Microextraction isolation and concentration of mycotoxins for their determination in food products

Full Text

Микотоксины (от греч. mukes — гриб и toxicon — яд) — это вторичные метаболиты микроскопических плесневых грибов, обладающие выраженными токсическими свойствами. В настоящее время известно множество родов плесневых грибов (Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Claviceps, Neotyphodium, Myrothecium, Stachybotrys, Trichoderma, Trichothecium), продуцирующих более 400 различных видов токсинов, имеющих разнообразную химическую структуру [1]. Микотоксины распространены практически повсеместно, могут встречаться в регионах как с умеренным, так и с тропическим климатом в зависимости от вида выделяющих их грибов. Мишенями для роста грибов и образования на них токсинов чаще всего являются злаки, сухофрукты, орехи, бобы, фрукты, специи и другая продовольственная продукция.

Микотоксины представляют серьезный риск для здоровья человека и животных [1]. В организм человека микотоксины поступают в результате употребления в пищу загрязненных ими пищевых продуктов растительного или животного происхождения, а в организм животных — при использовании для их кормления контаминированных микотоксинами кормов. Поступая в организм, такие токсины вызывают изменение состава микрофлоры в кишечнике, а всасываясь в желудочно-кишечном тракте, оказывают негативное действие на клетки, органы, ткани, физиологическое состояние человека и животных, провоцируют онкологические заболевания и иммунодефицит.

В связи с негативным влиянием микотоксинов на здоровье животных и человека в настоящее время ведется контроль качества пищевого сырья, пищевых продуктов и кормов для выявления данных токсикантов. В Российской Федерации и других странах установлены предельно допустимые концентрации микотоксинов в различных пищевых продуктах, которые варьируют от 0.025 до 1000 мкг/кг [2—5].

В настоящее время для определения микотоксинов в пищевых продуктах наиболее широко используются хроматографические [6, 7] и иммунохимические методы анализа [8], реже — электрофоретические [9, 10] и флуориметрические [11] (рис. 1). Среди хроматографических методов наиболее распространена высокоэффективная жидкостная хроматография в обращенно-фазовом варианте с фотометрическим детектированием в ультрафиолетовой и видимой области (ВЭЖХ-УФ) [12—15], флуориметрическим (ВЭЖХ-ФЛ) [16—19] или тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ—МС/МС) [20—23]. Последние два метода обеспечивают высокую чувствительность и селективность по отношению к определяемым микотоксинам. В случае если аналиты не поглощают свет в ультрафиолетовой и видимой областях спектра в достаточной степени для достижения необходимых пределов обнаружения либо не обладают собственной флуоресценцией, для проведения ВЭЖХ-УФ- и ВЭЖХ-ФЛ-анализа осуществляют их пред- [24] или постколоночную [25] дериватизацию.

Рис. 1. Распределение количества публикаций, вышедших в свет в 2000—2023 гг., по применяемым методам анализа (ГХ-ЭЗД — газовая хроматография с электронно-захватным детектором; МЭКХ — мицеллярная электрокинетическая хроматография).

Пищевые продукты относятся к объектам со сложной матрицей, поэтому при определении в них микотоксинов пробоподготовка, как правило, включает процедуры устранения мешающего влияния матричных компонентов и концентрирования аналитов. Для выделения следовых количеств микотоксинов из пищевых продуктов наиболее востребованы методы жидкостно-жидкостной и твердофазной экстракции [6, 26]. В последнее время быстрыми темпами развиваются методы жидкостно-жидкостной (ЖЖМЭ) и твердофазной (ТФМЭ) микроэкстракции (МЭ), которые позволяют миниатюризировать стадию пробоподготовки, отличаются от традиционных способов малыми объемами экстрагента и небольшими количествами сорбента, а также в ряде случаев более высокой скоростью установления межфазного равновесия [26—30]. Микроэкстракция находит широкое применение для определения следовых концентраций микотоксинов в пищевых продуктах с помощью современных методов анализа. Подтверждением этого является рост количества публикаций (рис. 2) о применении методов МЭ для определения микотоксинов в пищевых продуктах. Среди методов ЖЖМЭ, популярными являются дисперсионная (ДЖЖМЭ), мембранная микроэкстракция (МЖЖМЭ) и МЭ в супрамолекулярные растворители (СМР), при этом ДЖЖМЭ посвящено подавляющее число работ (рис. 3). Капельная МЭ (КМЭ) применяется значительно реже. Среди методов ТФМЭ чаще всего используются дисперсионная, проточная и волоконная ТФМЭ.

