Нокаут PTEN вызывает преждевременное старение эндометриальных стромальных клеток человека

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Одним из защитных механизмов против неопластической трансформации клеток в ответ на онкогенные стимулы является клеточное старение. Однако способность клеток активировать данную защитную реакцию зависит от их природы и присуща не всем клеточным типам. В нашей работе мы исследовали реакцию эндометриальных стромальных клеток человека (эСК) на классический онкогенный стимул – инактивацию онкосупрессора PTEN. Используя технологию направленного редактирования генома CRISPR/Cas9, нам удалось получить линию эСК с нокаутом гена PTEN. Мы показали, что снижение экспрессии PTEN приводит к потере пролиферативной активности, гипертрофии, накоплению липофусцина и нарушению редокс-баланса клеток. Совокупность выявленных признаков свидетельствует в пользу индукции преждевременного старения в эСК, нокаутных по PTEN. При исследовании молекулярных механизмов мы установили ключевую роль PI3K/AKT сигнального пути в реализации программы старения эСК в условиях нокаута PTEN. Ингибирование этого сигнального пути при помощи вещества LY294002 предотвращало как фенотипические проявления преждевременного старения, так и арест клеточного цикла в нокаутных по PTEN-клетках. Таким образом, развитие преждевременного старения в условиях сниженной экспрессии онкосупрессора PTEN можно рассматривать как защитный механизм, препятствующий злокачественной трансформации эСК.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

П. С. Парфенова

Институт цитологии РАН

Email: borodkina618@gmail.com

Группа механизмов клеточного старения

Россия, Санкт-Петербург, 194064

П. И. Дерябин

Институт цитологии РАН

Email: borodkina618@gmail.com

Группа механизмов клеточного старения

Россия, Санкт-Петербург, 194064

Д. Ю. Поздняков

Институт цитологии РАН

Email: borodkina618@gmail.com

Группа механизмов клеточного старения

Россия, Санкт-Петербург, 194064

А. В. Бородкина

Институт цитологии РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: borodkina618@gmail.com

