Enzymes of ADP-Heptose Biosynthesis as Targets for the Creation of Broad-Spectrum Antibacterial Drugs

封面

如何引用文章

全文:

详细

Solving the problem of multidrug resistance currently requires the development of non-standard approaches, since the potential for creating new antibiotics is almost exhausted. Controlling the metabolism of a pathogen in order to increase its susceptibility to antibacterial therapy is considered the most promising area of research for the creation of new combination drugs. In recent years, the number of studies devoted to investigation the role of the biosynthesis of the cell wall component ADP-heptose in the sensitivity of bacteria to antibiotics, as well as in the pathogenesis of bacterial infection, has increased. This review examines the main directions of scientific research in the field of use of ADP-heptose and its analogues in the treatment of bacterial infections. The exclusive role of ADP-heptose in the induction of an immune response is known, through the activation of the NF-κB signaling pathway and the synthesis of pro-inflammatory cytokines. Our latest work has shown that disruption of the synthesis of ADP-heptose and the efflux of sedoheptulose-7-phosphate from the pentose phosphate pathway induces a redox imbalance and completely disorganizes the metabolism of low molecular weight thiols such as hydrogen sulfide, cysteine, glutathione, which makes the bacterial cell extremely vulnerable to the action of antibiotics. We demonstrate that the hypersensitivity of ADP-heptose mutants to a wide range of antibiotics is explained by a new metabolic status rather than by changes in cell wall permeability. Thus, potential inhibitors of ADP-heptose biosynthesis can combine several positive qualities: an immunomodulatory effect and a powerful potentiating effect in combination with antibiotic therapy.

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Появление все новых и новых противомикробных препаратов с последующим их широкомасштабным и бесконтрольным использованием как в клинической практике, так и в быту, привело к возникновению большого количества резистентных штаммов патогенных микроорганизмов, осложняющих хирургическое вмешательство и лечение таких социально значимых заболеваний, как туберкулез, венерические болезни, иммунодефицитные состояния [1]. Синтез антибиотиков новых поколений, обладающих альтернативной химической структурой, не позволяет решить проблемы, связанные с множественной лекарственной устойчивостью, поскольку их применение неизбежно ведет к эволюции защитных механизмов бактериальной клетки: модификации ферментов-мишеней, изменению структуры клеточной стенки и систем транспорта антибиотика, активации процессов деградации молекул антибиотика [2]. В настоящее время практически полностью исчерпан спектр возможных механизмов действия веществ, обладающих потенциальной антибиотической активностью. Проблема антибиотикорезистентности требует принципиально нового подхода к ее решению. В последние годы появилось много публикаций, посвященных взаимосвязи метаболического статуса бактериальной клетки и ее чувствительности к антибактериальным препаратам [3–7]. Были открыты новые неспецифические системы защиты бактерий от действия антибиотиков с участием низкомолекулярных тиолов, таких как сероводород [7–10]. Наиболее перспективным подходом к модулированию чувствительности микроорганизмов к антибиотику вне зависимости от механизма его действия, с нашей точки зрения, выглядит поиск наиболее уязвимых точек в центральном метаболизме бактериальной клетки, воздействуя на которые можно значительно повысить эффективность антибактериальной терапии. Создание нового поколения метаболических адъювантов, не обладающих собственным антибиотическим действием, но значительно усиливающих действие уже существующих препаратов, позволит продлить клиническое использование известных антибиотиков.

Пентозофосфатный путь (ПФП) – один из ключевых метаболических процессов, служащий источником пентозофосфатов для синтеза всех нуклеотидов и нуклеиновых кислот, в том числе и пиридинового нуклеотида NADPH, необходимого для роста клеток и их защиты от окислительного стресса. В каскаде превращений неокислительной ветви ПФП в клетках разных микроорганизмов синтезируется уникальный семиуглеродный сахар – седогептулозо-7-фосфат (С7Ф) – предшественник широкого спектра вторичных метаболитов, включая компоненты клеточной стенки и антибиотики, в частности аминогликозидные [11]. В клетках грамотрицательных бактерий С7Ф является предшественником активированной ADP-глицероманногептозы (ADP-гептозы), важного компонента липополисахарида (ЛПС) клеточной стенки, соединяющего внутренний кор (2-кето-3-дезоксиоктанат, КДО) с поверхностным О-антигеном (рис. 1) [12, 13].

 

Рис. 1. Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий [14, лицензия Creative Commons Attribution (CC BY)]. ADP-гептоза является связующим звеном между полисахаридными цепями О-антигена и внутренним ядром (KДO) [13]. Структура ЛПС-мутантов, утративших АDP-гептозу, нестабильна из-за отсутствия отрицательно заряженных фосфатных групп на гептозных остатках, которые в норме стабилизируют структуру за счет взаимодействия с положительно заряженными ионами. Кроме того, клеточная стенка мутантов, утративших ADP-гептозу, характеризуется повышенной проницаемостью для гидрофобных соединений [15].

 

Нарушение синтеза ADP-гептозы приводит к формированию шероховатых колоний (так называемый фенотип “deep rough”). Клетки с этим фенотипом характеризуются повышенной чувствительностью к различным гидрофобным соединениям, в том числе к антибиотикам новобиоцину, актиномицину D, эритромицину и др. [12, 16]. Ранее ферменты биосинтеза ADP-гептозы рассматривали как потенциальные мишени для противомикробных препаратов [17–20], но отсутствие структурных данных для ферментов-гомологов из разных видов патогенов существенно затрудняет исследования и подбор оптимальных химических структур ингибиторов. Инактивация генов ферментов биосинтеза ADP-гептозы не оказывает существенного влияния на скорость роста бактериальной культуры, однако заметно повышает чувствительность к широкому спектру антибиотиков [14], поэтому адъюванты на основе ингибиторов ферментов синтеза ADP-гептозы могут использоваться в качестве новых препаратов, усиливающих действие традиционных антибиотиков.