Рис. 2. Количество публикаций, посвященных микроэкстракционному выделению микотоксинов из пищевых продуктов, вышедших в свет, начиная с 2000 г. (на основании поиска литературных источников в Российской научной электронной библиотеке Elibrary и базе данных Scopus).

Рис. 3. Распределение количества публикаций, вышедших в свет в 2000—2023 гг., о применяемых методах жидкостной и твердофазной микроэкстракции.

В данной обзорной статье рассмотрены способы ЖЖМЭ и ТФМЭ микотоксинов из пищевых продуктов для их определения различными физико-химическими методами анализа. Обзор подготовлен на основании публикаций, вышедших в свет с 2000 г. по 2023 г. в периодических изданиях и представленных в базах данных Российской научной электронной библиотеки Elibrary.ru и Scopus.

ЖИДКОСТНО-ЖИДКОСТНАЯ МИКРОЭКСТРАКЦИЯ

Для выделения и концентрирования микотоксинов из проб пищевых продуктов широко применяют метод ДЖЖМЭ. При ДЖЖМЭ смесь неполярного экстрагента и полярного растворителя (диспергатора) вводят в анализируемый водный раствор, в результате чего фаза экстрагента равномерно распределяется в водной фазе в виде тонкодисперсной эмульсии [27]. Образование гидрофильной эмульсии приводит к существенному ускорению массопереноса и быстрому (не более 1 мин) установлению межфазного равновесия за счет большой площади контакта фаз. После центрифугирования экстракт отбирают и анализируют. Как правило, применяют методы жидкостной хроматографии. Иногда для упрощения отбора экстракта применяют экстрагент с низкой температурой плавления (например, н-додеканол с температурой плавления 24 °C) и проводят его кристаллизацию при охлаждении экстракционной системы [12]. Кроме того, показана возможность применения магнитных наночастиц (МНЧ) магнетита, покрытых высшей карбоновой кислотой, для отделения фазы экстракта без центрифугирования при определении афлатоксина М₁ в пробах молока флуориметрическим методом в присутствии неионогенного поверхностно-активного вещества (ПАВ) Triton X-110 [11]. Метод ДЖЖМЭ нашел применение для концентрирования наиболее распространенных и опасных микотоксинов (охратоксина А [20, 31—34], патулина [9, 13, 14], дезоксиваленола [21], стеригматоцистина [20, 21], афлатоксинов [16, 17, 20, 24, 35, 36], трихотеценов [37], фумонизинов [20, 21], зеараленона [20, 38—40], цитринина [20], ниваленола [37]) из жидких пищевых продуктов и экстрактов из твердых матриц. В качестве экстрагентов микотоксинов чаще всего используют ароматические (толуол [41]) и хлорсодержащие органические растворители (хлороформ [17, 24, 42], дихлорметан [37], трихлорметан [16]), жирные спирты (н-гептанол [11], н-додеканол [12]) и этилацетат [38, 43], а в качестве диспергаторов — метанол [21], ацетонитрил [38], ацетон [44], изопропанол [9]. Если экстракт несовместим с аналитическим оборудованием, применяемым для определения аналитов, проводят реэкстракцию в несмешивающийся с ним растворитель (например, в водную фазу) [45] или упаривают экстракт с дальнейшим растворением сухого остатка (замену растворителя) для последующего анализа [31]. Например, в работе [21] определяли 13 микотоксинов в рисовых отрубях методом ВЭЖХ—МС/МС после экстрагирования аналитов из пробы в водно-органическую смесь и их концентрирования методом ДЖЖМЭ в хлороформ. Экстракт упаривали в токе азота и растворяли сухой остаток в водной составляющей подвижной фазы для последующего хроматографического анализа.

Стоит отметить, что метод ДЖЖМЭ позволяет достичь высоких коэффициентов концентрирования за счет использования малого объема экстрагента, что делает его наиболее эффективным для концентрирования следовых количеств микотоксинов из пищевых продуктов. Однако существует проблема снижения коэффициентов распределения аналитов между фазами водного раствора пробы и экстрагента в присутствии диспергатора, что связано с более высокой растворимостью микотоксинов в смеси полярного растворителя и водного раствора по сравнению с исходным водным раствором. В настоящее время предложены другие способы диспергирования экстрагентов, позволившие частично или полностью отказаться от использования диспергаторов, но требующие наличия дополнительного оборудования. Среди них — диспергирование под действием ультразвукового поля [12], при попеременном перекачивании из одного шприца в другой [15] или на вихревой мешалке [44]. Для выделения микотоксинов, отличающихся по полярности, предложена двукратная ДЖЖМЭ. Микотоксины из пробы извлекают в первый экстрагент (например, этилацетат) в присутствии первого диспергатора (например, ацетонитрила), а затем к фазе пробы добавляют смесь второго экстрагента (например, хлороформа) и второго диспергатора (например, метанола) [38]. Недостатком способа является эффект разбавления при смешении двух экстрактов.