Группа механизмов клеточного старения

Россия, Санкт-Петербург, 194064

Список литературы

  1. Грюкова А.А., Шатрова А.Н., Дерябин П.И., Бородкина А.В., Князев Н.А., Никольский Н.Н., Бурова Е.Б. 2017. Модуляция фенотипических признаков старения стволовых эндометриальных клеток в условиях ингибирования mTOR и MAP-киназных сигнальных путей. Цитология. Т. 59. № 6. С. 410. (Grukova A.A., Shatrova A.N., Deryabin P.I., Borodkina A.V., Knyazev N.A., Nikolsky N.N., Burova E.B. 2017. Modulation of senescence phenotype of human endometrial stem cells under inhibition of mtor and map-kinase signaling pathways. Tsitologiia. V. 59. P. 410.)
  2. Земелько В.И., Гринчук Т.М., Домнина А.П., Арцыбашева И.В., Зенин В.В., Кирсанов А.А., Бичевая Н.К., Корсак В.С., Никольский Н.Н. 2011. Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки десквамированного эндометрия. Выделение, характеристика и использование в качестве фидерного слоя для культивирования эмбриональных стволовых линий человека. Цитология. Т. 53. № 12. С. 919. (Zemelko V.I., Grinchuk T.M., Domnina A.P., Artzibasheva I.V., Zenin V.V., Kirsanov A.A., Bichevaia N.K., Korsak V.S., Nikolsky N.N. 2011. Multipotent mesenchymal stem cells of desquamated endometrium: Isolation, characterization, and application as a feeder layer for maintenance of human embryonic stem cells. Tsitologiia. V. 53. P. 919.)
  3. Alimonti A., Nardella C., Chen Z., Clohessy J.G., Carracedo A., Trotman L.C., Cheng K., Varmeh S., Kozma S.C., Thomas G., Rosivatz E., Woscholski R., Cognetti F., Scher H.I., Pandolfi P.P. 2010. A novel type of cellular senescence that can be enhanced in mouse models and human tumor xenografts to suppress prostate tumorigenesis. J. Clin. Invest. V. 120. P. 681.
  4. Borodkina A., Shatrova A., Abushik P., Nikolsky N., Burova E. 2014. Interaction between ROS dependent DNA damage, mitochondria and p38 MAPK underlies senescence of human adult stem cells. Aging. V. 6. P. 481.
  5. Bousset L., Gil J. 2022. Targeting senescence as an anticancer therapy. Mol. Oncol. V. 16. P. 3855.
  6. Campisi J., Dimri G., Hara E. 1996. Handbook of the biology of aging. N.-Y., USA: Academic Press.
  7. Chen C.-Y., Chen J., He L., Stiles B.L. 2018. PTEN: tumor suppressor and metabolic regulator. Front. Endocrino. V. 9. P. 338.
  8. Chen Z., Trotman L.C., Shaffer D., Lin H.-K., Dotan Z.A., Niki M., Koutcher J.A., Scher H.I., Ludwig T., Gerald W., Cordon-Cardo C., Pandolfi P.P. 2005. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of PTEN-deficient tumorigenesis. Nature. V. 436. P. 725.
  9. Deryabin P., Griukova A., Shatrova A., Petukhov A., Nikolsky N., Borodkina A. 2019. Optimization of lentiviral transduction parameters and its application for CRISPR-based secretome modification of human endometrial mesenchymal stem cells. Cell Cycle. V. 18. P. 742.
  10. Duan S., Yuan G., Liu X., Ren R., Li J., Zhang W., Wu J., Xu X., Fu L., Li Y., Yang J., Zhang W., Bai R., Yi F., Suzuki K., et al., 2015. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Commun. V. 6. P. 10068.
  11. Huang W., Hickson L.J., Eirin A., Kirkland J.L., Lerman L.O. 2022. Cellular senescence: the good, the bad and the unknown. Nat. Rev. Nephrol. V. 18. P. 611.
  12. Jung S.H., Hwang H.J., Kang D., Park H.A., Lee H.C., Jeong D., Lee K., Park H.J., Ko Y.G., Lee J.S. 2019. mTOR kinase leads to PTEN-loss-induced cellular senescence by phosphorylating p53. Oncogene. V. 38. P. 1639.
  13. Kappes H., Goemann C., Bamberger A.M., Löning T., Milde-Langosch K. 2001. PTEN expression in breast and endometrial cancer: correlation with steroid hormone receptor status. Pathobiology. V. 69. P. 136.
  14. Kim J.S., Lee C., Bonifant C.L., Ressom H., Waldman T. 2007. Activation of p53-dependent growth suppression in human cells by mutations in PTEN or PIK3CA. Mol. Cell Biol. V. 27. P. 662.
  15. Lancaster J.M., Risinger J.I., Carney M.E., Barrett J.C., Berchuck A. 2001. Mutational analysis of the PTEN gene in human uterine sarcomas. Am. J. Obstet. Gynecol. V. 184. P. 1051.
  16. Legut M., Daniloski Z., Xue X., McKenzie D., Guo X., Wessels H.-H., Sanjana N.E. 2020. High-Throughput Screens of PAM-Flexible Cas9 Variants for Gene Knockout and Transcriptional Modulation. Cell reports. V. 30. P. 2859.
  17. Li J., Yen C., Liaw D., Podsypanina K., Bose S., Wang S.I., Puc J., Miliaresis C., Rodgers L., McCombie R., Bigner S.H., Giovanella B.C., Ittmann M., Tycko B., Hibshoosh H., Wigler M.H., Parsons R. 1997. PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer. Science. V. 275. P. 1943.
  18. Parisotto M., Grelet E., El Bizri R., Metzger D. 2018a. Senescence controls prostatic neoplasia driven by PTEN loss. Mol. Cell Oncol. V. 6. P. 1511205.
  19. Parisotto M., Grelet E., El Bizri R., Dai Y., Terzic J., Eckert D., Gargowitsch L., Bornert J.-M., Metzger D. 2018b. PTEN deletion in luminal cells of mature prostate induces replication stress and senescence in vivo. J. Exper. Med. V. 215. P. 1749.
  20. Shlush L., Itzkovitz S., Cohen A., Rutenberg A., Berkovitz R., Yehezkel S., Shahar H., Selig S., Skorecki K. 2011. Quantitative digital in situ senescence-associated β-galactosidase assay. BMC Cell Biol. V. 12. P. 16.
  21. St-Germain M.E., Gagnon V., Mathieu I., Parent S., Asselin E. 2004a. Akt regulates COX-2 mRNA and protein expression in mutated-PTEN human endometrial cancer cells. Int. J. Oncol. V. 24. P. 1311.
  22. St-Germain M.E., Gagnon V., Parent S., Asselin E. 2004b. Regulation of COX-2 protein expression by Akt in endometrial cancer cells is mediated through NF-kappaB/IkappaB pathway. Mol. Cancer. V. 3. P. 7.
  23. Steelman L.S., Chappell W.H., Abrams S.L., Kempf R.C., Long J., Laidler P., Mijatovic S., Maksimovic-Ivanic D., Stivala F., Mazzarino M.C., Donia M., Fagone P., Malaponte G., Nicoletti F., Libra M., et al., 2011. Roles of the Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR pathways in controlling growth and sensitivity to therapy-implications for cancer and aging. Aging (Albany NY). V. 3. P. 192.
  24. Toropov A.L., Deryabin P.I., Shatrova A.N., Borodkina A.V. 2023. Oncogene-induced senescence is crucial antitumor defense mechanism of human endometrial stromal cells. Int. J. Mol. Sci. V. 24. P. 14089.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Подтверждение эффективности работы системы нокаута гена PTEN. К – контрольные эСК с несмысловой гидРНК; 1–3 – эСК, несущие систему нокаута с тремя различными гидРНК; а – экспрессия мРНК гена PTEN; значения экспрессии PTEN нормированы на уровень экспрессии референсного гена GAPDH. Представлены средние значения и их стандартные отклонения (n = 3, n – число повторов реакции); ** – отличия от контроля достоверны при – р < 0.01 по сравнению с контролем, тест ANOVA с поправкой по Тьюки; б – уровни экспрессии белка PTEN, выявленные с помощью специфических антител; справа указаны мол. массы; в качестве контроля нагрузки использовали GAPDH.