БИОСИНТЕЗ ADP-ГЕПТОЗЫ: ФЕРМЕНТЫ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ

Предшественником активированной ADP-гептозы является семиуглеродный сахар С7Ф, синтезируемый в неокислительной ветви ПФП (рис. 2). Следует отметить, что образование С7Ф тесно связано с синтезом пентозофосфатов и их возвратом в гликолиз через неокислительную ветвь ПФП. Таким образом, нарушение оттока С7Ф может оказывать существенное влияние на метаболическое равновесие в ПФП.

 

Рис. 2. Структура ЛПС клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Этапы биосинтеза ADP-гептозы из седогептулозо-7-фосфата. Гены gmhA, hldE и gmhB не входят в состав rfa-оперонов. Последующие этапы сборки ЛПС осуществляются ферментами, гены которых объединены в два rfa-оперона. Геп I, II, III, IV — остатки АDP-гептозы. Ф — фосфат. КДО — 3-дезокси-D-манно-окт-2-улозоновая кислота.

 

У Escherichia coli гены, участвующие в синтезе и транслокации компонентов ЛПС, распределены по трем оперонам в локусе rfa (известном также, как waa), однако гены gmhA, hldE и gmhB, кодирующие ферменты (рис. 2), отвечающие за начальные этапы синтеза ADP-гептозы, в него не входят [21]. Седогептулозо-7-фосфатизомераза (GmhA) осуществляет первый этап превращения С7Ф в D-глицеро-D-манногептозо-7-фосфат. Экспрессия гена gmhA находится под положительным контролем ДНК-связывающего транскрипционного регулятора OmpR [22]. Регулон ompR представляет собой совокупность генов, участвующих в ответе на так называемый “стресс оболочки” (envelope stress response) и кодирующих неспецифические транспортеры, такие как порины OmpF, OmpC, OmpA, OmpX, а также системы белков-переносчиков AcrAB-TolC, играющих роль в возникновении множественной лекарственной устойчивости [23]. Антагонистом OmpR является регулятор CpxR, который, в свою очередь, тормозит экспрессию генов, снижая тем самым уровень соответствующих белков-транспортеров в мембране клетки и ограничивая синтез ЛПС [24]. HldE представляет собой бифункциональный фермент, N-концевой домен которого является рибокиназой, присоединяющей фосфат в первом положении к D-глицеро-D-манногептозо-7-фосфату с образованием D-глицеро-D-манногептозо-1,7-бифосфата. Фосфат в седьмом положении отщепляет фосфатаза Gmh B. С-концевой домен HldE функционирует как нуклеотидсахартрансфераза и присоединяет ADP к D-глицеро-D-манногептозо-1-фосфату с образованием ADP-D-глицеро-β-D-манно-гептозы. Регуляция экспрессии генов hldE и gmhB остается малоизученной.

Заключительный этап активации ADP-гептозы с последующим ее переносом на внутренний кор ЛПС осуществляется ферментами, гены которых объединены в первый rfa-оперон, состоящий из rfaD (или gmhD), waaF (или rfaF), waaC (или rfaC) и waaL (или rfaL). RfaD ADP-L-глицеро-D-манногептозо-6-эпимераза осуществляет превращение ADP-D-глицеро-β-D-манногептозы в ADP-L-глицеро-β-D-манногептозу. Гептозилтрансферазы I и II (WaaC и WaaF) переносят первый и второй остатки гептозы на КДО внутреннего кора ЛПС. Ген waaL кодирует лигазу, необходимую для прикрепления О-антигена или альтернативного М-антигена к внешнему кору ЛПС (рис. 2) [21]. Гены первого rfa-оперона находятся под положительным контролем двухкомпонентной системы ZraSR, включающей ZraS – мембраносвязанную сенсорную киназу, и ZraR – регулятор цитоплазматического ответа [25]. Роль системы Zra остается неопределенной: она участвует в ответе на стресс, вызванный действием двухвалентных металлов (в частности, Pb2+, Zn2+, Cu2+) [26], а также на стресс оболочки.

Второй оперон содержит гены waaQ (rfaQ) и waaU (rfaK), которые кодируют гептозилтрансферазы, добавляющие третий и четвертый остатки гептозы, соответственно (рис. 2), гены waaG (или rfaG), waaO (или rfaI) и waaJ (или rfaJ) кодируют глюкозилтрансферазы, участвующие в формировании наружного кора ЛПС из трех остатков глюкозы, waaB (rfaB) кодирует галактозилтрансферазу и добавляет остаток галактозы к первому остатку глюкозы наружного кора. Гены waaY (rfaY) и waaP (rfaP) кодируют киназы, ответственные за фосфорилирование гептоз, waaZ (rfaZ) участвует в прикреплении третьего остатка KДO во время биосинтеза ядра ЛПС и, наконец, ген waaS (rfaS), кодирует фермент, необходимый для прикрепления рамнозы к ядру ЛПС путем связывания с остатком KДO II [21]. Следует отметить, что наружный кор ЛПС не формируется при инактивации синтеза или транслокации гептозы, в результате возникает фенотип “deep rough”.

Короткий третий оперон waa содержит ген waaA, который кодирует трансферазу, добавляющую два остатка KДO к липиду A, и ген coaD, не участвующий в синтезе ЛПС [15, 27]. Определяющей особенностью ЛПС E. coli являются фосфорильные заместители в гептозных остатках ЛПС, необходимые для стабильности и структурной организации мембраны. Благодаря своим отрицательным зарядам, эти заместители обеспечивают соединение соседних молекул ЛПС, опосредованное двухвалентными катионами [28, 29].

РОЛЬ ADP-ГЕПТОЗЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Поверхность внешней мембраны грамотрицательных бактерий покрыта ЛПС, которые состоят из трех компонентов – липида А, олигосахаридов кора, обычно содержащих глюкозу, гептозу, галактозу, 2-кето-3-дезоксиоктонат (КДО) и высоковариабельный компонент О-антигена [30]. ЛПС действует как барьер, защищающий от крупных молекул и гидрофобных соединений окружающей среды. Молекулы ЛПС интегрированы в фосфолипидный слой наружной мембраны, они поддерживают правильную структурную организацию таких белков, как порины, осуществляющие неспецифический транспорт малых молекул и выступающие в качестве рецепторов бактериофагов [31].

ЛПС грамотрицательных бактерий непроницаем для различных токсинов, протеаз, лизоцима, детергентов и гидрофобных антибактериальных соединений. Компоненты ЛПС, высвобождающиеся в больших количествах при лизисе бактериальных клеток, по сути, являются эндотоксинами, вызывающими тяжелые осложнения бактериальных инфекций, в том числе сепсис. Недавно в опытах на Shigella flexneri, Salmonella enterica серовар typhimurium, птичьей патогенной E. coli (APEC) и Campylobacter jejuni установили, что длина ЛПС играет ключевую роль в способности возбудителей колонизировать кишечник, проникать в клетки хозяина, образовывать биопленки и в их подвижности [32–34]. Таким образом, ЛПС представляет собой фактор вирулентности, ответственный за патогенез бактериальной инфекции [35, 36]. Относительно недавно стали появляться данные о том, что ключевой промежуточный метаболит биосинтеза ЛПС, D-глицеро-β-D-манногептозо-1,7-бисфосфат, может активировать сигнальный путь транскрипционного регулятора NF-κB и индуцировать экспрессию генов провоспалительных цитокинов, хемокинов, молекул адгезии, запуская врожденный иммунный ответ [37, 38]. Обнаружено, что D-глицеро-β-D-манногептозо-1-фосфат (β-HMP) также может индуцировать TIFA-зависимую передачу сигналов NF-κB и воспалительный ответ, как и D-глицероβ-D-манногептозо-1,7-бисфосфат [39]. Однако оставалось неясным, является ли D-глицеро-β-D-манногептозо-1,7-бисфосфат истинным патогенассоциированным молекулярным паттерном (pathogen-associated molecular pattern, PAMP). Группа исследователей под руководством Шао показала, что ключевой промежуточный продукт биосинтеза ЛПС, ADP-гептоза, может транспортироваться в клетки млекопитающих и связываться с ALPK1 (альфа-киназой 1), что приводит к серии сильных иммунных реакций [40]. Предположили, что связывание ADP-гептозы с ALPK1 может вызвать конформационные изменения, которые приводят к фосфорилированию ее киназного домена и дальнейшей активации TIFA, что, в конечном итоге, активирует нижележащий путь NF-êB. Важно отметить, что в этой же работе показано, что D-глицеро-β-D-манногептозо-1,7-бисфосфат не может действовать непосредственно как РАМР. Вместо этого аденилаттрансфераза хозяйской клетки превращает его в ADP-гептозо-7-фосфат, который активирует ALPK1 в меньшей степени, чем ADP-гептоза. Более того, инъекции ADP-гептозы вызывали у мышей сильные воспалительные реакции, в то время как инъекции D-глицеро-β-D-манногептозо-1,7-бисфосфата не оказывали заметного эффекта на продукцию медиаторов воспаления. Участие во взаимодействии ADP-гептозы, а не других интермедиатов гептозного пути подтверждено in vitro путем скрининга библиотеки мутантов транспозона Y. pseudotuberculosis [40]. Установлено, что инактивация gmhA и hldE препятствует активации пути NF-êB, в то время как делеции gmhB и rfaD не влияли на активацию этого ядерного фактора [40]. Эти данные расширяют наши представления о бактериальных метаболитах как новом типе РАМР, обладающих большим потенциалом использования в разработке новых иммуномодуляторов и антивирулентных адъювантов.

РОЛЬ БИОСИНТЕЗА ADP-ГЕПТОЗЫ В РЕГУЛЯЦИИ РЕДОКС-СТАТУСА КЛЕТКИ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ

Согласно опубликованным данным, нарушение синтеза ADP-гептозы влечет за собой реорганизацию компонентов внешней мембраны клеточной стенки, приводя к изменению барьерной функции в сторону повышения проницаемости для гидрофобных соединений [41]. Однако метаболическим предшественником ADP-гептозы является С7Ф, образующийся в ПФП наряду с пентозофосфатами и генерацией восстановительных эквивалентов NADPH [42]. Таким образом, направление С7Ф из ПФП на синтез ЛПС может влиять на поддержание восстановительного потенциала NADPH и стрессоустойчивости бактериальной клетки в целом.

В наших работах мы сосредоточились на изучении фенотипа и метаболического статуса штаммов с инактивированными генами биосинтеза ADP-гептозы (gmhA, hldE, gmhB, rfaD), а также дефектным по генам транслоказ (waaC и waaF), отвечающих за формирование гептозного мостика, связывающего внутренний и внешний кор ЛПС (рис. 2). Штаммы ∆gmhA, ∆hldE, ∆rfaD и ∆waaC демонстрировали высокую чувствительность к широкому спектру антибиотиков и резкое изменение параметров центрального метаболизма (снижение пула NADPH, АТР, низкомолекулярных тиолов). Интересно, что мутант ∆waaF оказался значительно менее чувствительным к тестируемым антибиотикам, из чего следует, что добавление второго остатка гептозы к КДО, по-видимому, не имеет столь драматических последствий. Штамм с мутацией ∆gmhB практически не отличается от штамма дикого типа. Это связано с тем, что делеция гена gmhB не приводит к полному нарушению синтеза ADP-гептозы, поскольку клетки E. сoli содержат гомологичные ферменты. Продукт гена gmhB (D-глицеро-β-D-манногептозо-1,7-бисфосфат-7-фосфатаза) представляет собой фермент, принадлежащий к подклассу фосфатаз. В клетках E. coli присутствует несколько подобных ферментов, например, имидазолглицеринфосфатдегидратаза/гистидинолфосфатаза HisB, участвующая в биосинтезе гистидина. Согласно опубликованным данным, активность этих ферментов может компенсировать дефект делеции gmhB [20]. Кроме того, изменения редокс-статуса и других измеряемых параметров у этих мутантов (∆waaF, ∆gmhB) были не столь значительными, как у штаммов с высокой чувствительностью к антибиотикам (∆gmhA, ∆hldE, ∆rfaD и ∆waaC).

Ранее мы показали, что инактивация генов gmhA, hldE, rfaD и waaC наряду с утратой ADP-гептозы провоцирует развитие мощного окислительного стресса, сопровождающегося нарушением гомеостаза низкомолекулярных тиолов, сероводорода, цистеина и глутатиона, которые играют важную роль в стрессоустойчивости клеток [7, 9, 43]. Ограничение метаболизма цистеина (∆cysB и ∆cysE) и ингибирование синтеза глутатиона (∆gshAB) влияют на редокс-статус исследуемых мутантов и приводят не к ожидаемому повышению, а к снижению чувствительности мутанта ∆gmhA к антибиотикам. В то же время блокирование экспорта цистеина (∆eamA) или увеличение импорта (Ptet-tcyP) цистина, являющего окисленной формой цистеина, приводит к еще большей чувствительности клеток с делецией gmhA к антибиотикам [43]. Выявлена корреляция между ростом чувствительности к антибиотикам и повышением доли окисленного глутатиона (GSSG) [44]. Снижение пула восстановительных эквивалентов NADPH в мутантах, утративших ADP-гептозу, ведет к возрастанию уровня окисленного глутатиона и редокс-модификации белков, следствием чего может стать изменение метаболического статуса клетки [44]. Таким образом, установлено, что весь метаболизм низкомолекулярных тиолов в “deep rough” мутантах направлен на обеспечение глутатионилирования белков [45], которое не только защищает белки от необратимого окисления, но и может существенно изменять их функционирование [46]. В ходе проведенных исследований обнаружено, что чувствительность мутантов ΔgmhA, утративших ADP-гептозу, может быть супрессирована активацией биосинтеза пуринов (рис. 3). Оказалось, что конститутивная экспрессия генов purR-регулона, включая серин-глициновый путь (рис. 3), приводит к супрессии чувствительности к антибиотикам и окислителям, а также к нормализации пула восстановительных эквивалентов NADPH, активности системы SoxRS защиты от окислительного стресса и к снижению уровня окислительной модификации белков [44].

 

Рис. 3. Биосинтез пуринов как фактор, модулирующий чувствительность мутантов по ADP-гептозе. а – Метаболическая схема пентозофосфатного пути, показывающая взаимосвязь процессов синтеза предшественника ADP-гептозы – седогептулозо-7-фосфата, рибозо-5-фосфата и восстановления NADPH. Репрессор PurR регулирует синтез пуринов, начиная с образования фосфорибозилпирофосфата, а также серин-глициновый путь (ген glyA), который наряду с окислительной ветвью пентозофосфатного пути является источником генерации NADPH. б – Инактивация синтеза ADP-гептозы приводит к фенотипу “deep rough”, гиперчувствительности к антибиотикам и окислительному стрессу. Активация биосинтеза пуринов в бактериальных клетках с нарушенным синтезом ADP-гептозы подавляет чувствительность к антибиотикам и окислительный стресс [44], лицензия Creative Commons Attribution (CC BY). Г6Ф – глюкозо-6-фосфат, Ф6Ф – фруктозо-6-фосфат, 3-ФГА – глицеральдегид-3-фосфат, Ф1,6ДФ – фруктозо-1,6-дифосфат, ДГАФ – дигидроксиацетонфосфат, Ру5Ф – рибулозо-5-фосфат, Р5Ф – рибозо-5-фосфат, Кси5Ф – ксилозо-5-фосфат, С7Ф – седогептулозо-7-фосфат, ТГФ –тетрагидрофолат, ЦТК – цикл трикарбоновых кислот.

 

Нам удалось показать, что высокую чувствительность “deep-rough” мутантов нельзя объяснить исключительно нарушением барьерной функции ЛПС. Наибольшую чувствительность к антибиотикам и изменения в центральном метаболизме демонстрировали мутанты по генам биосинтеза (gmhA, hldE, rfaD) и мутант по транслоказе первого остатка гептозы (waaC). Нарушение синтеза ADP-гептозы, по-видимому, провоцирует усиление центрального метаболизма, включая цикл трикарбоновых кислот. На фоне делеции gmhA существенно возрастает уровень редокс-чувствительной глюконеогенной альдолазы FbaB [44]. Изменение активности ферментов путем глутатионилирования играет важную роль в регуляции биосинтетических процессов [47]. Увеличение активности альдолазы FbaB у мутантов gmhA на фоне повышенного уровня глутатионилирования белков свидетельствует о значительном перераспределении центральных метаболических потоков.

СОЗДАНИЕ ИНГИБИТОРОВ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ СИНТЕЗА ADP-ГЕПТОЗЫ

Ферменты биосинтеза ADP-гептозы давно вызывают интерес в качестве мишеней для создания адьювантов, повышающих эффективность антибактериальной терапии [17, 19, 20, 48]. Следует отметить, что у клинически значимых грамотрицательных микроорганизмов ферменты биосинтеза ADP-гептозы обладают высокой степенью гомологии [18, 20]. Однако создать клинически значимые, эффективные, биодоступные ингибиторы до сих пор не удалось, что, по-видимому, связано с недостатком данных о структуре этих ферментов у различных патогенов. Сами ингибиторы биосинтеза ADP-гептозы не должны обладать противомикробной активностью, поскольку инактивация генов этого биосинтетического пути не влияет существенно на скорость роста бактериальной культуры [14] и позволяет избежать появления новых резистентных форм в процессе их клинического и бытового использования.

Известны попытки создания ингибиторов первых двух ферментов биосинтеза ADP-гептозы (GmhA и HldE) на основе аналогов D-глицеро-D-манногептозо-7-фосфата. Обнаружено, что GmhA и HldE чрезвычайно чувствительны к структурным модификациям в положениях 6 и 7 гептозного каркаса. Эпимерный аналог гептозо-7-фосфата, имеющий конфигурацию D-глюкопиранозы, оказался лучшим ингибитором обоих ферментов, но также и единственной молекулой этого ряда, которая могла ингибировать GmhA (IC50 = 34 мкМ) и HldE (IC50 = 9.4 мкМ) в микромолярном диапазоне концентраций [19]. Еще одной попыткой стала работа, посвященная изучению ингибирующей активности ряда фосфорил- и фосфонилзамещенных производных, содержащих гидроксаматный фрагмент, рибозы или гексозы, направленных на связывание иона Zn2+ в активном сайте фермента Gmh A. Некоторые из этих соединений оказались наномолярными ингибиторами Gmh A. Они лишены цитотоксичности в отношении клеток гепатокарциномы HepG2 и собственной антибактериальной активности, но при этом предотвращают гептозилирование ЛПС in vitro у Enterobacteriaceae, а также усиливают действие эритромицина и рифампицина на клетки E. coli дикого типа [48]. Результатом высокопроизводительного скрининга (HTS) 40000 соединений из внутренней библиотеки Mutabilis с использованием люминесцентного анализа HldE-киназной активности E. coli стало открытие ингибиторов 1 и 2 с IC50 в диапазоне 50–70 мкМ. Показано, что эти соединения являются конкурентоспособными и обратимыми ингибиторами по отношению к АТР в реакции, катализируемой киназой Hld E. Исследование взаимосвязи структуры и активности соединений этого ряда привело к значительному улучшению эффективности соединения 5х, имеющего IC50 = 0.11 мкМ [18]. Соединения этого ряда были также способны ингибировать HldA Neisseria meningitidis, гомолог киназного домена HldE E. coli, но полностью неактивны в отношении рибокиназы E. coli. Учитывая сходство между HldE E. coli и HldA N. meningitidis, соединения этой серии, скорее всего, селективны в отношении HldE/HldA грамотрицательных бактерий [18]. В качестве возможных мишеней для создания ингибиторов рассматривали также гептозилтрансферазы I и II (WaaC и WaaF) [48]. Особенно интересным представляется обнаружение ингибирующего эффекта аминогликозидных антибиотиков на эти ферменты. Экспериментально подтверждено, что несколько аминогликозидов это первые в своем классе наномолярные ингибиторы гептозилтрансфераз, причем у лучшего ингибитора величина Ki = 600 ± 90 нМ [49]. Таким образом, ингибирование рибосомы не является единственным и основным механизмом действия аминогликозидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассмотренные данные свидетельствуют о том, что ADP-гептоза представляет собой уникальный фактор вирулентности грамотрицательных патогенов, обладающий иммуномодулирующими свойствами. Терапия инфекций, вызванных бактериями с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных в группу ESKAPE (Pseudomonas. aeruginosa, Klebsiella рneumoniae и Acinetobacter baumannii), зачастую требует применения высокотоксичного антибиотика — колистина, мишенью которого является липид А [50]. Комбинированная терапия ацинетобактерной (A. baumannii) инфекции колистином в сочетании с дорипинемом снижала уровень трех метаболитов ПФП, а именно С7Ф, D-рибозо-5-фосфата и D-эритрозо-4-фосфата [51]. Результаты упомянутых исследований показывают, что эти антибиотики мешают биосинтезу ADP-гептозы у A. baumannii путем ингибирования ПФП. Нами показано, что инактивация синтеза ADP-гептозы в клетках E. coli влечет за собой кардинальную перестройку центрального метаболизма, в том числе ПФП, приводя к снижению восстановительных эквивалентов NADPH и уровня АТР, необходимых для осуществления анаболических процессов при росте и делении. Кроме того, клетки, утратившие ADP-гептозу, не способны генерировать сероводород, важный антибиотикопротективный фактор [14]. Блокирование пути биосинтеза ADP-гептозы провоцирует развитие мощного окислительного стресса, сопровождающегося полной дезорганизацией метаболизма тиолов, выражающейся в тотальном глутатионилировании белков и изменении активности редокс-зависимых ферментов центрального метаболизма [43]. Таким образом, ферменты биосинтеза ADP-гептозы представляют собой перспективные мишени для создания антивирулентных адъювантов, обладающих как иммуномодулирующими, так и потенцирующими действие антибиотиков свойствами. Следует отметить, что несмотря на высокую гомологию ферментов данного метаболического пути у грамотрицательных бактерий, еще недостаточно структурных данных для создания высокоселективных и нетоксичных ингибиторов, что представляется важным направлением дальнейших исследований.

Авторы выражают благодарность Е.А. Нудлеру, В.А. Митькевичу и А.А. Макарову за ценные замечания при написании и обсуждении настоящего обзора.

Работа поддержана Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (Контракт в системе электронный бюджет № 075-10-2021-113, ID проекта: RF—193021X0001).

Настоящая работа выполнена без использования людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

×

作者简介

T. Seregina

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: tatyana.s82@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

I. Petrushanko

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: tatyana.s82@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

K. Lobanov

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: tatyana.s82@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

R. Shakulov

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: tatyana.s82@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

A. Mironov

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: tatyana.s82@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

参考

  1. Bharadwaj A., Rastogi A., Pandey S., Gupta S., Sohal J.S. (2022) Multidrug-resistant bacteria: their mechanism of action and prophylaxis. BioMed. Res. Int. 2022, 5419874. https://doi.org/10.1155/2022/5419874
  2. Darby E.M., Trampari E., Siasat P., Gaya M.S., Alav I., Webber M.A., Blair J.M.A. (2023) Molecular mechanisms of antibiotic resistance revisited. Nat. Rev. Microbiol. 21, 280–295. https://doi.org/10.1038/s41579-022-00820-y
  3. Kohanski M.A., Dwyer D.J., Hayete B., Lawrence C.A., Collins J.J. (2007) A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797–810. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.06.049
  4. Lobritz M.A., Belenky P., Porter C.B.M., Gutierrez A., Yang J.H., Schwarz E.G., Dwyer D.J., Khalil A.S., Collins J.J. (2015) Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 8173–8180. https://doi.org/10.1073/pnas.1509743112
  5. Dwyer D.J., Belenky P.A., Yang J.H., MacDonald I.C., Martell J.D., Takahashi N., Chan C.T., Lobritz M.A., Braff D., Schwarz E.G., Ye J.D., Pati M., Vercruysse M., Ralifo P.S., Allison K.R., Khalil A.S., Ting A.Y., Walker G.C., Collins J.J. (2014) Antibiotics induce redox-related physiological alterations as part of their lethality. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111, E2100–E2109. https://doi.org/10.1073/pnas.1401876111
  6. Stokes J.M., Lopatkin A.J., Lobritz M.A., Collins J.J. (2019) Bacterial metabolism and antibiotic efficacy. Cell Metabolism. 30, 251–259. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2019.06.009
  7. Shatalin K., Shatalina E., Mironov A., Nudler E. (2011) H2S: a universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334, 986–990. https://doi.org/10.1126/science.1209855
  8. Mironov A., Seregina T., Nagornykh M, Luhachack L., Korolkova L., Errais Lopes L., Kotova V., Zavilgelsky G., Shakulov R., Shatalin R., Nudler E. (2017) A mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 114, 6022–6027. https://doi.org/10.1073/pnas.1703576114
  9. Mironov A., Seregina T., Shatalin K., Nagornykh M., Shakulov R., Nudler E. (2020) CydDC functions as a cytoplasmic cystine reductase to sensitize Escherichia сoli to оxidative stress and aminoglycosides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 117, 23565–53570. https://doi.org/10.1073/pnas.2007817117
  10. Серегина Т., Лобанов К., Шакулов Р., Миронов А. (2022) Повышение бактерицидного эффекта антибиотиков путем ингибирования ферментов, вовлеченных в генерацию сероводорода у бактерий. Молекуляр. биология. 57, 697–709.
  11. Sprenger G.A. (1995) Genetics of pentose-phosphate pathway enzymes of Escherichia coli K-12. Arch. Microbiol. 164, 324–330. https://doi.org/10.1007/BF02529978
  12. Kneidinger B., Marolda C., Graninger M., Zamyatina A., McArthur F., Kosma P., Valvano M.A., Messner P. (2002) Biosynthesis pathway of ADP-l-glycero-β-D-manno-heptose in Escherichia coli. J. Bacteriol. 184, 363–369. https://doi.org/10.1128/JB.184.2.363-369.2002
  13. Huang K.C., Mukhopadhyay R., Wen B., Gitai Z., Wingreen N.S. (2008) Cell shape and cell-wall organization in gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 19282–19287. https://doi.org/10.1073/pnas.0805309105
  14. Seregina T.A., Petrushanko I.Yu., Shakulov R.S., Zaripov P.I., Makarov A.A., Mitkevich V.A., Mironov A.S. (2022) The inactivation of LPS biosynthesis genes in E. сoli cells leads to oxidative stress. Cells. 11. https://doi.org/10.3390/cells11172667
  15. Schnaitman C.A., Klena J.D. (1993) Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. Microbiol. Rev. 57, 655–682. https://doi.org/10.1128/mr.57.3.655-682.1993
  16. Taylor P.L., Blakely K.M., de Leon G.P., Walker J.R., McArthur F., Evdokimova E., Zhang K., Valvano M.A., Wright G.D., Junop M.S. (2008) Structure and function of sedoheptulose-7-phosphate isomerase, a critical enzyme for lipopolysaccharide biosynthesis and a target for antibiotic adjuvants. J. Biol.Chem. 283. 2835–2845. https://doi.org/10.1074/jbc.M706163200
  17. Desroy N., Denis A., Oliveira C., Atamanyuk D., Briet S., Faivre F., LeFralliec G., Bonvin Y., Oxoby M., Escaich S., Floquet S., Drocourt E., Vongsouthi V., Durant L., Moreau F., Verhey T.B., Lee T.W., Junop M.S., Gerusz V. (2013) Novel HldE-K inhibitors leading to attenuated gram negative bacterial virulence. J. Med. Chem. 56, 1418–1430. https://doi.org/ 10.1021/jm301499r
  18. Desroy N., Moreau F., Briet S., Fralliec G.L., Floquet S., Durant L., Vongsouthi V., Gerusz V., Denis A., Escaich S. (2009) Towards gram-negative antivirulence drugs: new inhibitors of HldE kinase. Bioorg. Med. Chem. 17, 1276–1289. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2008.12.021
  19. Durka M., Tikad A., Périon R., Bosco M., Andaloussi M., Floquet S., Malacain E., Moreau F., Oxoby M., Gerusz V., Vincent S.P. (2011) Systematic synthesis of inhibitors of the two first enzymes of the bacterial heptose biosynthetic pathway: towards antivirulence molecules targeting lipopolysaccharide biosynthesis. Chemistry. 17, 11305–11313. https://doi.org/10.1002/chem.201100396
  20. Valvano M.A. (1999) Biosynthesis and genetics of ADP-heptose. J. Endotoxin Res. 5, 90–95. https://doi.org/10.1.177/09680519990050010901
  21. Pagnout C., Sohm B., Razafitianamaharavo A., Caillet C., Offroy M., Leduc M., Gendre H., Jomini S., Beaussart A., Bauda P., Duval J.F.L. (2019) Pleiotropic effects of rfa-gene mutations on Escherichia coli envelope properties. Sci. Rep. 9, 9696. https://doi.org/10.1038/s41598-019-46100-3
  22. Shimada T., Takada, H., Yamamoto K., Ishihama A. (2015) Expanded roles of two-component response regulator OmpR in Escherichia сoli: genomic SELEX search for novel regulation targets. Genes to Cells. 20, 915–931. https://doi.org/10.1111/gtc.12282
  23. Fu D., Wu J., Gu Y., Li Q., Shao Y., Feng H., Song X., Tu J., Qi K. (2022) The response regulator OmpR contributes to the pathogenicity of avian pathogenic Escherichia сoli. Poultry Sci. 101, 101757. https://doi.org/10.1016/j.psj.2022.101757
  24. Jubelin G., Vianney A., Beloin C., Ghigo J.M., Lazzaroni J.C., Lejeune P., Dorel C. (2005) CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia сoli. J. Bacteriol. 187, 2038–2049. https://doi.org/10.1128/jb.187.6.2038-2049.2005
  25. Rome K., Borde C., Taher R., Cayron J., Lesterlin C., Gueguen E., De Rosny E., Rodrigue A. (2018) The two-component system ZraPSR is a novel ESR that contributes to intrinsic antibiotic tolerance in Escherichia сoli. J. Mol. Biol. 430, 4971–4985. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2018.10.021
  26. Leonhartsberger S., Huber A., Lottspeich F., Böck A. (2001) The hydH/G genes from Escherichia сoli code for a zinc and lead responsive two-component regulatory system. J. Mol. Biol. 307, 93–105. https://doi.org/10.1006/jmbi.2000.4451
  27. Wang X., Quinn P.J. (2010) Lipopolysaccharide: biosynthetic pathway and structure modification. Progress Lipid Res. 49, 97–107. https://doi.org/10.1016/j.plipres.2009.06.002
  28. Nikaido H., Vaara M. (1985) Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Microbiol. Rev. 49, 1–32. https://doi.org/10.1128/mr.49.1.1-32.1985
  29. Yethon J.A., Vinogradov E., Perry M.B., Whitfield C. (2000) Mutation of the lipopolysaccharide core glycosyltransferase encoded by waag destabilizes the outer membrane of Escherichia сoli by interfering with core phosphorylation. J. Bacteriol. 182, 5620–5623. https://doi.org/10.1128/jb.182.19.5620-5623.2000
  30. Beveridge T.J. (1999) Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725–4733. https://doi.org/10.1128/jb.181.16.4725-4733.1999
  31. Achouak W., Heulin T., Pagès J.M. (2001) Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol. Lett. 199, 1–7. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2001.tb10642.x
  32. Nickerson K.P., Chanin R.B., Sistrunk J.R., Rasko D.A., Fink P.J., Barry E.M., Nataro J.P., Faherty C.S. (2017) Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect. Immun. 85, 1–18. https://doi.org/10.1128/iai.01067-16
  33. Mohammed Jajere S.A (2019) Review of Salmonella еnterica with particular focus on the pathogenicity and virulence factors, host specificity and adaptation and antimicrobial resistance including multidrug resistance. Veterinary World. 12, 504–521. https://doi.org/10.14202/vetworld.2019.504-521
  34. Joseph J., Zhang L., Adhikari P., Evans J.D., Ramachandran R. (2023) Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) in broiler breeders: an overview. Pathogens. 12. https://doi.org/10.3390/pathogens12111280
  35. Matsuura M. (2013) Structural modifications of bacterial lipopolysaccharide that facilitate gram-negative bacteria evasion of host innate immunity. Front. Immunol. 4, 109. https://doi.org/10.3389/fimmu.2013.00109
  36. Zhao Y., Shao F. (2015) Diverse mechanisms for inflammasome sensing of cytosolic bacteria and bacterial virulence. Curr. Opin. Microbiol. 29, 37–42. https://doi.org/10.1016/j.mib.2015.10.003
  37. Hu X.Y., Yang C., Wang P., Zhang G.L. (2018) ADP-heptose: a new innate immune modulator. Carbohydrate Res. 473. https://doi.org/10.1016/j.carres.2018.12.011
  38. Liu T., Zhang L., Joo D., Sun S.C. (2017) NF-κB signaling in inflammation. Signal Transduct. Targeted Therapy. 2, 17023. https://doi.org/10.1038/sigtrans.2017.23
  39. Adekoya I.A., Guo C.X., Gray-Owen S.D., Cox A.D., Sauvageau J. (2018) D-glycero-β-D-manno-heptose 1-phosphate and D-glycero-β-D-manno-heptose 1,7-biphosphate are both innate immune agonists. J. Immunol. 201, 2385–2391. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1801012
  40. Zhou P., She Y., Dong N., Li P., He H., Borio A., Wu Q., Lu S., Ding X., Cao Y., Xu Y., Gao W., Dong M., Ding J., Wang D.C., Zamyatina A., Shao F. (2018) Alpha-kinase 1 is a cytosolic innate immune receptor for bacterial ADP-heptose. Nature. 561, 122–126. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0433-3
  41. Pagnout C., Sohm B., Razafitianamaharavo A., Caillet C., Offroy M., Leduc M., Gendre H., Jomini S., Beaussart A., Bauda P., Duval J.F.L. (2019) Pleiotropic effects of rfa-gene mutations on Escherichia coli envelope properties. Sci. Rep. 9, 9696. https://doi.org/10.1038/s41598-019-46100-3
  42. Krüger A., Grüning N.M., Wamelink M.M., Kerick M., Kirpy A., Parkhomchuk D., Bluemlein K., Schweiger M.R., Soldatov A., Lehrach H., Jakobs C., Ralser M. (2011) The pentose phosphate pathway is a metabolic redox sensor and regulates transcription during the antioxidant response. Antioxidants & Redox Signal. 15, 311–324. https://doi.org/10.1089/ars.2010.3797
  43. Серегина Т.А., Петрушанко И.Ю., Зарипов П.И., Кулешова Ю.Д., Лобанов К.В., Шакулов Р.С., Митькевич В.А., Макаров А.А., Миронов А.С. (2023) Низкомолекулярные тиолы как фактор, усиливающий чувствительность мутантов Еscherichia coli с нарушенным синтезом ADP-гептозы к антибиотикам. Молекуляр. биология. 57, 995–1005.
  44. Seregina T.A., Petrushanko I.Yu., Zaripov P.I., Shakulov R.S., Sklyarova A.S., Mitkevich V.A., Makarov A.A., Mironov A.S. (2023) Activation of purine biosynthesis suppresses the sensitivity of E. coli GmhA mutant to antibiotics. Int. J. Mol. Sci. 24. https://doi.org/10.3390/ijms242216070
  45. Mieyal J.J., Chock P.B. (2012) Posttranslational modification of cysteine in redox signaling and oxidative stress: focus on S-glutathionylation. Antioxid. Redox Signal. 16, 471–475. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4454
  46. Chai Y.C., Mieyal J. (2023) Glutathione and glutaredoxin – key players in cellular redox homeostasis and signaling. Antioxidants. 12, 1553. https://doi.org/10.3390/antiox12081553
  47. Xiong Y., Uys J.D., Tew K.D., Townsend D.M. (2011) S-glutathionylation: from molecular mechanisms to health outcomes. Antioxid. Redox Signal. 15, 233–270. https://doi.org/10.1089/ars.2010.3540
  48. Moreau F., Desroy N., Genevard J.M., Vongsouthi V., Gerusz V., Le Fralliec G., Oliveira C., Floquet S., Denis A., Escaich S., Wolf K., Busemann M., Aschenbrenner A. (2008) Discovery of new gram-negative antivirulence drugs: structure and properties of novel E. coli WaaC inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 18, 4022–4026. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2008.05.117
  49. Milicaj J., Hassan B.A., Cote J.M., Ramirez-Mondragon C.A., Jaunbocus N., Rafalowski A., Patel K.R., Castro C.D., Muthyala R., Sham Y.Y., Taylor E.A. (2022) Discovery of first-in-class nanomolar inhibitors of heptosyltransferase I reveals a new aminoglycoside target and potential alternative mechanism of action. Sci. Rep. 12, 7302. https://doi.org/10.1038/s41598-022-10776-x
  50. Velkov T., Roberts K., Nation R., Thompson P., Li J. (2013) Pharmacology of polymyxins: new insights into an ’old class of antibiotics. Future Microbiol. 8, 711–724. https://doi.org/10.2217/fmb.13.39
  51. Mahamad Maifiah M., Creek D., Nation R., Forrest A., Tsuji B., Velkov T., Li J. (2017) Untargeted metabolomics analysis reveals key pathways responsible for the synergistic killing of colistin and doripenem combination against Аcinetobacter baumannii. Sci. Rep. 7, 45527. https://doi.org/10.1038/srep45527

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig. 1. Cell wall structure of Gram-negative bacteria [14, Creative Commons Attribution (CC BY) licence]. ADP-heptose is the link between the polysaccharide chains of the O-antigen and the inner nucleus (ILC) [13]. The structure of LPS mutants that have lost ADP-heptose is unstable due to the absence of negatively charged phosphate groups on heptose residues, which normally stabilise the structure through interaction with positively charged ions. In addition, the cell wall of mutants that have lost ADP-heptose is characterised by increased permeability to hydrophobic compounds [15].

下载 (224KB)
索引源数据
3. Fig. 2. Structure of LPS of the cell wall of Gram-negative bacteria. Stages of ADP-heptose biosynthesis from sedoheptulose-7-phosphate. The gmhA, hldE, and gmhB genes are not part of the rfa operon. The subsequent steps of LPS assembly are carried out by enzymes whose genes are combined into two rfa operons. Hep I, II, III, IV are ADP-heptose residues. F - phosphate. CDO - 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid.

下载 (719KB)
索引源数据
4. Fig. 3. Purine biosynthesis as a factor modulating the sensitivity of ADP-heptose mutants. a - Metabolic scheme of the pentose phosphate pathway showing the interrelation of the processes of synthesis of ADP-heptose precursor - sedoheptulose-7-phosphate, ribose-5-phosphate and NADPH reduction. The PurR repressor regulates purine synthesis, starting with the formation of phosphoribosyl pyrophosphate, as well as the serine-glycine pathway (glyA gene), which along with the oxidative branch of the pentose phosphate pathway is the source of NADPH generation. b - Inactivation of ADP-heptose synthesis leads to a ‘deep rough’ phenotype, hypersensitivity to antibiotics and oxidative stress. Activation of purine biosynthesis in bacterial cells with impaired ADP-heptose synthesis suppresses antibiotic sensitivity and oxidative stress [44], Creative Commons Attribution (CC BY) licence. G6F - glucose-6-phosphate, F6F - fructose-6-phosphate, 3-FGA - glyceraldehyde-3-phosphate, F1,6DF - fructose-1,6-diphosphate, DGAP - dihydroxyacetone phosphate, Ru5F - ribulose-5-phosphate, R5F - ribose-5-phosphate, Xi5F - xylose-5-phosphate, C7F - sedoheptulose-7-phosphate, TGF - tetrahydrofolate, CTC - tricarboxylic acid cycle.

下载 (560KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».