При определении микотоксинов в жидких объектах, преимущественно состоящих из воды и содержащих небольшие количества гидрофобных компонентов (напитки на основе чая [38], алкогольные напитки [31, 34, 44, 46, 47], соки [9, 13]), подготовка проб может быть минимальной: например, дегазация в ультразвуковом поле для солодовых алкогольных газированных напитков [31] либо фильтрация для вина [34] при определении охратоксина А методами ВЭЖХ-ФЛ и высокоэффективной тонкослойной хроматографии с флуориметрическим детектированием (ВЭТСХ-ФЛ), центрифугирование, фильтрование и разбавление фильтрата деионизованной водой для анализа яблочного сока на содержание патулина с помощью ВЭЖХ-УФ [13] либо мицеллярной электрокинетической хроматографии с фотометрическим детектированием (МЭКХ-УФ) [9], добавление высаливающего агента (хлорида натрия) к водной вытяжке из листьев черного, красного или зеленого чая при ВЭЖХ—МС/МС-определении ряда микотоксинов [38]. Для проведения ДЖЖМЭ и извлечения аналитов в подготовленные водные растворы пробы вводят смесь экстрагента и диспергатора (рис. 4а).

Рис. 4. Схема дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции при концентрировании микотоксинов из водного раствора пробы (а) или экстракта из твердофазной пробы (б).

Анализ молока [11, 16, 35] и жидких молочных продуктов [35, 43] часто затруднен из-за мешающего влияния матричных компонентов (жиров и белков), поэтому к пробе добавляют полярный растворитель (например, ацетонитрил), содержащий уксусную кислоту [48] или хлорид натрия [35], для осаждения белков и н-гексан для удаления жиров [48]. Фазу полярного растворителя, служащего диспергатором, отбирают, добавляют в нее экстрагент и вводят смесь в воду для концентрирования аналитов. Более сложный подход использовали при выделении зеараленона из проб молока и йогурта перед его определением методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (МЭКХ—МС/МС). Он состоит в удалении полярного растворителя упариванием и растворении аналитов в водном растворе хлорида натрия для дальнейшей ДЖЖМЭ [48]. В случае пищевых масел [17] проводят жидкостно-жидкостную экстракцию аналитов (афлатоксинов B₁, B₂, G₁ и G₂) в водно-органическую среду (смесь метанола, воды и хлорида натрия), сорбируют аналиты на иммуноафинной колонке, элюируют их полярным растворителем, а затем элюат выступает в роли диспергатора в ДЖЖМЭ перед ВЭЖХ-ФЛ-определением аналитов.

Метод ДЖЖМЭ активно применяется и для концентрирования аналитов из экстрактов, полученных после экстрагирования из твердых матриц (зерна пшеницы, риса, кукурузы и ячменя [24, 36], бобовых [42], рисовых отрубей [21], кунжута, косточек абрикоса и личи [12], семян амаранта [45], сухофруктов [33], сыра [16]) в полярный растворитель или его смесь с водой. К полученному экстракту добавляют гидрофобный экстрагент и вводят полученную смесь в водную среду для образования тонкодисперсной эмульсии (рис. 4б). ДЖЖМЭ также может быть совмещена с методом QuEChERS (сокращение от Quick (быстро), Easy (просто), Cheap (дешево), Effective (эффективно), Rugged (надежно), and Safe (безопасно)). Выполняют экстрагирование из пробы пищевого продукта в смесь полярного растворителя и воды, экстракцию с высаливанием экстрагента и выделение матричных компонентов из экстракта с помощью сорбента (например, силикагеля с анионообменными и октадецильными группами) [16, 37]. Так, предложено выделять афлатоксины B₁, B₂, G₁ и G₂ из проб зерна и корма методом QuEChERS, концентрировать их из экстракта с помощью ДЖЖМЭ в хлороформ с последующим упариванием экстрагента в токе азота, далее получать иодопроизводные аналитов (люминофоры) в среде метанольного раствора иода для ВЭЖХ-ФЛ-анализа с пределами обнаружения в диапазоне 0.08—0.1 мкг/кг [24]. Комбинирование методов QuEChERS и ДЖЖМЭ использовано также при определении трихотеценовых микотоксинов (Т-2 и НТ-2 токсинов, дезоксиниваленола и ниваленола) в зерне и комбикормах методом газовой хроматографии с электронно-захватным детектором [37]. Летучие трифторацетильные производные целевых аналитов получали с применением трифторуксусного ангидрида. Пределы определения варьировались от 10 до 50 мкг/кг. Описан способ ДЖЖМЭ дезоксиваленола и его деэпоксиметаболита из экстрактов кукурузных зерен и свинины [49]. Аналиты извлекали из твердой пробы в этилацетат (диспергатор), после чего смешивали с н-гексаном и вводили водную фазу. Гидрофильные аналиты переходили в водную фазу, которую использовали для ВЭЖХ—МС/МС-анализа. Пределы обнаружения варьировались от 4 до 6 мкг/кг.

Одним из направлений развития ЖЖМЭ является поиск селективных и экологически безопасных экстрагентов [50]. В качестве “дизайнерских” экстрагентов, состав которых можно варьировать в зависимости от поставленной задачи, предложены ионные жидкости (ИЖ), глубокие эвтектические растворители (ГЭР) и СМР.

Ионные жидкости состоят из органических катиона и аниона, находятся в жидком состоянии при комнатной температуре, обладают химической и термической стабильностью, низкой летучестью [51—53]. Опубликованы единичные работы, касающиеся применения ИЖ для ДЖЖМЭ зеараленона, охратоксина А и афлатоксинов из пива [39], зерен пшеницы и кукурузы [39, 54], вина [32, 55] и чайных листьев [56] для последующего определения аналитов методом ВЭЖХ-ФЛ. Во всех представленных работах экстрагентами являются гидрофобные имидазолиевые ИЖ: гексафторфосфат 1-гексил-3-метилимидазолия [32, 54, 55], бис(трифторметилсульфонил)имиды 1-бутил-3-метил- и 1-метил-3-октилимидазолия [39], а также соль катиона 1-бутил-3-метилимидазолия и комплексного аниона [FeCl₂Br₂]^– [56]. В последнем случае ИЖ обладает магнитными свойствами, поэтому для разделения фаз не требуется центрифугирование. В качестве диспергаторов применяют полярные растворители (метанол, этанол, смесь ацетонитрила и метанола).

На сегодняшний день большое внимание исследователей привлекают ГЭР в связи с их доступностью, простотой получения, малой токсичностью и биоразлагаемостью [57—59]. Прекурсоры ГЭР во многих случаях имеют природное происхождение, что делает их экологически безопасными. Процесс получения ГЭР в лаборатории сводится, как правило, к простому смешению донора и акцептора водородной связи при нагревании. Комбинации исходных прекурсоров могут быть различными, поэтому их и относят к “дизайнерским” экстрагентам. Температура плавления ГЭР является более низкой, чем у его прекурсоров, в связи с чем он обычно находится в жидком агрегатном состоянии при комнатной температуре. Экстракционные свойства ГЭР зависят от природы прекурсоров, что открывает широкие возможности для получения растворителей с требуемыми характеристиками. По растворимости в водной среде ГЭР классифицируют на гидрофильные, квазигидрофобные и гидрофобные [60]. В настоящее время существуют отдельные примеры применения квазигидрофобных (смесь холина хлорида, 4-хлорфенола и α-терпинеола [61], смесь этилметиламмония хлорида [62] или диэтаноламмония хлорида [63] и терпеноида карвакрола) и гидрофобных (смесь ментола и н-гексанола [40] или декановой кислоты [64]) ГЭР для извлечения и концентрирования афлатоксинов, зеараленона и охратоксина А из твердофазных (зерно [40], сыр [63], рис [62]), и жидких (соевое молоко [61]) пищевых продуктов c последующим определением аналитов методом ВЭЖХ-ФЛ. Квазигидрофобные ГЭР состоят из существенно различающихся по полярности прекурсоров, что обусловливает разрушение растворителя при контакте с водной фазой. По существу, экстракция в данном случае протекает в фазу, содержащую преимущественно один из компонентов ГЭР. Наиболее удобными для выделения целевых аналитов из водных проб являются гидрофобные ГЭР. Такие ГЭР являются стабильными в присутствии воды. Тем не менее в водно-органических средах стабильность гидрофобных ГЭР снижается, и выделяющаяся в ходе ДЖЖМЭ фаза может не соответствовать по составу исходному экстрагенту, что отмечено в работе [40]. Описано применение гидрофильного ГЭР (смесь хлорида холина и этиленгликоля) в качеcтве диспергатора для ДЖЖМЭ [62]. В экстракт из риса, полученный после экстрагирования афлатоксинов B₁, B₂, G₁ и G₂ в гидрофильный ГЭР, добавляли квазигидрофобный ГЭР на основе этилметиламмония хлорида и карвакрола и вводили смесь в водную среду для ДЖЖМЭ с последующим ВЭЖХ-ФЛ-анализом экстракта. Пределы обнаружения составили от 0.02 до 0.07 мкг/кг.

Активно применяются и супрамолекулярные растворители (термин предложен профессором Рубио [18]), образующиеся из изотропных (мицеллярных) растворов амфифилов (ПАВ) в результате последовательных процессов самоорганизации и коацервации при введении в систему инициаторов фазового разделения или изменении температуры системы в виде отдельной фазы, обогащенной амфифилом, а процессы в таких системах имеют супрамолекулярный характер [65, 66]. Супрамолекулярные растворители применяются в мицеллярной экстракции и МЭ для выделения аналитов путем их солюбилизации внутри супрамолекулярных агрегатов (мицелл или везикул), сформированных амфифилами в растворе пробы, с последующим образованием двухфазной системы [67]. Для выделения микотоксинов из проб пищевых продуктов в качестве амфифилов изучены лишь оксиэтилированный октилфенол (коммерческое название — Triton X-114) [68, 69], являющийся неионогенным ПАВ, и высшие карбоновые кислоты (декановая [18, 70, 71], тетрадекановая [72] и олеиновая [73]), которые проявляют свойства как неионогенных, так и анионных ПАВ. В первом случае фазовое разделение происходит при нагревании изотропного раствора с “прямыми” мицеллами, полученного смешением пробы и раствора ПАВ с добавлением солей (нитрат калия, хлорид натрия), до температуры от 50 до 55 ^оC. При этом экстракт обладает слишком высокой вязкостью для прямого ввода в жидкостный хроматограф, требуется разбавление полярными растворителями (метанол, ацетонитрил). Предварительно проводили экстрагирование [69], применяли жидкостно-жидкостную [68] или твердофазную экстракцию на иммуноаффиной колонке [69] афлатоксинов B₁ и B₂, тенуазоновой и циклопиазоновой кислот из анализируемой пробы (томатный сок [68], арахис и арахисовое масло [69]). Во втором случае коацервация протекает по двум механизмам: первый состоит в формировании “обратных” мицелл карбоновых кислот в смеси водной среды (рН 2.7—3.5) и тетрагидрофурана с выделением СМР [70, 71], второй — в образовании СМР при переводе карбоновой кислоты в анионную форму при добавлении гидроксида тетрабутиламмония [74]. Для мицеллярной МЭ из образцов белого, красного и розового вина пробы подкисляли и вводили раствор карбоновой кислоты в тетрагидрофуране, при этом наблюдали выделение охратоксина А и афлатоксина B₁ в СМР. Аналиты в экстрактах определяли методами хроматографического [71] или иммунохимического [72] анализа. Прямой анализ экстракта в последнем случае невозможен из-за мешающего влияния компонентов экстракта, поэтому удаляли тетрагидрофуран (агент коацервации) и извлекали аналиты в фосфатный буферный раствор. Охратоксин А, афлатоксин B₁, декоксиваленол, зеараленон и фумонизины В₁ и В₂ экстрагировали из твердых матриц (зерен пшеницы, кукурузы и хлеба [70, 72, 73], изюма [74], специй (имбирь, куркума, паприка, черный перец, мускатный орех) [72, 75]) при встряхивании проб с предварительно полученными СМР [72, 73] либо с мицеллярным раствором с последующим in situ выделением фазы СМР [70].

Капельную МЭ осуществляют путем погружения в жидкую пробу капли экстрагента на кончике микрошприца. После извлечения каплю отбирают обратно для дальнейшего, как правило, хроматографического анализа [28, 76]. Для выделения патулина из яблочного сока нашел применение трехфазный вариант капельной микроэкстракции, суть которого состоит в предварительном извлечении аналита в несмешивающийся с пробой экстрагент с последующей его реэкстракцией в каплю водной фазы [22]. В плоскодонную колбу с длинным горлом помещали пробу сока и экстрагент (этилацетат), смесь встряхивали. В верхний органический слой с помощью микрошприца вводили каплю воды (5 мкл) для реэкстракции аналита и последующего ВЭЖХ—МС/МС-анализа. Предел обнаружения составил 0.5 мкг/л. В КМЭ объем пробы заметно превосходит объем экстрагента, что обычно позволяет добиться высоких коэффициентов концентрирования, а возможность прямого ввода экстракта в аналитический прибор сокращает общее время пробоподготовки и количество операций. К недостаткам метода КМЭ относят низкую стабильность капли экстрагента под воздействием перемешивания, возможность частичного растворения фазы экстрагента и замедленный массоперенос определяемых веществ.

Для извлечения микотоксинов (афлатоксинов, охратоксина А и Т-2 токсина) из проб пищевых продуктов (пива и вина [77], риса, пшеницы, семян кунжута [19], смеси соевого молока и яблочного сока [41], яблочного, апельсинового, виноградного и гранатового соков [23], молока [78]) также используют МЖЖМЭ, которая предполагает извлечение целевых аналитов в фазу экстрагента, находящуюся в порах полимерной мембраны (рис. 5), чаще всего имеющей форму полого капилляра из полипропилена [28, 79]. Данный подход решает проблему стабильности фазы экстрагента по отношению к внешним воздействиям, присущую КМЭ, например, позволяет экстрагировать афлатоксины B₁, B₂, G₁, G₂ из смеси соевого молока и яблочного сока, которая представляет собой эмульсию [41]. Мембрану смачивают подходящим экстрагентом (н-октанолом [19, 23, 41, 77]), закрепляют на игле или металлическом стержне и погружают в пробу. При перемешивании происходит массоперенос аналитов в фазу экстрагента, которую далее смывают ацетонитрилом, метанолом или смесью ацетонитрила и воды для последующего анализа. Стоит отметить, что при использовании МЖЖМЭ для извлечения микотоксинов из образцов требуется значительное время (до 4 ч в случае выделения охратоксина А и Т-2 токсина из проб вина и пива в н-октанол [77]). Для достижения более высоких степеней извлечения и ускорения процесса массопереноса микотоксинов из проб предложено диспергировать наноматериалы (композитные частицы оксида графена и поливинилпирролидона) в экстрагенте [19] либо комбинировать МЖЖМЭ с ДЖЖМЭ [23, 41]. Первый подход позволяет одновременно извлекать аналиты по механизмам ЖЖМЭ и ТФМЭ. Второй предполагает введение смеси экстрагента (толуола) и диспергатора (ацетона) в водную фазу пробы, погружение мембраны, пропитанной н-октанолом, в образовавшуюся эмульсию. При этом происходит перенос микрокапель толуола, содержащих аналит, через мембрану. Возможна автоматизация МЖЖМЭ [78]. Для определения аналитов после МЖЖМЭ используют ВЭЖХ-ФЛ и ВЭЖХ—МС/МС.

Рис. 5. Схема мембранной жидкостно-жидкостной микроэкстракции.

ТВЕРДОФАЗНАЯ МИКРОЭКСТРАКЦИЯ

В основе ТФМЭ лежит сорбция аналитов на поверхности миллиграммовых количеств наноразмерных сорбентов или тонких пленок, имеющих толщину от десятков до сотен мкм [26, 30]. Эффективность сорбции определяется сродством аналита к материалу сорбента или пленки. Для массопереноса создают подходящие условия, регулируя кислотность, ионную силу, интенсивность перемешивания. Затем осуществляют элюирование аналитов и, как правило, элюат вводят в хроматографическую систему напрямую без замены растворителя. Для выделения микотоксинов из пищевых продуктов предложны различные способы ТФМЭ.