Скачать (115KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Снижение экспрессии PTEN приводит к запуску преждевременного старения в эСК. К – контрольные эСК с несмысловой гидРНК; а – кривые роста; б – средний размер клеток, определенный по прямому светорассеянию (СР); в – интенсивность автофлуоресценции (ИФ) клеток, отражающей накопление липофусциновых гранул; г – уровни фосфорилирования белков p53 (pp53) и Rb (pRb), а также экспрессии белка p21Waf1/Cip1 (p21), выявленные с помощью специфических антител; справа указаны молекулярные массы; в качестве контроля нагрузки использовали GAPDH; д, е – соответственно количественная оценка цитохимической окраски SA-β-Gal и микрофотографии; а–в – представлены средние значения и стандартные отклонения из трех повторов измерения; д – оценивали окраску 100 клеток; *** – отличия от контроля достоверны при р < 0.001 (t-тест Уэлча).

Скачать (312KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Изменения редокс-баланса и функционирования митохондрий в контрольных эСК с несмысловой гидРНК (К) и в эСК при нокауте гена PTEN; а – уровни внутриклеточных АФК, определенные по интенсивности флуоресценции (ИФ) красителя DCF; б – уровни митохондриальных АФК, установленные по ИФ красителя DHR123; в – изменение митохондриального мембранного потенциала, определенное по ИФ красителя JC-1. Представлены средние значения и их стандартные отклонения из трех повторов измерения; отличия от контроля достоверны при р < 0.001 (***) или р < 0.01 (**); t-тест Уэлча.

Скачать (131KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Активность сигнального пути PI3K/AKT в PTEN-регулируемой индукции старения эСК и его модуляция ингибитором LY в контрольных эСК с несмысловой гидРНК (К) и в эСК с нокаутом гена PTEN (Нок.). Клетки с нокаутом гена PTEN обрабатывали LY в концентрациях 5 мкМ (LY 5), 10 мкМ (LY 10) или 20 мкМ (LY 20) в течение 6 сут; а – уровни фосфорилирования AKT и Rb, а также и экспрессии белка p21Waf1/Cip1 (р21), выявленные с помощью специфических антител; справа указаны молекулярные массы; в качестве контроля нагрузки использовали GAPDH; б – кривые роста; в – средний размер клеток, определенный по прямому светорассеянию (СР); г – интенсивность автофлуоресценции (ИФ) клеток, отражающая накопление липофусциновых гранул. Представлены средние значения и их стандартные отклонения из трех повторов измерения; отличия от контроля достоверны при р < 0.001 (***) или р < 0.01(**), тест ANOVA с поправкой на множественные сравнения по Тьюки.

Скачать (424KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Ингибирование AKT предотвращает повышение активности SA-β-Gal в эСК нокаутом гена PTEN. Показаны контрольные эСК с несмысловой гидРНК (К), эСК с нокаутом гена PTEN (Нок.) и эСК с нокаутом гена PTEN, обработанные 20 мкМ LY (Нок. + LY20); а, б – соответственно микрофотографии эСК и количественная оценка цитохимической окраски SA-β-Gal; 6 сут после добавления ингибитора. Представлены средние значения и их стандартные отклонения (оценивали окраску 100 клеток); отличия от контроля достоверны при р < 0.001 (***); тест ANOVA с поправкой на множественные сравнения по Тьюки.

Скачать (152KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах