Впервые о регистрации спонтанной синаптической активности первичных афферентов спинного мозга озерной лягушки, ди- и полисинаптически связанных с мотонейронами, было доложено в работах Шаповалова и Ширяева [58, 59]. Но только значительно позже стали уделять внимание этой стороне функционирования аксонов в ЦНС, признавая наряду с цифровой сигнализацией “все или ничего”, аналоговую [60]. Обнаруженный нами яркий сигнал 5-НТ_5ARlike+ в миелине волокон в дорсальном роге, а также в вентральном и медиальном канатиках спинного мозга после длительной стимуляции вентрального корешка мог появиться через сработавшую цепь обратной связи активности мотонейронов. Возможно, в норме рецепторы 5-НТ_5A в олигодендроцитах и миелине в спинном мозге лягушки экспрессированы интернализованными. При функционально опасных сигналах цепей рецепторы 5-НТ_5A миелина принимают активную форму, меняющую мембранные свойства чувствительных волокон в пара- и околопаранодальных областях. В гиппокампе на мышах показано, что парвальбуминовые интернейроны экспрессируют функционально молчащие рецепторы 5-HT5_A, которые транслоцируются на клеточную мембрану и становятся активными при хроническом, но не остром лечении селективным ингибитором обратного захвата серотонина [61]. Таким образом, 5-НТ_5A рецептор активно включается в арсенал фармакологических мишеней. Создается основанный на структуре дизайн набора химических зондов для серотонинового рецептора 5-HT5_A [29].

В нашей работе обнаружена реакция в миелине входящих в спинной мозг дорсальнокорешковых афферентных волокон на опасную вызванную активность мотонейронов появлением яркого 5-НТ_5ARlike+ сигнала. Подобный сигнал-ответ также виден в миелине моторных аксонов, длительно стимулируемых через вентральный корешок, и в миелине отдельных волокон вентромедиального канатика, где локализованы нисходящие вестибуло-спинальные тракты амфибий. Появилась информация о новых подходах исследователей к характеристике и нарушению миелина в контексте управляемых нейронных цепей по мере их созревания на модели личинки Danio rerio [55]. Включение тормозящих сигналов через модуляцию при опасности или при бесполезных попытках совершить действие дает путь к новому поведению животного, подстраиванию к возникшей ситуации [49]. На примере беспозвоночных животных Лиллвис и Катц [62] обсуждают роль нейромодуляции в эволюции механизмов поведения, поскольку она способна обеспечить различные результаты совместного использования компонентов нейронных цепей нейронов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами показана комбинированная вовлеченность изучаемого подтипа серотониновых рецепторов (5-НТ_5A) в подавлении глимТПСП в поясничных мотонейронах на пре-, постсинаптическом уровне. Результаты иммунофлуоресцентного исследования обильной серотониновой иннервации спинного мозга лягушки и обнаружения 5-НТ_5ARlike+ сигнала на соме и дендритах поясничных мотонейронов подтверждают постсинаптическое распределение 5-НТ_5A рецепторов. Обсуждается участие экстрасинаптических рецепторов 5-НТ_5A в функционировании цепей обратной связи активности поясничных мотонейронов, возможно, с глиальными посредниками.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Н.М.Ч. – планирование экспериментов, сбор данных, обработка данных, приготовление графиков, рисунков, написание статьи, Д.С.В. – обсуждение результатов, редактирование статьи, Н.П.В. – идея работы, обсуждение результатов и редактирование статьи.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям Комиссии по биоэтике ИЭФБ РАН (протокол 6–3/2022 от 23 июня 2022 г.).

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена по теме государственного задания НИР 075–00967–23–00.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.

About the authors

N. M. Chmykhova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: nchmykhova@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg

D. S. Vasilev

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: nchmykhova@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg

N. P. Veselkin

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: nchmykhova@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files