Волоконная ТФМЭ заключается в сорбции целевых аналитов на полимерной фазе, иммобилизованной на поверхности стального, кварцевого или стеклянного стержня [80, 81]. В качестве сорбционной фазы (волокна) для извлечения охратоксина А из проб сыра использовали полимерную пленку с углеродным покрытием, иммобилизованную на стальном стержне и предварительно выдержанную в водном растворе соляной кислоты [82]. Стержень напрямую вводили в образец сыра так, чтобы обеспечить полное соприкосновение слоя сорбента с пробой, после чего его оставляли в таком положении на 20 мин для выделения охратоксина А. Наличие кислоты в сорбционном слое обеспечивало массоперенос аналита в молекулярной форме. После сорбции остатки пробы удаляли с пленки и элюировали аналит метанолом для последующего ВЭЖХ—МС/МС-анализа. Предложенный способ является простым и не требует больших объемов растворителей. Волоконную ТФМЭ также применяют для извлечения микотоксинов (охратоксин А, циклопиазоновая, микофеноловая, тенуазоновая кислоты) из жидких проб (пиво [83], вино [84]) или из экстрактов из твердых проб (сыр [85, 86], кукурузные хлопья [87]) с помощью сорбентов на основе полидиметилсилоксана и дивинилбензола (толщина 60 мкм) либо полиэтиленгликоля Carbowax и смолы TPR-100 (толщина 50 мкм). Аналиты определяют методами ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-ФЛ.

Более эффективным способом является МЭ на вкладыше магнитной мешалки, возможности которой продемонстрированы при ВЭЖХ—МС/МС-определении афлатоксинов в сухом молоке для детского питания [88]. После экстрагирования аналитов в водный раствор муравьиной кислоты в ультразвуковом поле и жидкостно-жидкостной экстракции в хлороформ экстрагент упаривали в токе азота. Растворяли сухой остаток в воде и помещали в полученный раствор вкладыш магнитной мешалки, изготовленный из полимерного материала с молекулярными отпечатками, в матрицу которого во время синтеза вводили МНЧ магнетита. Сорбция протекала при вращении вкладыша в магнитном поле. Микотоксины десорбировали с полимера смесью метанола и уксусной кислоты. Элюат упаривали в токе азота, растворяли остаток в подвижной фазе и определяли афлатоксины методом жидкостной хроматографии. Достигнуты пределы обнаружения в интервале от 0.3 до 2 нг/кг.

Существенное ускорение массопереноса по сравнению с двумя рассмотренными выше методами наблюдается в методе дисперсионной ТФМЭ при использовании миллиграммовых количеств наноразмерных сорбентов на основе углеродных материалов, металлов, оксидов металлов/неметаллов [89, 90], которые равномерно распределяются по объему пробы и имеют большую площадь поверхности за счет малого размера. Так, для концентрирования афлатоксинов B₁, В₂, G₁, G₂ из полярных сред применили [91] наностержни оксида циркония, модифицированные ИЖ — 1-гексил-3-метилимидазолия гексафторфосфатом. После экстрагирования аналитов из проб красного острого перца и арахиса в смесь ацетонитрила и воды полученный экстракт встряхивали с сорбентом (1 мин) на вихревой мешалке, элюировали аналиты ацетонитрилом и анализировали элюат методом ВЭЖХ-ФЛ. Пределы обнаружения составили 0.01 мкг/кг и выше. Для дополнительного концентрирования аналитов после их элюирования с сорбента (допированная азотом и серой сажа [92], железосодержащие металлоорганические каркасные структуры [64]) применяют ДЖЖМЭ с квазигидрофобными и гидрофобными ГЭР в качестве экстрагентов. При этом элюирование во втором случае проводят с помощью гидрофильного ГЭР на основе холина хлорида и этиленгликоля, который в дальнейшем служит диспергатором гидрофобного ГЭР на основе ментола и декановой кислоты. Таким образом, удается обойтись без применения классических более токсичных полярных и неполярных органических растворителей.

Для упрощения процедуры дисперсионной ТФМЭ предложено применять МНЧ на основе оксидов железа (чаще всего магнетита [93]). Достоинством таких сорбентов является возможность их отделения от жидкой фазы при помощи внешнего магнита, что позволяет исключить стадии центрифугирования после этапов сорбции, промывки сорбента и элюирования аналитов (рис. 6). Для преодоления склонности МНЧ магнетита к агрегации, улучшения их сорбционных свойств и увеличения селективности сорбента при выделении микотоксинов различных классов из экстрактов из проб пшеницы [94], овощей, фруктов и ягод [95], пряностей [96] получали композитный материал на основе МНЧ и полимера с молекулярными отпечатками [94] либо модифицировали МНЧ полипирролом [96] или ковалентными органическими каркасами [95]. Аналиты определяли методами ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ—МС/МС.

Рис. 6. Схема дисперсионной твердофазной микроэкстракции с применением магнитных наночастиц.

Для автоматизации процесса сорбции аналитов из проб и осуществления его в режиме онлайн предложена проточная ТФМЭ в капилляре, последовательно соединенном с системой для хроматографического анализа (рис. 7) [30]. Как правило, сорбент помещают в капилляр в дисперсном состоянии [97], наносят на стенки капилляра [98, 99] или получают в капилляре in situ в виде монолита [100]. Элюат из капилляра напрямую подают в хроматографическую колонку. Данный подход продемонстрирован в работе [100]. На первом этапе через систему пропускали раствор-носитель (водный раствор, содержащий ацетонитрил и трифторуксусную кислоту) для кондиционирования сорбционной колонки. Затем в дозирующую петлю отбирали водно-органический экстракт пробы риса, содержащий зеараленон, афлатоксин B₁ и стеригматоцистин. В капилляре с сорбентом происходила сорбция аналитов. С помощью второго насоса в капилляр подавали подвижную фазу (ацетонитрил и раствор трифторуксусной кислоты) для элюирования аналитов; элюат направляли в систему для ВЭЖХ—МС/МС-анализа. Способ позволил достичь высоких значений коэффициентов концентрирования (72—99). В работе [97] для выделения зеараленона, цитринина и охратоксина А из молочных продуктов после депротеинизации в режиме онлайн использовали капилляр, в который помещали допированные графеном полимерные нановолокна. Возможности применения капилляров с частицами углеродного гидрофобного материала (Carboxen) показаны при ВЭЖХ—МС/МС-определении патулина во фруктовом соке и сухофруктах [98], а также охратоксинов А и В в пробах орехов, кукурузных зерен, риса и пшеничной муки [99].

Рис. 7. Схема проточной твердофазной микроэкстракции.

Характеристики методик определения микотоксинов в пищевых продуктах, включающих микроэкстракционное выделение аналитов, приведены в табл. 1.

Таблица 1. Характеристики методик определения микотоксинов в пищевых продуктах, включающих жидкостно-жидкостную и твердофазную микроэкстракцию аналитов

Обозначения: ТФЭ — твердофазная экстракция.

* * *

Микотоксины — одни из наиболее опасных загрязнителей пищевых продуктов и кормов для животных, содержание которых контролируется с целью обеспечения потребителей безопасной продукцией. В аналитической практике для определения следовых концентраций микотоксинов предложено использовать микроэкстракционные методы, которые позволяют эффективно устранять мешающее влияние матричных компонентов проб и концентрировать аналиты. Анализ литературы показал, что микроэкстракционные методы относительно легко сочетаются с хроматографическими, электрофоретическими и спектральными методами при определении микотоксинов в пищевых продуктах. В последнее время особое внимание уделяют применению ИЖ, ГЭР и СМР как эффективным экстрагентам для выделения и концентрирования микотоксинов из разных матриц. Основные преимущества таких методов — низкий расход экстрагентов и небольшое количество образующихся отходов, а “дизайнерские” экстрагенты являются экологически безопасными и во многих случаях избирательными по отношению к определяемым веществам.

Авторы выражают благодарность Российскому научному фонду № 21-13-00020 (https://rscf.ru/project/21-13-00020/).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A. S. Pochivalov

Author for correspondence.
Email: alexpochival@bk.ru

Institute of Chemistry

K. V. Pavlova

Email: a.pochivalov@spbu.ru

Institute of Chemistry

A. V. Bulatov

Email: alexpochival@bk.ru

Institute of Chemistry

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Distribution of the number of publications published in 2000–2023 by the analytical methods used (GC-ECD – gas chromatography with electron capture detector; MEKC – micellar electrokinetic chromatography).

Download (357KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. The number of publications devoted to the microextraction isolation of mycotoxins from food products, published since 2000 (based on a search of literary sources in the Russian scientific electronic library Elibrary and the Scopus database).

Download (107KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Distribution of the number of publications published in 2000–2023 on the applied methods of liquid and solid-phase microextraction.

Download (107KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Scheme of dispersive liquid-liquid microextraction for concentrating mycotoxins from an aqueous sample solution (a) or an extract from a solid-phase sample (b).

Download (265KB)

Indexing metadata

6. Fig. 5. Scheme of membrane liquid-liquid microextraction.

Download (146KB)

Indexing metadata

7. Fig. 6. Scheme of dispersive solid-phase microextraction using magnetic nanoparticles.

Download (235KB)

Indexing metadata

8. Fig. 7. Scheme of flow solid-phase microextraction.

Download (237KB)

Indexing metadata

Статья посвящается 300-летию основания Санкт-Петербургского государственного университета