Секреты выживания Neisseria gonorrhoeae: генетическая изменчивость, патогенез и лекарственная устойчивость

Полный текст

Сокращения: C3BP (C3b-binding protein) – C3b-связывающий белок; C4BP (C4b-binding protein) – C4b-связывающий белок; CEACAM (carcinoembryonic antigen-related cellular adhesion molecules) – молекула клеточной адгезии, связанная с раковоэмбриональным антигеном; cgMLST (core genome multi-locus sequence typing) – коргеномная система мультилокусного типирования; CREE (correia repeat enclosed elements) – повторяющиеся вложенные элементы кореи; GGI (gonococcal genetic island) – генетический остров гонококка; HSPG (heparan sulfate proteoglycan) – гепарансульфатпротеогликан; IS (insertion sequence) – инсерционная последовательность; LOS (lipooligosaccharide) – липоолигосахарид; MLST (multilocus sequence typing) – мультилокусное типирование микроорганизмов; MME (minimal mobile elements) – минимальный мобильный элемент; NG-MAST (N. gonorrhoeae multi antigen sequence typing) – мультиантигенное типирование N. gonorrhoeae; NG-STAR (Neisseria gonorrhoeae sequence typing for antimicrobial resistance) – типирование последовательностей для определения устойчивости N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам; NIME (neisserial intergenomic mosaic elements) – нейсериальный межгеномный мозаичный элемент; NLR (NOD-like receptors) – NOD-подобный рецептор; PAMP (pathogen-associated molecular patterns) – патогенассоциированные молекулярные паттерны; RCA (regulator of complement activation) – регулятор активации комплемента; ROS (reactive oxygen species) – активные формы кислорода; SREC (scavenger receptor еxpressed in endothelial cells) – рецепторы-мусорщики, экспрессируемые в эндотелиальных клетках; T4SS (type IV secretion system) – система секреции типа IV; TLR (Toll-like receptors) – Тоll-подобный рецептор; АМП – антимикробный препарат; ГTГ – горизонтальный транспорт генов; МПК – минимальная концентрация, подавляющая 100% микроорганизмов.

ВВЕДЕНИЕ

Neisseria gonorrhoeae – грамотрицательная β-протеобактерия, принадлежащая к роду Neisseria. N. gonorrhoeae инфицирует преимущественно эпителий слизистой оболочки урогенитального тракта, а также других органов, таких как прямая кишка, глотка и конъюнктива [1]. В исключительных случаях N. gonorrhoeae способна вызывать диссеминированные гонококковые инфекции (ДГИ) и быть причиной септицемии, артрита, эндокардита, фарингита, тонзиллита, стоматита, паротита, мастита и теносиновита [2]. До 40% случаев заболевания у мужчин [3] и до 50% случаев гонококковой инфекции у женщин [4] могут оставаться бессимптомными, что приводит к невыявленной и невылеченной инфекции, которая, в свою очередь, может повлечь за собой воспалительные заболевания органов малого таза, бесплодие у женщин и эпидидимит у мужчин, а также другие осложнения. В мире ежегодно регистрируют более 80 млн случаев гонореи [5].

Хромосома N. gonorrhoeae состоит из 2.2 млн. п. н. В состав внехромосомных элементов входит криптоплазмида размером 4.2 т. п. н., возможно присутствие плазмиды pbla_TEM (7.5 т. п. н.) и конъюгативной плазмиды (42 т. п. н.). Клетка гонококка содержит в среднем три генетически идентичных копии хромосомы [6, 7]. Благодаря естественной компетентности во всех фазах роста, N. gonorrhoeae осуществляет интенсивный горизонтальный транспорт генов (ГТГ), в том числе ассоциированных с патогенезом и устойчивостью к антимикробным препаратам [8–10]. Значительная доля изолятов N. gonorrhoeae имеет гонококковый генетический остров (GGI), кодирующий систему секреции IV типа (T4SS), способную выбрасывать оцДНК во внеклеточную среду. Эта ДНК участвует в ГТГ и вносит вклад в формирование биопленок в качестве структурного компонента на начальных этапах инфекции [11]. Для гонококков и других микроорганизмов рода Neisseria, не имеющих GGI, передача ДНК может осуществляться с помощью везикул внешней мембраны (OMV), а также посредством автолиза, хотя и с меньшей эффективностью [12]. Механизмы горизонтального переноса являются основным фактором быстрого формирования и распространения детерминант устойчивости к антибиотикам в популяции N. gonorrhoeae, что стало проблемой для мирового здравоохранения.

Высокая генетическая изменчивость N. gonorrhoeae привела к тому, что для каждого антимикробного препарата, применяемого в терапии гонококковой инфекции, обнаружены устойчивые изоляты [13]. Все чаще встречаются мультирезистентные штаммы, способные одновременно формировать устойчивость к большинству применяемых против них препаратов [14]. Рост уровня лекарственно-устойчивых форм гонореи в мире повышается с каждым годом; описаны случаи неудачной терапии гонореи препаратами последнего поколения, что вызвано формированием суперустойчивых вариантов гонококка [15, 16]. За прошедшие десятилетия антимикробной терапии гонококк накапливал генетические детерминанты устойчивости к различным классам антибиотиков, что приводило к необходимости изменять схемы лечения, вводя новые препараты [17, 18].

Эволюционируя в течение множества поколений гонококк, как облигатный патоген, выработал механизмы, позволяющие обходить защитные системы хозяина, взаимодействуя как с врожденным, так и с адаптивным иммунитетом у мужчин и женщин, обладая при этом способностью обитать внутри эпителиальных клеток, макрофагов и нейтрофилов [1, 19–21].

РАЗВИТИЕ ИНФЕКЦИИ И ПАТОГЕНЕЗ

Выделяют следующие этапы развития вызываемой N. gonorrhoeae инфекции в слизистом эпителии половых путей: колонизация эпителия, инвазия в клетки хозяина, внутриклеточная персистенция и перемещение в субэпителиальную ткань (рис. 1) [20]. Ключевыми адгезинами возбудителя являются пили, белки мутности Opa, ионный канал PorB и липоолигосахарид (LOS). Под действием фрагментов пептидогликана, LOS, OMV, высвобождаемых N. gonorrhoeae, происходит активация Toll-подобных рецепторов (TLR2, TLR4) [22] и NOD-подобных рецепторов (NOD1, NOD2) [23], эпителиальных клеток, макрофагов и дендритных клеток (DC), что запускает каскад цитокинов и хемокинов (IL-6, IL-8, IL-1B, IL-17, интерферон-γ, TNF) посредством активации фактора транскрипции NF-κB [1, 24, 25]. Выделение провоспалительных цитокинов приводит к активации фагоцитов и лейкоцитов, их миграции в очаг инфекции и фагоцитозу N. gonorrhoeae [1]. Эпителиальные клетки также противодействуют N. gonorrhoeae с помощью аутофагии [26]. Важно отметить, что фагоциты не способны полностью элиминировать N. gonorrhoeae, которая может не только выживать, но и персистировать и реплицироваться как в нейтрофилах [27], так и в макрофагах [28–30]. Для противодействия адаптивному иммунитету N. gonorrhoeae стимулирует макрофаги к секреции иммуносупрессивного цитокина IL-10 [31]. Гонококк также подавляет Т-хелперы типа 1 и 2 и усиливает развитие клеток Th17 за счет индукции TGF-β [32]. Помимо этого, гонококковая инфекция индуцирует IL-17A [33], эффекторный цитокин Th17-клеток [25, 34]. При этом сигнализация IL-17А–NF-κB активирует несколько цепей отрицательной обратной связи, которые сдерживают активацию NF-κB [35].

 

Рис. 1. Патогенез инфекции N. gonorrhoeae. Цифрами обозначены следующие стадии: 1 – прикрепление бактерий из просвета цервикального/уретрального канала к эпителию хозяина, инициируемое пилями IV типа; 2 – связавшиеся с поверхностью клеток гонококки активируют Toll-подобные рецепторы, вызывая экспрессию цитокинов через путь NF-κB; 3 – колонизация, формирование микроколоний и биопленок; 4 – эндоцитоз, инвазия и внутриклеточная персистенция гонококков, активация NOD-подобных рецепторов; 4а – взаимодействие N. gonorrhoeae с уретральным эпителием, связывание LOS с рецептором ASPG-R, клатрин-зависимая интернализация; 4b – взаимодействие N. gonorrhoeae с цервикальным эпителием, связывание пилей с рецептором CR3, клатрин-независимая интернализация; 5 – фагоцитоз N. gonorrhoeae макрофагами и дендритными клетками, привлеченными градиентами цитокинов; 6 – персистенция бактерий в макрофагах и нейтрофилах; 7 – эффлюкс нейтрофилов способствует распространению N. gonorrhoeae в составе гнойного экссудата.

 

Начальной стадией гонококковой инфекции является прикрепление бактерии к апикальной стороне эпителия хозяина с использованием пилей типа IVa – многофункциональных мембраносвязанных тонких (≈ 6–8 нм) и длинных (> 1 мкм) филаментов, необходимых для вирулентности многих грамотрицательных патогенов [36]. Пили способны связываться с рецепторами, входящими в систему комплемента, такими как CR3 (гетеродимер интегринов CD11b/CD18), в женском мочеполовом эпителии [37, 38] и с регуляторным фактором комплемента CD46 (мембранный кофакторный белок) [39], экспрессирующимся в эпителии женских половых органов, а также с I-доменсодержащими интегринами (IDC), которые могут служить рецепторами пилей в тканях уретры [40]. Показано, что пили значительно изменяются во время инфекции и обладают разной способностью к адгезии [41]. Антигенные вариации пилей происходят за счет рекомбинаций гена pilE, кодирующего наружный белок пилин, c одним из 19 вариантов этого гена (pilS) без промотора под действием RecF-подобных белков [42]. Помимо прикрепления к различным клеткам и тканям, пили играют роль в формировании микроколоний, подвижности и естественной компетентности [43].

Дальнейшему связыванию, а также последующим адгезии и колонизации, способствуют белки мутности Opa, гены которых представлены в геноме не менее чем в 10 копиях. Каждый из генов opa способен к независимой фазовой вариации из-за ошибок в репарации пентамерных повторов CTCTT [44], что ведет к прекращению или восстановлению экспрессии opa. Связывание белков Opa с рецепторами происходит за счет гипервариабельных петель [45]. Выделяют два множества белков Opa: Opa₅₇, связывающихся с семейством молекул клеточной адгезии раковоэмбрионального антигена CEACAM, и Opa₅₀, взаимодействующих с гепарансульфатпротеогликанами HSPG и белками внеклеточного матрикса ECM [46]. Большинство белков Opa связываются с рецепторами CEACAM, среди которых выделяют 12 типов. Часть из них экспрессируется на клетках, имеющих отношение к патогенезу гонококковой инфекции, включая нейтрофилы, эндотелиальные и эпителиальные клетки [46]. Взаимодействие между CEACAM и белками Opa N. gonorrhoeae позволяет гонококку прикрепляться к клеткам человека, колонизировать их, а также инициирует поглощение бактерий клетками хозяина [47] и способствует их выживанию в нейтрофилах [48].

Ионный канал PorB принимает участие в таких процессах, как адгезия, инвазия и ускользание от иммунного ответа посредством связывания с белками активации комплемента хозяина из семейства RCA, а также подавления антибактериальных процессов в нейтрофилах и макрофагах [19]. Показано, что везикулы внешней мембраны, содержащие PorB, вызывают апоптоз макрофагов [49]. Подобным же образом присутствующий в OMV PorB играет ключевую роль в выживании гонококка в эпителиальных клетках, вызывая митофагию (селективное разрушение митохондрий путем аутофагии) для уменьшения митохондриальной секреции активных форм кислорода (ROS) [50]. По структуре PorB – гомотримерный порин внешней мембраны (размеры мономеров от 32 до 38 кДа), стабилизированный пептидогликансвязывающим белком RmpM [51]. PorB разделяют на два класса: PorB_IA и PorB_IB. Большинство изолятов N. gonorrhoeae (78% из 19018 геномов, собранных со всего мира) содержат изоформу гена porB1b. Каждый класс porB обладает широким генетическим разнообразием [8], а сам ген не подвергается фазовым вариациям. Штаммы, экспрессирующие ген porB1a, с большей вероятностью вызывают диссеминированную гонококковую инфекцию [52, 53]. Выявлены специфичные взаимодействия PorB_IA с гликопротеином Gp96 человека и рецептором-мусорщиком SREC. Показано, что Gp96 действует как фактор, способствующий адгезии и препятствующий инвазии, а SREC облегчает инвазию в клетки хозяина, внося свой вклад в патогенез диссеминированной гонореи [53]. Согласованное взаимодействие PorB и пилей с клеткой хозяина вызывает изменения концентрации кальция [54]. Увеличение концентрации свободного Ca²⁺ в цитозоле индуцирует транспорт основного белка лизосомной мембраны Lamp1 в плазматическую мембрану, где он расщепляется протеазой иммуноглобулина А1 (IgA1), секретируемой N. gonorrhoeae, что ведет к уменьшению числа лизосом в инфицированных клетках [55, 56]. Эти события способствуют внутриклеточному выживанию (персистенции) N. gonorrhoeae [57].

Половина массы внешней мембраны N. gonorrhoeae приходится на LOS [58] – разветвленный олигосахарид, прикрепленный к мембране через липид А. Одна из функций LOS – адгезия и инициация инвазии клеток N. gonorrhoeae за счет связывания c рецепторами асиалогликопротеинов (ASGP-R) на клетках уретрального эпителия [59] и эндометрия [60]. Длина и состав LOS зависят от генов lgt, кодирующих цитозольные гликозилтрансферазы. Фазовые вариации цитозольных гликозилтрансфераз, которые ферментативно определяют гликановый профиль молекул LOS, приводят к изменению структуры LOS [61, 62]. Ключевой модификацией LOS является сиалирование – присоединение остатка N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac) к лакто-N-неотетрозе (LNnT) – терминальному сахару LOS – c помощью сиалилтрансферазы Lst. Важно отметить, что N. gonorrhoeae не синтезирует Neu5Ac из-за потери гена siaB и должна получить ее извне [63]. С сиалированием LOS связано одно из различий в патогенезе гонококковой инфекции у мужчин и женщин. Сиалирование LOS уменьшает вирулентность гонококков у мужчин, вызывает устойчивость к компонентам гуморального иммунитета, снижает эффективность киллинга под действием нейтрофилов и антимикробных пептидов [64]. Инфицирование клеток женского мочеполового тракта не зависит от сиалирования LOS. При этом десиалирование LOS, необходимое для передачи гонококковой инфекции от женщин к мужчинам, может происходить под действием сиалидаз, обнаруженных в цервиковагинальном секрете [65].

Механизмы ускользания от иммунного ответа

Иммунная система человека способна лишь к частичной эрадикации гонококка. Механизмы ухода N. gonorrhoeae от иммунного ответа выяснены не полностью, хотя информация весьма обширна, поэтому приведем только ключевые механизмы. Расположенные на внешней мембране N. gonorrhoeae антигены ограничивают эффективность лизоцима хозяина, системы комплемента и распознавания PAMP-рецепторами (pathogen-associated molecular patterns). В геноме гонококка присутствуют гены двух ингибиторов лизоцима человека c-типа: белка адгезинового комплекса ACP [66] и ингибитора лизоцима SilC, не являющегося адгезином [67]. Сиалированный LOS ингибирует все три пути активации комплемента, уменьшая связывание IgG и осаждение компонента С4 системы комплемента на клетку патогена [68], связывая фактор H [69] и блокируя взаимодействие маннозосвязывающего лектина MBL, компонентов C4 и C3b [70]. PorB, особенно PorB_IA, может связывать ингибитор комплемента C4BP [71] и фактор H [72]. Кроме того, взаимодействие C4BP с белками Opa подавляет продукцию ROS и предотвращает фагоцитоз N. gonorrhoeae нейтрофилами [21]. Связывание адгезина OpaA с ингибитором комплемента витронектином может способствовать формированию устойчивости к комплементу [73]. Показано, что в удерживании витронектина и фактора H участвующий гепарин, связывающийся с Opa [74]. Cole и соавт. [75] показана устойчивость N. gonorrhoeae к гуморальному иммунитету из-за связывания белков Opa с C4BP. Ускользанию от комплемента способствует связывание IgG c мембранным белком Rmp, в результате чего образующийся комплекс компонентов системы комплемента c N. gonorrhoeae перестает быть летальным [76–78]. Истощение антител к Rmp приводит к эрадикации патогена [78]. Следует отметить, что N. gonorrhoeae не удается полностью ускользнуть от комплемента, о чем свидетельствует ДГИ у пациентов с дефектами системы комплемента [79, 80].

Локальный иммунный ответ на развитие гонококковой инфекции приводит к инфильтрации нейтрофилов, не способных к эрадикации патогена. Для ускользания от нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET) N. gonorrhoeae секретирует нуклеазу Nuc, разрушающую NET и повышающую внеклеточное выживание гонококка в присутствии нейтрофилов [81]. Механизмы выживания в нейтрофилах включают подавление продукции ROS и неокислительных цитотоксических белков и пептидов [27, 30]. Один из механизмов подавления ROS в нейтрофилах обусловлен наличием фенотипа Opa^- [82]. В противном случае результатом взаимодействия клетки патогена с рецепторами CEACAM3 нейтрофилов является фагоцитоз с последующей продукцией ROS [27, 30]. Следует отметить, что нейтрофилы в суспензии не способны осуществлять фагоцитоз неопсонизированных клеток N. gonorrhoeae с фенотипом Opa^-, однако приобретают такую способность после добавления IL-8 [83]. Другой механизм фагоцитоза, позволяющий N. gonorrhoeae избегать уничтожения нейтрофилами, осуществляется через рецептор комплемента CR3 [84]. Каноническим лигандом CR3 является комплементарный фрагмент iC3b, однако известен целый ряд лигандов CR3, включая белки внеклеточного матрикса, бактериальные токсины, липополисахарид и адгезины [85–88]. Подавлению антимикробного ответа нейтрофилов на гонококковую инфекцию также способствует сиалированный LOS [89]. Следует отметить, что несмотря на целый спектр механизмов защиты от ROS, включающих каталазу, супероксиддисмутазу, систему импорта марганца, ферменты репарации ДНК, N. gonorrhoeae не способна выживать в нейтрофилах при окислительном стрессе [27].

Существует ряд механизмов ускользания N. gonorrhoeae от макрофагов [28]. Гонококковый LOS имитирует сахариды человека, что приводит к снижению эффективности распознавания бактерий фагоцитами [90]. Многократное изменение белков на поверхности клеток N. gonorrhoeae предотвращает связывание антител и способствует ускользанию от опсонического фагоцитоза [74]. Еще один механизм, препятствующий опсонизации, – взаимодействие фактора H с порином PorB, которое предотвращает связывание iC3b [55]. Важный фактор выживания N. gonorrhoeae в нейтрофилах – связывание C4BP, осуществляемое преимущественно PorB, необходимо и достаточно для подавления индуцированной N. gonorrhoeae продукции ROS нейтрофилами и предотвращения фагоцитоза нейтрофилами клеток с фенотипом Opa⁺ [21]. N. gonorrhoeae подавляет апоптоз и аутофагию макрофагов [29, 91]. Кроме того, N. gonorrhoeae могут стимулировать макрофаги к принятию фенотипа М2, ассоциированного с иммуносупрессивными функциями и неспособного стимулировать деление T-клеток [92].

Адаптивный иммунитет хозяина к N. gonorr-hoeae весьма ограничен. Гонококк подавляет Th1/Th2-зависимый адаптивный иммунитет, индуцируя выработку TGF-β и стимулирует Th17-клеточный ответ [93]. Мыши, которым вводили антитела к TGF-β во время первичного заражения, смогли выработать антитела к гонококку и противостоять повторному заражению [93]. Помимо этого, подавление иммунного ответа обусловлено способностью N. gonorrhoeae индуцировать выработку IL-10 [31]. Ключевую роль в подавлении способности дендритных клеток стимулировать пролиферацию CD4+ Т-клеток играет белок PorB [94]. Адаптивный иммунитет против гонококковой инфекции практически отсутствует даже при симптоматической инфекции, при этом часто встречается повторное инфицирование гонококками [95, 96]. Причины слабого адаптивного иммунитета связаны со способностью N. gonorrhoeae ускользать от врожденного иммунитета за счет фазовых вариаций антигенов и наличием у нее механизмов, препятствующих развитию как В-, так и Т-клеточного иммунитета.

УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ

Формирование устойчивости N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам (АМП), в большинстве случаев ассоциировано с нуклеотидными заменами, заимствованием плазмид, рекомбинацией генов, приобретенных в результате селективного отбора [97, 98]. Молекулярные механизмы лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae можно разделить на следующие группы.

• Модификация мишени АМП, ассоциированная с мутациями в хромосомных генах. Так, изменение пенициллинсвязывающих белков (ПСБ) приводит к устойчивости к β-лактамным антибиотикам [99, 100]. Мутации в генах, кодирующих ДНК-гиразу и топоизомеразу IV, вызывают устойчивость к фторхинолонам, а нуклеотидные замены в генах, кодирующих рРНК, снижают чувствительность к аминогликозидным и макролидным антибиотикам [101–103].
• Синтез белков, предотвращающих связывание препарата с его мишенью. Например, белки ТetM защищают рибосомы от тетрациклинов [104, 105]. Модифицировать 23S рРНК способны также различные erm-метилазы, снижающие тем самым аффинность связывания макролидов с рибосомой [106].
• Инактивация АМП в результате активности специфичных ферментов. В частности, β-лактамазы способны гидролизовать β-лактамные антибиотики [107, 108].
• Изменение проницаемости наружной мембраны, связанное с увеличением эффлюкса и ограничением поступления (инфлюкс) АМП в клетку. Такие механизмы обусловлены изменениями структуры пориновых каналов, которые снижают проницаемость мембраны. Так, при мутациях в генах, кодирующих белки пориновых каналов, бактерии становятся менее чувствительными к пенициллину, тетрациклину и азитромицину [109]. Важным фактором, обеспечивающим защиту от АМП в патогенных бактериях, является вывод препаратов эффлюксными системами, состоящими из комплекса трансмембранных белков [110].

История применения АМП и эволюция устойчивости к ним, включая схематичное изображение детерминант резистентности N. gonorrhoeae, представлены на рис. 2. Перечень основных генетических детерминант резистентности N. gonorrhoeae к ранее использованным и актуальным АМП представлен в табл. 1.

 

Рис. 2. История внедрения антимикробных препаратов в схемы терапии гонококковой инфекции и схематичное изображение клетки с основными мишенями действия антибиотиков и генетических детерминант устойчивости к ним. В верхней части рисунка изображена временная шкала основных рекомендованых классов антимикробных препаратов для терапии гонореи, символом (Х) отмечен приблизительный год исключения препарата из протокола лечения. Красными линиями и цифрами на шкале выделена приблизительная дата обнаружения в клинической практике первых устойчивых изолятов. Нижняя часть рисунка – белки, рРНК, гены, вовлеченные в механизмы формирования устойчивости к антимикробным препаратам. Красные цифры соответствуют мишеням применяемых антибиотиков.

 

Таблица 1. Ключевые детерминанты устойчивости N. gonorrhoeae к ранее применяемым и актуальным антимикробным препаратам

Антимикробный препарат	Генетическая детерминанта
Сульфонамиды	Снижение эффективности препарата за счет конкурентного ингибирования с избыточно синтезируемой аминобензойной кислотой
	мутации в гене folP: Arg228Ser
Пенициллины	мутации в гене penA: инсерция Asp345–346 в ПСБ2 с одновременным изменением 4–8 аминокислотных остатков в С-концевой области ПСБ2 либо мозаичные аллели penA, кодирующие до 70 измененных аминокислотных остатков в ПСБ2, включая последовательности из близкородственных видов Neisseria
	мутации в гене mtrR: “delA” в положении –35 в промоторной области, инсерция нуклеотидов insTT/instT в положении –10, мутации в кодирующей области
	мутации в гене porB: замены Gly120Lys и Ala121Asp
	мутация в гене ponA: Leu421Pro
	пенициллиназа: плазмиды, кодирующие фермент β-лактамазу, TEM-1 или TEM-135
Тетрациклины	мутации в гене rpsJ: Val57Met
	мутации в гене mtrR: “delA” в положении –35 в промоторной области, инсерция нуклеотидов insTT/instT в положении –10, мутации в кодирующей области
	мутации в гене porB, замены Gly120Lys и Ala121Asp
	tetM: ген плазмидной локализации (защита рибосом)
Аминогликозиды	мутация в гене 16S рРНК: C1192T
	мутации в гене rpsE: Thr24Pro, Lys26Glu, делеция Val25
Фторхинолоны	мутации в гене gyrA: Ser91Phe, Asp95Asn и Asp95Gly
	мутации в гене parC: Asp86Asn, Ser88Pro и Glu91Lys
Макролиды	мутации в гене 23S рРНК: C2611T и A2059G. Уровень устойчивости зависит от количества rrn оперонов с мутациями
	мутации в опероне mtrCDE, мутации в гене-репрессоре mtrR, мозаичные аллели генов mtrCDE гены метилаз 23S рРНК: ermA, ermB, ermC, ermF
Цефалоспорины	мозаичные аллели гена penA: кодируют до 70 измененных аминокислот в ПСБ2, включая последовательности из негонококковых видов Neisseria. Аминокислотные замены, ассоциированные с резистентностью: Ala311Val, Ile312Met, Val316Thr, Val316Pro, Thr483Ser, Ala501Pro, Ala501Val, Asn512Tyr, Gly545Ser
	мутации в гене penA: замены Ala501Val и Ala501Thr
	мутации в опероне mtrCDE, мутации в гене репрессоре mtrR, мозаичные аллели генов mtrCDE
	мутации в гене porB: замены аминокислот Gly120Lys, Gly120Arg и Ala121Asp

 

Сульфонамиды

Сульфонамиды стали первыми распространенными АМП, применяемыми при гонококковой инфекции, они вошли в общую клиническую практику в середине 1930-х годов [111]. Механизм действия сульфонамидов основан на конкуренции с п-аминобензойной кислотой за фермент дигидроптероатсинтазу, что препятствует биосинтезу фолиевой кислоты. Устойчивость N. gonorrhoeae к сульфонамидам возникла в результате хромосомной мутации Arg228Ser в гене folP, кодирующем дигидроптероатсинтазу [112]. Также гонококки могут в избытке вырабатывать п-аминобензойную кислоту, что приводит к снижению эффективности препарата за счет конкурентного ингибирования [113]. Первые устойчивые изоляты появились в середине 1940-х, а уже к их концу сульфонамиды перестали использовать в терапии гонореи [114].

Пенициллины

Как и все β-лактамные антибиотики, пенициллины ингибируют синтез клеточной стенки, блокируя транспептидазную активность ПСБ. Пенициллин предложили использовать в терапии гонококковой инфекции в 1943 г. [115, 116]. Показано, что разовое введение АМП приводит к неполной элиминации патогена из организма человека, а также к селекции наиболее устойчивых штаммов, что, в свою очередь, неизбежно снижает эффективность терапии [117]. Через несколько лет после начала терапии пенициллином начали появляться изоляты со сниженной чувствительностью, что заставило клиницистов повышать терапевтическую дозу препарата, а спустя еще несколько лет были обнаружены первые резистентные изоляты [118].

Сегодня выявлено большое количество устойчивых к пенициллину штаммов, что не позволяет вернуть данный АМП в схемы терапии. Как и большинство патогенных грамотрицательных бактерий, N. gonorrhoeae использует несколько механизмов формирования устойчивости к пенициллинам, ассоциированных как с хромосомными, так и с плазмидными детерминантами [111, 119].

Cнижение аффинности пенициллинсвязывающих белков (ПСБ). Действие пенициллина направлено на бактериальные ПСБ, которые участвуют в синтезе пептидогликана, основного компонента клеточной стенки бактерий [120]. Поскольку синтез клеточной стенки является ключевым фактором деления и роста бактерий, изменение структуры ПСБ приводит к нарушению формы и дефекту клеточных стенок, и ведет в конечном итоге к гибели клеток [121].

Наиболее распространенной мутацией в гене penA (кодирует ПСБ2), ассоциированной с резистентностью N. gonorrhoeae к пенициллинам, является инсерция Asp345/346, локализованная на C-концевом участке белка. Эта инсерция и/или другие аминокислотные замены, такие как Ala311Val, Ile312Met, Ala501Val/Thr/Pro, Asn512Tyr, Gly542Ser, Gly545Ser, Pro551Leu/Ser способны увеличить минимальную подавляющую концентрацию (МПК) пенициллина в 6–8 раз, понижая скорость ацилирования фермента [122–124]. Замена Leu421Pro в гене ponA, кодирующем ПСБ1, приводит к уменьшению скорости ацилирования пенициллином в 2–4 раза и к снижению чувствительности N. gonorrhoeae соответственно [125].

У изолятов N. gonorrhoeae со сниженной чувствительностью к пенициллину обнаружены мотивы транспептидазного домена ПСБ из других близкородственных видов Neisseria [126, 127]. Мозаичный ген penA является ключевой детерминантой устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, включая пенициллины и цефалоспорины (см. ниже).

Вывод АМП из клетки посредством эффлюксных насосов. Большинство эффлюксных насосов N. gonorrhoeae состоят из трех полипептидных цепей – компонентов внешней и внутренней мембраны, а также периплазматического белка MFP (membrane fusion protein). В собранном виде трехкомпонентные системы эффлюкса пронизывают внутреннюю и внешнюю мембраны и периплазматическое пространство между ними. Формирование устойчивости к АМП обусловлено нарушением в работе эффлюксных насосов и связано со сверхэкспрессией кодирующих их генов или изменением конформации белков помпы, ассоциированных с мутациями в хромосомных генах [128, 129].

Устойчивость к АМП ассоциирована с полиморфизмом оперона mtrCDE, кодирующего эффлюксный насос MtrCDE и белок-репрессор транскрипции MtrR. Замены Ala39Thr, Arg44His, Gly45Asp, Leu47Pro а также делеция delA в положении –35 промоторной области и/или инсерция insTT/instT в положении –10 приводят к увеличению экспрессии всего эффлюксного насоса MtrCDE и усиленному выводу АМП из клетки [130, 131]. Кроме того, в результате горизонтального переноса между N. gonorrhoeae, N. meningitidis и комменсальными Neisseria spp., такими как N. lactamica, N. cinerea, N. flavescens, могут возникать мозаичные аллели оперона mtrCDE. Мозаичные варианты генов mtrR и mtrD способны вызывать изменения в функционировании эффлюксной системы MtrCDE, приводящие к усиленному выводу АМП из клетки, а значит, к повышению МПК пенициллина [132, 133].

Стоит отметить, что большинство эффлюксных насосов способны транспортировать субстраты АМП разных классов. По этой причине штаммы с повышенной активностью таких насосов часто имеют сниженную чувствительность к нескольким препаратам [134].

Изменение проницаемости пориновых каналов. Изменение проницаемости PorB приводит к снижению притока АМП в периплазму, т. е. к понижению чувствительности к ним [135]. Замены Gly120Asp, Gly120Lys, Аla121Asp и Ala121Asn в PorB ассоциированы со снижением чувствительности к целому ряду АМП, включая пенициллин, тетрациклин, ципрофлоксацин и цефалоспорины разных поколений [109, 136].

Штаммы N. gonorrhoeae, продуцирующие пенициллиназу. Гонококки, несущие плазмиды с геном bla, способны продуцироваить β-лактамазы семейства TEM, гидролизующие связь C-N в β-лактамном кольце антибиотика [137]. У N. gonorrhoeae выявлены различные варианты гена bla, кодирующие β-лактамазы типов TEM-1, TEM-135 и TEM-220 [138, 139], расщепляющих пенициллины.

Первые резистентные штаммы N. gonorrhoeae с плазмидами pbla_TEM обнаружили в 1976 г. в Азии, а позднее в Африке [140, 141], что позволило классифицировать их как “Азиатские” (длина 7426 п. н.) и “Африканские” (5599 п. н.) плазмиды в соответствии с их эпидемиологическим происхождением. Позднее у N. gonorrhoeae идентифицировали шесть других плазмид, ассоциированных с устойчивостью к пенициллинам, названных согласно географическому источнику: Торонто (5154 п. н.), Рио (5154 п. н.), Ним (6798 п. н.), Новая Зеландия (9309 п. н.), Йоханнесбург (4865 п. н.) и Австралия (3269 п. н.) [142–144]. Продуцирующие пенициллиназу изоляты N. gonorrhoeae обладают чрезвычайно высокими значениями МПК (16–32 мг/л) пенициллина в сравнении с МПК штаммов, имеющих только хромосомные мутации (0.008–2.0 мг/л). Быстрое распространение высокорезистентных штаммов N. gonorrhoeae с плазмидами blaTEM, наряду с хромосомными мутациями, привело к отказу от терапии гонококковой инфекции пенициллинами в начале 1980-х [145].

Тетрациклины

Механизм действия тетрациклинов связан с подавлением синтеза белков в клетках бактерий посредством нарушения взаимодействий аминоацил-тРНК с 16S рРНК рибосомной субъединицы 30S. Устойчивость N. gonorrhoeae к тетрациклинам опосредована различными факторами: эффлюксом (удаление антибиотика из клетки), нарушением проницаемости наружней мембраны (мутации в гене porB), изменением конформации рибосомного белка S10 за счет мутаций в кодирующем его гене rpsJ, а также защитой рибосом путем экспрессии белка TetM [105, 146, 147]. Тетрациклин был рекомендован для терапии гонококковой инфекции в начале 1950-х годов и назначался пациентам с индивидуальной непереносимостью β-лактамов. Через несколько лет после начала терапии обнаружили штаммы со сниженной чувствительностью к тетрациклину. Такие изоляты содержали замену Val57Met в белке S10, уменьшая сродство тетрациклина к нему [105, 148]. Сопутствующие мутации в опероне mtrCDE, ассоциированные с выбросом тетрациклинов из клетки, также снижают чувствительность бактерий.

В середине 1980-х обнаружили изоляты N. gonorrhoeae, несущие плазмиду с геном tetM, кодирующим белок защиты рибосом TetM. Этот белок является структурным аналогом фактора элонгации EF-G, также обладающим GTPазной активностью. Связывание TetM c рибосомой вытесняет молекулу тетрациклина и предотвращает подавление синтеза белка. Изоляты N. gonorrhoeae c плазмидами с tetM характеризовались сверхвысокими уровнями устойчивости к тетрациклину, что быстро привело к исключению данного препарата из схем терапии [149].

Известно, что ген tetM N. gonorrhoeae расположен на конъюгативной плазмиде, способствующей горизонтальному переносу иных плазмид [150]. При анализе механизма приобретения лекарственной устойчивости следует обращать особое внимание на изоляты N. gonorrhoeae, резистентные к тетрациклину и несущие плазмиду с tetМ, поскольку ее присутствие облегчает конъюгативный перенос плазмид с blaTEM [151]. Подобные мультирезистентные изоляты обладали чрезвычайно высокими уровнями МПК к пенициллину и тетрациклину и стремительно распространились по всему миру. Количество изолятов N. gonorrhoeae с tetM и pblaTEM в мировой популяции достаточно велико, что не позволяет вернуть эти АМП в схему терапии гонококковой инфекции [152, 153].

Аминогликозиды

Аминогликозидные антибиотики связываются с сайтом распознавания аминоацил-тРНК в 16S рРНК, входящей в состав 30S субъединицы, что приводит к подавлению синтеза белка и последующей гибели клеток. Штаммы гонококков, имеющие низкую чувствительность к спектиномицину, обладают хромосомными детерминантами устойчивости, среди которых однонуклеотидные замены в гене rrs (G1064C, G1058C и C1192T в сайте связывания аминогликозидов 16S рРНК), замена Thr24Pro и делеция Val27 одновременно с мутацией Lys26Glu в гене rpsE, кодирующем 5S субъединицу [154]. Изменения в структуре белка 5S, вероятно, нарушают связывание с 16S рРНК, что приводит к высокому уровню устойчивости к спектиномицину [155].

В терапии гонококковой инфекции применяли стрептомицин, канамицин, спектиномицин (2.0 г однократно внутримышечно), рекомендованный в России пациентам с индивидуальной непереносимостью β-лактамных антибиотиков [153, 156, 157]. В настоящее время устойчивость N. gonorrhoeae к аминогликозидам встречается чрезвычайно редко [158].

Фторхинолоны

Фторхинолоны – синтетические препараты, не имеющие природного аналога, действие которых направлено на топоизомеразу IV, состоящую из двух субъединиц – ParC и ParE, и ДНК-гиразу, также состоящую из субъединиц GyrА и GyrB. Участок связывания комплекса ДНК–ДНК-гираза с хинолонами получил название “хинолоновый карман”. Попадание хинолона в карман останавливает движение ДНК-гиразы, а затем и продвижение репликационной вилки [159].

Фторхинолоны, особенно ципрофлоксацин, стали препаратом выбора для терапии гонококковой инфекции в конце 1980-х годов, а первые устойчивые изоляты появились уже в начале 1990-х [160]. Механизм устойчивости гонококков к этой группе антибиотиков основан на снижении аффинности хинолонового кармана к препаратам и ассоциирован с мутациями Ser91Phe и Asp95Asn/Gly в гене gyrA и Asp86Asn, Ser87Pro и Glu91Lys в гене parC. К середине 2000-х на фоне распространения данных мутаций в глобальной популяции гонококка фторхинолоны были исключены из списка препаратов, рекомендованных для терапии гонореи [161].

Макролиды

Антимикробное действие макролидов направлено на нарушение процесса трансляции. Макролиды связываются с 23S рРНК рибосомной субъединицы 50S, блокируя канал выхода растущей пептидной цепи и заставляя рибосому высвобождать неполные, обрезанные полипептиды. Значимыми генетическими детерминантами устойчивости N. gonorrhoeae к макролидам являются мутации в пептидилтрансферазной петле II и V домена 23S рРНК [162]. Геном N. gonorrhoeae содержит четыре копии оперона rrn (rrnA, rrnB, rrnC, rrnD), в состав которого входит ген 23S рРНК. Замена C2611T в данном локусе приводит к появлению изолятов c умеренной резистентностью (МПК до 2 мг/л), а A2058G/A2059G – высокорезистентных (МПК > 256 мг/л) [163]. Следует отметить, что уровень устойчивости к азитромицину зависит от количества мутантных аллелей гена 23S рРНК – изоляты с тремя или четырьмя мутантными аллелями являются высокорезистентыми (МПК от 256 до 4096 мг/л), в то время как изоляты с одним аллелем обладают незначительным уровнем устойчивости, ниже или на уровне порогового значения МПК, составляющего 1 мг/л [164]. Кроме того, ухудшение связывания макролидов с рибосомой может быть обусловлено метилированием оснований в ключевых положениях. За это отвечает другой механизм резистентности к макролидам – наличие генов метилаз 23S рРНК группы erm (erm – erythromycin ribosome methylation) [106].

Эритромицин применяли при гонококковой инфекции с середины 1950-х гг. В 1970-е гг. у N. gonorrhoeae обнаружили рРНК-метилазы ErmA, ErmB, ErmC, ErmF [165], что положило конец применению эритромицина в конце 1970-х и исключению макролидов из схем монотерапии. В настоящее время метилазы 23S рРНК у N. gonorrhoeae встречаются редко [166].

Азитромицин рекомендован как компонент двойной терапии с 2010-х гг., в настоящее время он используется в странах ЕС совместно с цефалоспоринами III поколения [17, 167]. Изоляты с мутацией A2059G в одной копии оперона rrn, чувствительные к азитромицину, способны быстро формировать устойчивость за счет гомологичной рекомбинации во всех четырех копиях rrn.

Помимо мутаций в 23S рРНК, устойчивость N. gonorrhoeae к макролидам обусловлена также сверхэкспрессией эффлюкс-насоса MtrCDE [168]. Устойчивость к азитромицину и другим АМП формируется за счет ряда мутаций в генах эффлюксного насоса MtrCDE и его транскрипционного репрессора (mtrD и mtrR соответственно) [169, 170]. Анализ клинических изолятов N. gonorrhoeae, собранных на территории Российской Федерации за период 2020–2021 г., выявил существенную долю (13.6%) штаммов, устойчивых к азитромицину, несмотря на то, что данный антибиотик не рекомендован для терапии гонококковой инфекции в России. Устойчивость к азитромицину в основном связана с мозаичной структурой в промоторной области гена mtrR – с делецией –35 delA или мутацией Ala86Thr, а также с мозаичной структурой гена mtrD [130]. Филогенетический анализ современной российской популяции гонококка выявил отдельный кластер азитромицинустойчивых изолятов, относящихся к молекулярному типу, широко распространенному в европейской популяции, при этом данный кластер оказался филогенетически удаленным от эндемичных российских изолятов. Таким образом, причиной возникновения в России нового варианта возбудителя гонококковой инфекции, устойчивого к макролидам, стал трансграничный перенос резистентного штамма со специфическими генетическими детерминантами [130].

Цефалоспорины III поколения

В настоящее время в большинстве стран мира для лечения гонококковой инфекции рекомендуют цефалоспорины III поколения (цефтриаксон, цефиксим) [171, 172]. Механизм действия цефалоспоринов, как и других β-лактамных антибиотиков, основан на связывании препарата с ПСБ2 (транспептидазами) и нарушении синтеза поперечных связей пептидогликана в клеточной стенке. Одной из ключевых детерминант снижения чувствительности к цефалоспоринам является мозаичный аллель гена penA, кодирующего ПСБ2. Такой вариант penA может определять до 60–70 аминокислотных замен. Он появился в результате трансформации ДНК от комменсальных видов Neisseria с последующей рекомбинацией [102], подобно мозаичным аллелям оперона mtrCDE.

Устойчивость гонококка к цефалоспоринам III поколения увеличивается с каждым годом, описано немало неудачных случаев лечения гонореи [17, 173–175]. Изоляты со сниженной чувствительностью к цефалоспоринам быстро распространяются по всему миру. Первоначально в Японии выявили несколько вариантов гонококков с высоким уровнем устойчивости к цефтриаксону и цефиксиму, затем изоляты этой же генетической линии нашли во многих странах ЕС [119, 176]. Следует отметить, что на территории Российской Федерации пока не зарегистрированы случаи неудачного лечения гонококковой инфекции цефалоспоринами III поколения и не обнаружены соответствующие устойчивые варианты [177, 178].

Устойчивость к цефалоспоринам III поколения ассоциирована с мутациями Ala311Val, Ile312Met, Val316Thr, Val316Pro, Thr483Ser, Ala501Pro, Ala501Val, Asn512Tyr, Gly545Ser, которые встречаются в основном в аллелях гена penA мозаичного типа [126, 179]. Однако и немозаичные аллели penA содержат мутации, вызывающие повышение МПК цефалоспоринов III поколения: замены остатков Ala501Val и Ala501Thr, а также Gly542Ser, Pro551Ser и Pro551Leu. Можно предположить, что эта замена возникла в результате селективного отбора гонококков, а не обусловлена переносом из других видов бактерий [14, 180, 181].

Номенклатура аллелей гена penA включает все их типы, в том числе, мутантные мозаичные и полумозаичные аллели. Аллели принято нумеровать римскими цифрами от I до XXXVIII [182, 183]. Основным механизмом резистентности к цефалоспоринам является специфическое изменение мишени ПСБ2, однако свой вклад вносят также усиленный эффлюкс и сниженный инфлюкс, опосредованные мутациями в mtrCDE и porB соответственно. Совокупность мутаций в penA, ponA, porB и mtrR приводит к появлению изолятов с МПК цефиксима 4 мг/л, МПК цефтриаксона 1–2 мг/л. Изоляты с подобными профилями детерминант устойчивости описаны в большинстве стран Европы и Азии [126, 184].

Встречающиеся у гонококков β-лактамазы TEM-1 и TEM-135 отличаются одной аминокислотной заменой – Met182Thr [185]. Всего одна замена G→A в гене bla_TEM-135 приводит к замене Gly238Ser, что превращает TEM-135 в TEM-20, которая относится к β-лактамазам расширенного спектра, способным гидролизовать как пенициллины, так и цефалоспорины. Однако клинические изоляты N. gonorrhoeae с β-лактамазой TEM-20 в настоящий момент не обнаружены. В то же время, данные из Китая свидетельствуют о стремительном распространении изолятов N. gonorrhoeae c TEM-135 [143], что вызывает опасения из-за риска появления β-лактамаз расширенного спектра действия, которые поставят точку в применении цефалоспоринов III поколения. Тем не менее, эксперименты in vitro по созданию клеточных моделей N. gonorrhоeae с β-лактамазой TEM-20 показали, что жизнеспособность таких штаммов существенно снижена, что, возможно, объясняет отсутствие соответствующих клинических изолятов в природе и продлевает век применения цефалоспоринов в качестве основного препарата в терапии гонококковой инфекции [186].

Новые антимикробные препараты, эффективные в отношении N. gonorrhoeae

В 2016 г. ВОЗ опубликованы обновленные рекомендации по лечению гонореи, в которых подчеркнута необходимость разработки новых АМП [187]. В настоящий момент продолжаются клинические исследования золифлодацина и солитромицина, прошедших третью фазу, и гепотидацина, завершившего вторую фазу [188–190].

Наиболее перспективным из перечисленных препаратов является золифлодацин, который относится к классу спиропиримидинтрионов и ингибирует бактериальную топоизомеразу II [191, 192]. Чувствительность in vitro к золифлодацину у клинических изолятов, выделенных в странах Евросоюза, находится на уровне МПК 0.032–0.25 мг/л. Не обнаружено перекрестной устойчивости этого препарата ни с одним из традиционно применяемых против гонококка АМП [193, 194]. In vitro анализ потенциальных детерминант резистентности N. gonorrhoeae к золифлодацину показал возможность формирования ряда мутаций в гене gyrB, например Asp429Ala или Lys450Asn [160]. Подобные и сопутствующие замены в топоизомеразе типа II могут встречаться у изолятов N. gonorrhoeae в естественной среде и в перспективе привести к формированию устойчивого кластера в популяции [152, 194]. Требуются дальнейшие испытания золифлодацина, включая валидацию на большой выборке, определение оптимального режима дозирования и порогового значения МПК, разделяющего чувствительные и устойчивые изоляты.

МОЛЕКУЛЯРНОЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ

Важным инструментом контроля гонококковой инфекции является молекулярное типирование, направленное на выявление значимых молекулярных типов (генотипов, сиквенс-типов, ST) [17, 152]. Определение генотипа изолята позволяет анализировать пути передачи гонококковой инфекции, а также идентифицировать и контролировать распространение эпидемиологически опасных клонов. К числу наиболее распространенных в настоящее время методов генотипирования N. gonorrhoeae относятся следующие методы.

Генотипирование NG-MAST, основанное на определении нуклеотидной последовательности двух гипервариабельных локусов porB (490 п. н., кодирует трансмембранный белок поринового канала) и tbpB (390 п. н., кодирует β-субъединицу трансферринсвязывающего белка) [195]. Создана и поддерживается мировая база данных NG-MAST v.2.0 (https://pubmlst.org/databases), в которую депонированы последовательности геномных локусов porB и tbpB, позволяющие определить сиквенс-тип штамма. На 2024 год база насчитывает порядка 13000 аллелей porB и 3000 аллелей tbpB и постоянно дополняется новыми последовательностями. Отдельно стоит отметить, что генотипирование изолятов по протоколу NG-MAST позволяет достоверно различать аллели гена porB – porB_IA и porB_IB. Показано, что изоформа порина PorB_IA ассоциирована с диссеминированной гонококковой инфекцией, однако в мировой популяции гонококка она встречается относительно редко [8, 196, 197].

Генотипирование N. gonorrhoeae по протоколу NG-MAST получило широкое распространение, поскольку типы NG-MAST сцеплены с аллельными вариантами генов, которые ассоциированы с устойчивостью к АМП. Так, изоляты N. gonorrhoeae со сниженной чувствительностью к цефалоспоринам III поколения относятся, как правило, к молекулярному типу 1407 [152]. Обнаружено, что фенотипически устойчивые к азитромицину изоляты ассоциированы с типом 12302 NG-MAST, который в последние годы преобладает на территории стран Евросоюза. Появление этого варианта на территории России (рис. 3) в 2020–2021 гг. привело к резкому увеличению доли изолятов, устойчивых к азитромицину [178]. Таким образом, генотипирование по протоколу NG-MAST позволяет успешно изучать особенности генетической структуры популяции N. gonorrhoeae и отслеживать тенденции, которые в ней происходят.

 

Рис. 3. Филогенетическое дерево российских изолятов N. gonorrhoeae, собранных в 2020–2021 г., построенное на основе данных NG-MAST-типирования. Цифры по периметру круга соответствуют коду изолята, красным отмечены коды изолятов, устойчивых к азитромицину. Основные геногруппы (G10800, G387 и др.) выделены разными цветами. Обнаруженные мутации (A-G), ассоциированные с устойчивостью к азитромицину, отмечены знаком “+”. Красным выделена геногруппа G12302, включающая азитромицинустойчивые изоляты с мутациями в гене mtrR и мозаичными вариантами гена mtrD. Изоляты геногруппы G12302 филогенетически удалены от эндемичных российских изолятов геногруппы G10800 (выделена зеленым).

 

Генотипирование MLST основано на определении нуклеотидных последовательностей семи локусов генов домашнего хозяйства: abcZ (ABC-транспортер), adk (аденилаткиназа), aroE (шикиматдегидрогеназа), fumC (фумаратгидратаза), gdh (глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа), pdhC (субъединица пируватдегидрогеназы), pgm (фосфоглюкомутаза) [197]. Последовательности локусов, применяемых для генотипирования по протоколу MLST, существенно консервативнее в сравнении с локусами протокола NG-MAST. Результаты типирования гонококка по протоколу MLST депонируют в базу данных PubMLST (http://pubmlst.org/databases).

MLST-генотипирование N. gonorrhoeae позволяет выделять большое количество генетических вариантов в популяции гонококка, а также выявлять эволюционно успешные генотипы. Как и NG-MAST, определенные MLST-генотипы ассоциированы с устойчивостью к АМП различных классов. Так, изоляты доминирующего в мировой популяции MLST-генотипа 1901 характеризуются сниженной чувствительностью к цефалоспоринам III поколения [115]. С каждым годом возрастает доля изолятов MLST 9363, ассоциированных с устойчивостью к азитромицину, что, в целом, отражает мировую тенденцию роста антимикробной резистентности N. gonorrhoeae [198].

NG-STAR [199] – стандартизированный метод классификации семи хорошо охарактеризованных генов N. gonorrhoeae (penA, mtrR, porB, ponA, gyrA, parC и 23S рРНК), ассоциированных с устойчивостью к цефалоспоринам, макролидам и фторхинолонам. Комбинация аллелей семи генов позволяет установить генотип изолята по протоколу NG-STAR, а также предсказать профиль фенотипической чувствительности к АМП на основе уже описанных генотипов. База данных NG-STAR (https://ngstar.canada.ca/) содержит около 2000 генетических профилей, соотнесенных с данными по чувствительности к указанным выше АМП. Достоверность определения уровня устойчивости N. gonorrhoeae к АМП по протоколу NG-STAR составляет 95% (соответствие предсказанного значения МПК экспериментально определенному) [182]. Вместе с тем, метод NG-STAR не подходит для изучения молекулярной эпидемиологии гонококковой инфекции, поскольку в большинстве случаев N. gonorrhoeae распространяется по сети контактов через клональное размножение. Таким образом, в разных популяциях, как правило, присутствует большое количество идентичных NG-STAR генотипов, что не позволяет в полной мере выделять и контролировать распространение наиболее эпидемиологически значимых клонов.

cgMLST. Новые подходы к молекулярной эпидемиологии гонококковой инфекции основаны на использовании технологий высокопроизводительного секвенирования (NGS), позволяющих одновременно определять как совокупность генов, характеризующих происхождение анализируемого клинического изолята, так и совокупность имеющихся у него генетических детерминант антибиотикорезистентности [200]. По сути, NGS позволяет решать задачи генотипирования по протоколам NG-MAST и MLST на более высоком уровне, при этом прямо, а не косвенно, связывая генотип изолята и его чувствительность к АМП [201]. NGS успешно применяется для идентификации детерминант резистентности, исследования филогенетических взаимосвязей, популяционной структуры и молекулярной эпидемиологии гонококка [202]. Несмотря на колоссальную информативность, методу присущи такие недостатки, как невысокая дискриминирующая способность в отношении отдельных нуклеотидов, требующая большого покрытия генома и, соответственно, дорогих наборов реагентов, отсутствие валидированных биоинформатических пайплайнов для интерпретации результатов.

Описанные методы генотипирования N. gonorrhoeae играют ключевую роль в проведении молекулярно-эпидемиологических исследований. В условиях растущей проблемы распространения мультирезистентных штаммов N. gonorrhoeae генотипирование представляет собой черезвычайно важный и мощный инструмент не только для мониторинга гонококковой инфекции, но и для изучения процессов молекулярной эволюции в популяции гонококка.

МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ N. gonorrhoeae

Трансформация – ключевой путь горизонтального переноса у нейссерий

N. gonorrhoeae обладает исключительной способностью к изменению своего генетического материала благодаря механизмам горизонтального переноса и естественной компетентности во всех фазах роста. Горизонтальный перенос генов может происходить посредством конъюгации, трансформации и трансдукции, при этом трансформация, вероятно, является ключевым способом передачи хромосомной ДНК у N. gonorrhoeae [203]. Трансдукция гонококков бактериофагами происходит сравнительно нечасто, а конъюгация способна переносить только плазмидную ДНК [204, 205].

У большинства бактерий, способных к генетической трансформации, состояние компетентности достигается лишь на короткое время и часто в специальных условиях (электропорация, химическая трансформация). Только малая часть видов (пока описано всего 82 [206]) компетентны в естественных условиях, при этом подавляющая их часть обладает непостоянной компетентностью [207]. N. gonorrhoeae выделяется на их фоне, так как обладает этим свойством во всех фазах роста [205, 208, 209]. С течением времени именно высокая частота и эффективность трансформации гонококков привели к быстрому распространению детерминант устойчивости к антибиотикам в популяции N. gonorrhoeae, что стало проблемой для мирового здравоохранения.

Процесс трансформации клеток можно разделить на три этапа: связывание донорной ДНК, поглощение и рекомбинация [205]. Прежде чем встроиться в геном, ДНК должна быть распознана пилями клетки-реципиента по определенной 10–12-буквенной последовательности (atGCCGTCTGAA) [210], встречающейся в хромосоме N. gonorrhoeae и других видов Neisseria в среднем 1 раз на 1100 п. н. Эту последовательность называют DUS (DNA Uptake Sequence) и, вероятно, она служит своеобразным “водяным знаком”, устраняющим барьеры для проникновения собственной ДНК в геном в условиях отсутствия у гонококка функциональной системы CRISPR-Cas [211].

Механизмы передачи донорной ДНК для трансформации

Донорная ДНК может быть получена и передана гонококком с помощью автолиза, везикул внешней мембраны (OMV) или системы секреции ДНК IV типа (T4SS), наиболее изученной в настоящее время.

Автолиз

В отличие от многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, N. gonorrhoeae не может выживать в течение длительного времени после прекращения роста. Автолиз обычно происходит в стационарной фазе или в условиях отсутствия роста, таких как истощение питательных веществ, неоптимальные температура, pH или осмолярность [212]. Снижение жизнеспособности коррелирует с лизисом клеток, происходящим после истощения запасов глюкозы в среде [213]. Автолиз может привести к образованию клеток с поврежденной оболочкой (L-форма), способных подвергаться репарации и возобновлять рост при благоприятных условиях [214]. За процесс автолиза ответственны литические трансгликозилазы, такие как AtlA, LtgA, LtgB, LtgC, LtgX, эндопептидаза EppA, N-ацетилглюкозаминидаза NagZ и N-ацетилмурамоил-L-аланин-амидаза AmiC [215, 216].

В процессе автолиза в окружающую среду выделяются фрагменты пептидогликана, обладающие цитотоксическими свойствами и способствующие селективному уничтожению реснитчатых клеток фаллопиевой трубы, что важно для развития гонококковой инфекции в органах малого таза [216]. Кроме модуляции иммунного ответа хозяина, потенциальная выгода автолиза может состоять в предоставлении ДНК для формирования биопленок, а также для естественной трансформации.

Везикулы внешней мембраны (OMV)

У N. gonorrhoeae, как и у N. meningitidis, еще одного облигатного патогена рода Neisseria, обнаружены OMV [214]. Они наиболее интенсивно вырабатываются в экспоненциальной фазе либо в ответ на стресс [218] и могут содержать фосфолипиды, нуклеиновые кислоты, компоненты клеточной стенки, метаболиты, сигнальные молекулы и белки [223].

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что OMV гонококков влияют на клетки хозяина, стимулируя иммунный ответ в нефагоцитирующих клетках и индукцию апоптоза макрофагов [49]. Помимо этого, OMV содержат как плазмидную, так и хромосомную ДНК, обеспечивая горизонтальный перенос, в том числе, генов устойчивости к антибиотикам, например, плазмид с генами blaTEM [219].

Система секреции IV типа (T4SS)

Отличительным механизмом выделения хромосомной оцДНК во внешнюю среду у гонококка является система T4SS, кодируемая генами GGI. Полагают, что наличие T4SS связано с высокой эффективностью горизонтального переноса между различными популяциями N. gonorrhoeae из-за увеличения количества ДНК, доступной для трансформации в окружающей среде. Кроме того, T4SS играет важную роль в формировании биопленок за счет большого вклада “липкой” ДНК в построение матрикса этих пленок [11]. Функционирующая система T4SS обеспечивает в 500 раз более высокую эффективность трансформации гонококков, чем автолиз [12]. Основной комплекс T4SS гонококков состоит из мультимерных белков TraB, TraK и TraV, формирующих помпу (рис. 4). Он охватывает клеточную стенку от внутренней мембраны через периплазму до внешней мембраны. Периплазматические и трансмембранные белки TraE, TraF, TraG, TraH, TraL, TraN, TraW, TraU, Yag, DsbC и TrbC участвуют в сборке аппарата секреции и его закрепления в клеточной стенке [220–222]. Предполагается, что перед встраиванием помпы в клеточную стенку в этом месте должно произойти расщепление пептидогликана литическими трансгликозилазами AtlA и LtgX.

 

Рис. 4. Горизонтальный перенос генов N. gonorrhoeae с помощью T4SS. Показаны основные компоненты T4SS, системы компетентности и пилей IV типа. 1 – Релаксосома TraI-ParAB разрезает одну из цепей хромосомы клетки-донора по мотиву oriT, расплетает ее и производит оцДНК; 2 – оцДНК выходит через помпу T4SS за пределы клетки; 3 – находящийся во внешней среде комплекс TraI-оцДНК связывается с пилями клетки-акцептора посредством белка компетентности ComP, распознающего мотив DUS; 4 – молекулярный мотор PilT осуществляет втягивание пили, в результате чего ДНК переносится в периплазму через пориновый канал PilQ. Связывание ДНК с ComE препятствует обратному перемещению ДНК из клетки и способствует переносу молекулы через канал ComA в цитоплазму; 5 – ДНК встраивается в геном клетки-акцептора посредством рекомбинации RecBCD.

 

Ведущую роль во взаимодействии ДНК с T4SS играют белки ParA-ParB и TraI – релаксаза, принадлежащая к семейству MOB_H. Канонически ParA-ParB необходимы для точной сегрегации сестринских пар молекул ДНК в цитоплазме при делении клетки [223], но в случае T4SS N. gonorrhoeae они соединяются с TraI, образуя релаксосому TraI-ParAB на внутренней мембране [224]. При этом ParB, вероятно, отвечает за привлечение хромосомной ДНК к TraI, а АТРазная активность ParA облегчает процесс разрезания ДНК релаксосомой. Главный компонент релаксосомы – белок TraI закреплен на внутренней мембране гидрофобным N-концом, каталитически активен в присутствии ионов Mn²⁺ и осуществляет несколько функций, включая одноцепочечный сайт-специфический разрез хромосомы по мотиву oriT, ее расплетание и повторное, но неспецифичное разрезание [225, 226]. Последовательность oriT состоит из инвертированного повтора (IR), образующего вторичную структуру типа “шпилька”, которая распознается TraI, и nic-сайта, по которому этот фермент производит разрез. Кроме того, oriT присутствует и в самом GGI, способствуя его распространению в популяции.

Белок TraD способствует сопряжению релаксосомы TraI-ParAB с остальными структурными компонентам помпы T4SS. АТРаза TraC обеспечивает транспорт оцДНК через помпу за пределы клетки, высвобождая необходимую для этого энергию из АТР. Интересно, что образующаяся оцДНК защищена с 5’-конца от экзонуклеаз. Предполагалось, что она выбрасывается из клетки, будучи связанной с TraI, подобно тому, как это происходит в конъюгативных T4SS-системах, и поэтому не подвержена 5’-расщеплению [226]. Однако позже выяснилось, что комплекс “TraI-оцДНК” не образуется, а 5’-деградации препятствует то, что 5’-конец, начинающийся с nic-сайта, находится на слишком малом расстоянии от IR-шпильки (3 н.), которая и препятствует расщеплению экзонуклеазой [225]. Оказавшись за пределами клетки, оцДНК, содержащая мотив DUS, может специфически связаться с белком ComP на поверхности пили IV типа клетки-акцептора и участвовать в процессе естественной трансформации, изображенном на рис. 4. После связывания ДНК с ComP, мотор пили PilT с силой притягивает ДНК по направлению к клетке, чтобы затем она могла пройти через мембранный порин PilQ далее в периплазму. По мере прохождения через мембрану, ДНК связывается многими копиями белка ComE, который количественно регулирует пропускную способность периплазмы [227]. PilQ не специфичен к поступающей ДНК, он может пропускать ее как внутрь, так и наружу. ComE связывается с ДНК, препятствуя ее движению назад. Из периплазмы ДНК проходит через внутреннюю мембранную пору ComA и попадает в цитозоль [228]. Полученная ДНК становится доступной для включения в хромосому путем гомологичной рекомбинации системой RecA и RecBCD [229].

Гонококковый генетический остров – молекулярный двигатель распространения антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae

Система T4SS N. gonorrhoeae кодируется генами GGI, который включает 66 генов и имеет длину ~59000 п. н. [209, 220, 230]. Как и все генетические острова, GGI является мобильным элементом, сам он когда-то был получен путем горизонтального переноса, о чем свидетельствует пониженный GC-состав GGI (43% при среднем составе 52% по геному N. gonorrhoeae) и гораздо меньшее количество DUS на единицу длины [231]. За мобильность GGI отвечает система сайт-специфической рекомбинации XerCD, способная вырезать/вставлять остров по фланкирующим сайтам difA и difB [232]. Эксперименты по анализу генов GGI, обеспечивающих функционирование T4SS, показали, что только 21 из 66 генов (traG, atlA, traI, parA и parB, traK, traV, traB, traD, ltgX, yag, traL, traE, dsbC, traC, traW, traU, trbC, traN, traF, traH) необходим для сохранения способности к секреции ДНК [209, 233, 234].

Описаны значительные вариации GGI в области генов traG-atlA-ych-exp1-cspA-exp2 [12]. Трансмембранный белок TraG имеет три изоформы (TraG1, TraG2, TraG3), которые различаются C-концевой последовательностью, обращенной в цитоплазму, и связываются с другими компонентами T4SS [235]. Выделяют три класса GGI, которые различаются уровнем секреции ДНК во внеклеточную среду: I – traG1+atlA; II – traG2+atlA; и III – traG3 + eppA (класс III содержит eppA вместо atlA, ген ych заменен геном ych1, а ген exp1 отсутствует) [235]. Изоляты с GGI класса III утратили способность секретировать ДНК. При этом эндопептидаза EppA, функционально схожая c литической трансгликозилазой AtlA, не обеспечивает формирования необходимого отверстия в клеточной стенке для сборки системы T4SS на мембране. Предполагается, что потеря способности секретировать ДНК связана не только с отсутствием atlA, но и с “плохой” аффинностью C-конца TraG3 к другим ключевым белкам GGI, таким как белок сопряжения TraD, АТРаза TraC или релаксаза TraI [220].

В отличие от двух других механизмов передачи ДНК, таких как автолиз и OMV, в ряде работ была установлена статистическая значимая связь между присутствием GGI и устойчивостью к АМП на популяционном уровне. Обнаружена ассоциация между наличием GGI и увеличением доли изолятов, устойчивых к цефиксиму, пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, со снижением доли изолятов, устойчивых к азитромицину [200]. Отмечено также, что устойчивость к азитромицину и опосредованная плазмидами устойчивость к пенициллину и тетрациклину не ассоциированы с GGI. Это вполне объяснимо, ведь GGI передает только хромосомную ДНК [236]. Сравнительный полногеномный анализ молекулярных типов возбудителя, доминирующих в России и в мире, выявил cвязь между снижением чувствительности изолятов N. gonorrhoeae к АМП и отсутствием нарушений в генах GGI, значимых для функционирования T4SS [237]. Далее на глобальной популяции N. gonorrhoeae сравнили распределение устойчивости к АМП среди изолятов с функциональным GGI и без GGI, а также между геномами с функциональным и нефункциональным GGI, и выявили различие между долями изолятов, устойчивых к цефиксиму, тетрациклину, пенициллину и ципрофлоксацину [238]. При удалении из выборки изолятов с плазмидами с генами blaTEM и tetM и сравнении долей устойчивых изолятов в выборках без GGI и с функциональным GGI, доля устойчивых к пенициллину изолятов выросла с 1.2 до 2.6, а к тетрациклину – с 1.9 до 3.4. Выявленные изменения можно объяснить тем, что плазмиды передаются посредством коньюгации, а не T4SS. В то же время, доля изолятов без GGI, устойчивых к азитромицину, была выше, чем изолятов с функциональным GGI. Отметим, что при сравнении выборок с функциональным и нефункциональным GGI доля изолятов, устойчивых к азитромицину, была одинаковой. Это наблюдение может указывать на распространение устойчивости к азитромицину по иному механизму [238].

Филогенетический анализ GGI в мировой популяции гонококка выявил разделение GGI на три кластера, соответствующих описанным ранее классам [235], которые отличаются последовательностью генов traG, atlA, ych, exp1, cspA, exp2 [238]. Детальный анализ с разделением кластеров на субкластеры показал, что системы молекулярного типирования MLST и NG-MAST позволяют отнести анализируемый изолят к определенному субкластеру GGI с точностью 83 и 91%, соответственно, и сделать вывод о наличии GGI и его функциональности, а значит и о способности изолята секретировать ДНК [238].

Роль секретируемой ДНК в формировании биопленок

ДНК является важным компонентом биопленок, она стабилизирует биопленку и участвует в прикреплении клеток к клеткам. В частности, обработка ДНКазой I заметно ингибировала образование биопленок или даже приводила к их разрушению [239–241].

Образование биопленок N. gonorrhoeae изучено не только на штамме MS11, обладающем функциональным T4SS, но и на штаммах 1291 и FA1090, у которых нет этой системы [242]. Все три штамма способны образовывать биопленки, т. е. T4SS не является обязательным условием формирования биопленки. Однако мутант MS11 с делецией ключевого для T4SS гена traB, приводящей к остановке секреции оцДНК, демонстрировал существенно более медленную динамику образования биопленки с заметно худшей стабильностью [11]. оцДНК, секретируемая T4SS, играет важную роль на начальных этапах формирования биопленки, когда клетки прикрепляются к поверхности, ускоряя этот процесс, в то время как на последующих этапах больший вклад вносит дцДНК, высвобождаемая автолизом или везикулами [11].

Комменсальные Neisseria – резервуары генетического материала и детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к антибиотикам

На настоящий момент описаны по меньшей мере 15 комменсальных видов Neisseria spp., колонизирующих человека, не считая таксонов внутри полифилетических групп. Восемь из них упоминаются часто (кокковидные N. lactamica, N. mucosa, N. cinerea, N. polysaccharea, N. oralis, N. subflava и палочковидные N. elongata, N. bacilliformis), а семь открыты относительно недавно (N. bergeri, N. maigaei, N. uirgultaei, N. basseii, N. blantyrii, N. viridiae, N. benedictiae) [243]. Комменсальные Neisseria, как правило, не представляют угрозы для здоровья. Они составляют значительную долю микрофлоры рото/носоглотки [244] и могут обмениваться генетическим материалом с патогенными Neisseria, являясь резервуаром детерминант устойчивости к АМП [245]. Около 6% всего генома N. gonorrhoeae получено от других представителей рода Neisseria [245–248], вероятно, при орофарингеальной гонорее. Именно таким путем в популяции гонококка возникли мозаичные аллели гена penA, где донорами рекомбинантной ДНК для N. gonorrhoeae были N. subflava либо N. cinerea [102, 249–251]. Произошло это событие в Японии в 1990-х годах на фоне перорального потребления сублетальных концентраций цефиксима [102]. Затем штаммы с мозаичными penA распространялись в условиях рекомендованной терапии цефалоспоринами [252].

Нельзя не упомянуть и о мозаичных аллелях генов оперона mtrCDE. Впервые такие аллели описали в 2012 году в небольшой группе изолятов из Австралии, устойчивых к азитромицину [253]. Последовательность промотора гена mtrR у этих штаммов гомологична последовательности из менингококкового, но не гонококкового генома (meningitidis-like). Дальнейшие исследования выявили не только изоляты N. gonorrhoeae c геном mtrR и его промотором, гомологичными N. meningitidis, но и изоляты N. gonorrhoeae в которых гены оперона mtrCDE были целиком или частично гомологичны N. lactamica и N. polysaccharea [133, 254].

Анализ геномов методами вычислительной филогенетики выявил ряд мутаций в генах rplB, rplD rpsY, которые, вероятно, возникли в результате химеризации с N. cinerea, N. subflava и N. lactamica [10]. Показано также, что детерминанты устойчивости к фторхинолонам в генах gyrA, gyrB, parC и parE появились в геноме гонококка в результате горизонтального переноса [9]. Доказательства внутривидового и внутриродового горизонтального транспорта получены и для гена porB [8].

Барьеры для межвидового горизонтального переноса генов внутри рода Neisseria

Несмотря на приведенные примеры успешного межвидового горизонтального переноса ДНК, внутри рода Neisseria существуют определенные барьеры, препятствующие данным событиям [245]. Так, коэволюция мотивов DUS и связывающего их белка компетентности ComP способствовала возникновению “репродуктивной изоляции” между видами Neisseria, которая усиливается по мере их филогенетического расхождения [255]. Восемь вариантов мотивов DUS в сочетании с альтернативными формами белка ComP создают дивергентные “диалекты”, которые сильно увеличивают частоту связывания, поглощения и трансформации ДНК внутри вида по сравнению с межвидовыми взаимодействиями [256].

Другим препятствием для межвидового обмена генетическим материалом является различие в количестве и идентичности систем рестрикции-модификации у патогенных и комменсальных видов Neisseria. Например, N. gonorrhoeae может содержать от 14 до 19 таких систем, филогенетически близкая N. lactamica – от 14 до 17, а дальнородственная N. elongata – лишь 7–10 [257] (данные из базы REBASE, http://tools.neb.com/genomes/index.php?page=N). Эти виды по-разному модифицируют мотивы CpG и GpC, создавая видоспецифичные паттерны метилирования. На примере ДНК N. elongata показано, что несовпадающее метилирование приводит к расщеплению хромосомы рестриктазами и смерти клетки N. gonorrhoeae, которая попыталась встроить в свой геном фрагменты ДНК другого вида [258, 259]. Примечательно, что другие естественно-компетентные роды, такие как Streptococcus, Helicobacter, Moraxella и Haemophilus, также обладают большим количеством систем рестрикции-модификации [257], которые, вероятно, защищают их от попадания чужеродной ДНК и способствуют сохранению клональных линий. Впрочем, вопреки этим барьерам, межвидовая рекомбинация in vitro и in vivo отражает важность комменсальных Neisseria, особенно близкородственных N. gonorrhoeae, как резервуаров генетических вариаций и детерминант лекарственной устойчивости гонококка.

Фазовые и антигенные вариации

Фазовая вариация – это случайное обратимое переключение фазы экспрессии гена в состояние включена/выключена, либо изменение уровня экспрессии в определенных границах [231]. Антигенная же вариация не регулирует экспрессию гена, а изменяет последовательность белка, что приводит к потенциальному появлению нескольких форм антигена (например, сдвиг рамки считывания может приводить к экспрессии трех разных продуктов). Геномы патогенных N. gonorrhoeae и N. meningitidis содержат в среднем 54 и 47 фазово- и антигенно-вариабельных генов соответственно [260]. Не всегда, но часто эти гены кодируют факторы патогенности, а их высокая изменчивость может быть вызвана необходимостью уходить от иммунного ответа. Так, типичными фазово- и антигенно-вариабельными локусами являются гены пилей IV типа, адгезинов, белков мутности Opa и биосинтеза LOS.

Некоторые фазовые и антигенные вариации можно наблюдать фенотипически, например, при взаимопревращении типов морфологии колоний. Культуры первичных изолятов, выделенных при острой гонорее, дают в основном вирулентные, имеющие пили, колониальных типов Т1 и Т2. После нескольких пассажей на агаре они утрачивают эти свойства, переходя в авирулентные типы Т3 и Т4, у которых нет пилей [261, 262], которые, впрочем, могут быть восстановлены при селективном пересеве в определенных условиях. Частота фазовых и антигенных переходов пилей (P+/P-) и белков мутности (Opa+/Opa-) может достигать 10^–2–10^–3 событий на колонию за поколение [263, 264]. При этом такая частота слишком высока, чтобы ее можно было объяснить классическими мутационными событиями.

Фазовые вариации из-за неспаривания скользящей цепи (SSM)

Большинство фазовых вариаций у Neisseria возникают в результате ошибок репликации нуклеотидных повторов. Данный механизм носит название “неспаривание скользящей цепи” (slipped-strand mispairing, SSM), при котором один повтор спаривается с соседним на противоположной цепи, что приводит к проскальзыванию ДНК-полимеразы. Затем в этот локус направляются белки системы репарации, после чего повтор либо вырезается, либо дублируется, при этом частота последнего события выше. В случае нарушений в системе репарации mutS/mutL частота фазовых вариаций может повышаться в 100–1000 раз [265]. Число нуклеотидных повторов в последовательности зависит от генетической изменчивости локуса: большее число повторов приводит к увеличению скорости изменчивости и наоборот [266]. Кроме того, чем длиннее повтор, тем меньше его копий нужно для обеспечения высокой частоты мутаций. Среди гомополимерных повторов у N. meningitidis и N. gonorrhoeae наиболее часто встречаются (G)^9–26 и (T)^11–30, а среди тандемных повторов – (GC)⁶, (CTTG)^5–34, (CTTCT)^5–24, (CAACCG)³, (GCGCGT)³, (TAGGCT)³, (CATTTCT)^3–22 и (GCCAAAGTT)^5–25 [260].

Наиболее распространенными простыми короткими нуклеотидными повторами у микроорганизмов рода Neisseria, вовлеченными в процесс фазовой вариабельности, являются poly(G)-повторы, чаще всего расположенные в кодирующей области гена около 5’-конца [260, 267]. Проскальзывания в повторе приводят к сдвигу рамки считывания и трансляции дефектного белка, либо к образованию стоп-кодона и остановке трансляции. В качестве известных примеров можно привести гены пилина (pilC) [268], гемоглобинсвязывающих белков (hpuA/hpuB) [269], а также pglA [270] и lgtA/lgtC/lgtD [271], ответственных за гликозилирование пилей и биосинтез LOS соответственно. С другой стороны, если повтор находится ближе к 3’-концу, то SSM может приводить к переключению между тремя рамками считывания на C-конце кодируемого белка, результатом которого является антигенная вариация. Например, этому подвержен полиморфный ген токсина (mafB) [267], который, как полагают, способствует конкуренции между видами и штаммами в пределах одной ниши [272]. Гомополимерные повторы также встречаются в промоторных областях, где SSM изменяет расстояние между положениями –10 и –35, влияя на эффективность транскрипции. Примеры такого рода фазовых вариаций обнаружены в менингококковых генах порина (porA) [273] и белка внешней мембраны (opc) [274], а также гонококкового рецептора сидерофора (fetA), участвующего в поглощении железа [275].

Тандемные повторы встречаются реже гомополимерных [260, 276], среди них наиболее распространены (CTCTT)ⁿ-повторы в генах белков мутности (opa). Почти в каждой из копий гена ближе к 5’-концу локализован участок CTCTT длиной от 5 до 24 повторов. Кроме того, из-за высокого нуклеотидного сходства копии opa могут гомологично рекомбинировать друг с другом (генная конверсия), порождая еще больший репертуар белков мутности [277]. Встречаются также внутригенные тандемные повторы, по длине кратные трем, не приводящие к сдвигу рамки считывания, что обеспечивает генерацию структурного разнообразия белков [278]. Например, они с разной копийностью присутствуют в виде повторов длиной 15 п. н. в генах липопротеинового антигена (lip) [279], 24 п. н. в гене поринового канала (pilQ) [280] и 108 п. н. в гене деления и биосинтеза клеточной стенки (dcaC) [281].

Интересно, что фазовые вариации в одних генах могут влиять на эпигенетическую модификацию множества других. Тандемные повторы (AGCC)ⁿ и (CCCAA)ⁿ вызывают фазовые вариации в генах метилтрансфераз (modA и modB), соответственно, входящих в систему рестрикции-модификации типа III. Показано, что указанные выше изменения приводят к изменению паттернов метилирования в промоторах, влияя на уровень экспрессии десятков генов, формирование биопленок и взаимодействие с эпителиальными клетками человека [282, 283].

Фазовые вариации на уровне генной конверсии

Генная конверсия происходит в результате гомологичной рекомбинации схожих фрагментов ДНК, что приводит к фазовым или антигенным вариациям. Часто эти фрагменты расположены в виде генных кассет и уровень разнообразия, вносимого конверсией, зависит от числа генов в кассете и их вариабельности [284]. Генная конверсия определяет антигенную вариабельность пилей N. gonorrhoeae. Разбросанные по хромосоме кассеты беспромоторных усеченных генов pilS, гомологичных гену основной субъединицы пилина pilE, служат для него резервуаром вариабельной генетической информации.

Геном гонококка обычно содержит четыре–пять кассет, несущих суммарно до 19 генов pilS, менингококка – одну кассету с четырьмя–шестью pilS [285]. Перенос гомологичной ДНК из копии pilS в экспрессирующийся pilE происходит независимо от RecBCD [286] за счет RecF-подобных белков (RecA), причем для события рекомбинации необходим G4-квадруплекс [42]. Частота рекомбинации в pilE является одной из самых высоких среди систем генной конверсии у патогенных микроорганизмов, она может достигать 6.8 × 10^–3 событий на клетку за поколение, способствуя уклонению от действия иммунной системы [287].

Геномные перестройки

Известно, что порядок генов на хромосоме прокариот часто изменяется в процессе эволюции и, как правило, быстрее, чем аминокислотные последовательности, которые они кодируют [288–291]. Геномные перестройки могут происходить в результате событий гомологичной, сайт-специфической и незаконной рекомбинации: инсерций, делеций, инверсий и транслокаций. При этом частота перестроек коррелирует с состоянием систем репарации/рекомбинации и количеством мобильных элементов в геномах [291, 292]. В ходе сравнения трех геномов филогенетически удаленных молекулярных типов N. gonorrhoeae были выявлены крупномасштабные хромосомные перестройки [293]. Показано также, что перестройки могут происходить за относительно небольшой промежуток времени (8 недель) в лабораторных условиях под воздействием стресса (повышенной температуры и добавления сублетальной концентрации хинолонового антибиотика – налидиксовой кислоты) [294].

При этом в “горячих точках” между перестроенными фрагментами генома (синтенными блоками) обнаруживают последовательности профагов (NgoФ1–9) и других мобильных элементов, таких как инсерционные элементы IS (IS5, IS110, IS1595) и MITE (miniature inverted-repeat transposable elements). К последним относят нейссериальные межгенные мозаичные элементы (NIME) длиной 70–200 п. н. (в среднем 80 на геном); элементы Корреи (CREE) длиной 100–150 п. н. (126 на геном); элементы Спенсера–Смита (SSREE) длиной 650 п. н. (три на геном) [295]. Вовлеченность перечисленных мобильных элементов в процесс перестроек различна, лишь менее половины (44%) событий перестройки можно объяснить их присутствием в горячих точках [295].

Изучение взаимосвязи перестроек с филогенетической близостью N. gonorrhoeae и N. meningitidis показало, что количество перестроек в популяции гонококка не зависит от молекулярного типа изолята и слабо коррелирует (ρ = 0.33)с филогенетической близостью, тогда как у N. meningitidis такая корреляция существует (ρ = 0.62) [295]. Вероятным объяснением может быть тот факт, что популяция менингококков обладает примерно в 6 раз большим нуклеотидным разнообразием, чем популяция гонококков, которая, по-видимому, не так давно прошла через бутылочное горлышко [295].

Известно, что геномные перестройки могут влиять на экспрессию генов. Например, многие IS-элементы содержат на своих концах ориентированные наружу –35 промоторные фрагменты, поэтому вставка на правильном расстоянии от подходящего мотива –10 может привести к усилению транскрипции [296]. У представителей рода Neisseria роль регуляторов экспрессии могут играть элементы CREE, также фланкированные промоторными фрагментами. Подвергаясь инверсии под воздействием стресса [297] и находясь в горячих точках рекомбинации [293, 295], они способны влиять на транскрипцию близлежащих генов. Так, у N. meningitidis транскрипция генов эффлюкс-помпы MtrCDE управляется CREE-элементом, находящимся неподалеку от промотора [298]. Кроме того, элементы NIME, служащие сайтами для гомологичной и сайт-специфической рекомбинаций, могут способствовать как генерации новых мозаичных аллелей ближайших генов, так и протеканию фазовых и антигенных вариаций в них. Тем не менее, несмотря на приведенные примеры, влияние геномных перестроек на фенотип и экспрессию генов у N. gonorrhoeae и других представителей рода Neisseria пока остается малоизученным.

ДИАГНОСТИКА ГОНОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

Микроскопическая (бактериоскопическая) диагностика

Микроскопическая диагностика основана на исследовании нативных или окрашенных препаратов в оптическом микроскопе. Анализируют отделяемое уретры у мужчин или отделяемое эндоцервикса у женщин. Мазки исследуют в два этапа: 1) окраска по Граму для сокращения списка предполагаемых возбудителей, вызывающих сходные симптомы; 2) окраска метиленовым синим или бриллиантовым зеленым с целью выявления микроорганизмов рода Neisseria с характерной морфологией и расположением относительно нейтрофилов и клеток эпителия [299, 300]. К отличительным морфологическим признакам нейссерий относятся бобовидная форма и парное расположение: снаружи кокки имеют выпуклую поверхность, вогнутой стороной они обращены друг к другу. При острой инфекции в препаратах отделяемого пациентов гонококки обнаруживаются внутри нейтрофилов и на поверхности клеток плоского эпителия. В препарате, окрашенном по Граму, гонококки выглядят оранжево-красными, контрастируя с фиолетовыми ядрами лейкоцитов и клеток эпителия. В окрашенных метиленовым синим препаратах темно-синие диплококки выделяются цветом и размером на фоне голубой цитоплазмы, синих ядер эпителиальных клеток и нейтрофилов [300].

К преимуществам микроскопического метода относятся быстрота, низкая стоимость, высокая чувствительность и специфичность (>95%) анализа мазков из уретры. Основные недостатки – низкая чувствительность анализа цервикальных проб (45–65%), неприменимость для фарингеальных и ректальных проб, а также в случае ранней и бессимптомной гонореи. По этим причинам микроскопию рекомендуют применять только в совокупности с другими методами [301, 302] (рис. 5).

 

Рис. 5. Методы обнаружения N. gonorrhoeae в биологических образцах человека и/или определения МПК.

 

Культуральная (бактериологическая) диагностика

Культуральная (бактериологическая) диагностика, основанная на получении культуры N. gonorrhoeae с использованием селективных питательных сред с последующей идентификацией вида по биохимическим и морфологическим признакам, является золотым стандартом [301]. Для выделения культуры гонококка применяют среды Тайера–Мартина, Мартина–Льюиса, Нью-Йоркский агар. Все эти методы основаны на шоколадном агаре с добавлением различных антибиотиков, подавляющих рост грамположительных кокков, энтеробактерий и грибов. Взятые образцы немедленно высевают на предварительно прогретые до 37°C чашки с плотной питательной средой. После 24 ч инкубации при 37°C в атмосфере 5% CO₂ колонии гонококка могут иметь диаметр 0.5–2.0 мм и округлую форму с блестящей поверхностью. Они могут быть как прозрачными, так и непрозрачными, бесцветными или беловатыми, иметь разную консистенцию и степень выпуклости. Наиболее характерные колонии маркируют для приготовления окрашиваемых по Граму препаратов. Микроскопически оценивают чистоту культуры, в идеале наблюдают монокультуру грамотрицательных диплококков, не образующих гроздей или цепочек, свойственных стрептококкам и стафилококкам. Посевы на чашках, не давшие роста, вновь помещают в CO₂-инкубатор. При отсутствии признаков роста через 48–72 ч инкубации наблюдение прекращают. Дополнительно измеряют МПК антибиотиков, используя либо диско-диффузионный метод, либо метод серийных разведений в агаре и др. [299, 300].

Морфологические свойства колоний N. gonorrhoeae могут сильно варьировать вследствие частых фазовых вариаций, что затрудняет идентификацию возбудителя. Во избежание этого проводят качественные реакции на активность оксидазы, каталазы и расщепление сахаров. Свежеприготовленный 1%-ный раствор ди- или тетраметил-п-фенилендиамина вступает в реакцию с Neisseria, окрашивая колонию в розово-фиолетовый цвет. В каталазном тесте используют 3–30%-ный пероксид водорода, обильное выделение пузырьков кислорода свидетельствует о принадлежности колонии к Neisseria spp. Поскольку все представители рода Neisseria оксидазо- и каталазоположительные, для видовой идентификации дополнительно анализируют метаболизм сахаров. В ряду моносахаридов, которые Neisseria spp. могут использовать в качестве субстрата, N. gonorrhoeae расщепляет исключительно глюкозу [299, 300].

Кроме того, для видовой идентификации применяют коммерческие тест-системы Vitek 2 NH system (“bioMerieux”, Франция), Rapid NH system (“Thermo Fischer Scientific”, США), BBL Crystal NH ID system (“Becton Dickinson”, США). Они могут включать до нескольких десятков биохимических тестов в одной панели, что позволяет выявлять множество микроорганизмов, что важно при коинфекциях. К преимуществам бактериологического метода по сравнению с бактериоскопическим относится высокая чувствительность (80–90%) и специфичность (до 100% при видовой идентификации), а также применимость к широкому спектру образцов. Эффективность этого метода особенно важна при исследовании патологического материала, полученного из цервикального канала, экстрагенитальных очагов инфекции и при диагностике гонореи у детей [299, 300].

Молекулярная диагностика

Широкое распространение получила масс-спектрометрическая идентификация гонококка (времяпролетная масс-спектрометрия с матрично ассоциированной лазерной десорбцией/ионизацией, MALDI-TOF), при которой получают протеомный спектр – “отпечаток пальца”, характерный для определенного микроорганизма [303]. MALDI-TOF хорошо зарекомендовал себя для выявления гонококка, а его прогностическая значимость может достигать 99.3% [304]. Что же касается обнаружения антител к N. gonorrhoeae, то ни один из молекулярно-иммунологических методов не позволяет отличить текущую инфекцию от инфекций, перенесенных в прошлом. Трудности вызывают и постоянные фазовые вариации поверхностных антигенов гонококка, способствующие его уклонению от иммунного ответа. Поэтому иммунологические методы, хорошо зарекомендовавшие себя для диагностики других инфекций, передающихся половым путем (сифилиса, трихомоноза), при гонорее не используются [301].

Для выявления возбудителя гонореи применяют также молекулярно-генетические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот возбудителя (NAAT – Nucleic Acid Amplification Technologies) с последующей флуоресцентной детекцией продуктов амплификации (например, в ходе ПЦР в реальном времени или гибридизации на микрочипах). Тесты NAAT быстры, высокочувствительны (>95%) и специфичны (>99%), их можно проводить на широком спектре клинических образцов, при этом наличие жизнеспособных бактерий не требуется [305]. Многие из тестов многопараметрические и могут выявлять сразу несколько возбудителей ИППП (например, Chlamydia trachomatis вместе с N. gonorrhoeae).

Рынок молекулярной диагностики N. gonorrhoeae насыщен отечественными и зарубежными NAAT-тестами, такими как COBAS AMPLICOR (“Roche Diagnostics”, Швейцария), GeneXpert CT/NG assay (“Cepheid”, США), Abbott m2000 Real Time CT/NG assay (“Abbott”, США), BD Max CT/GC/TV (“Becton Dickinson”), ГОНО-ГЕН, Андрофлор (“ДНК-Технология”, Россия), AmpliSens NG (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), ГОНОПОЛ (НПФ “ЛИТЕХ”, Россия). Мишени для идентификации возбудителя включают гены 16S рРНК, белков мутности (opa) и адгезина (opcA), цитозин-метилтрансферазы (dcmG), гомолога белка инверсии пилей (pivNG), псевдоген porA гонококков, гены мобильных элементов [301, 305]. Следует учитывать, что на эффективность выявления возбудителя может влиять генетическая изменчивость гонококка. Показано, что потеря или модификация ДНК-мишени снижает чувствительность теста [306, 307], тогда как на специфичность влияет наличие в образце ДНК Neisseria spp., а также горизонтальный перенос ДНК от N. gonorrhoeae к Neisseria spp. [308, 309]. Кроме того, ДНК гонококка может присутствовать в урогенитальных образцах в течение 2 недель после успешного лечения, приводя к ложноположительным результатам тестирования [310]. Ключевым недостатком NAAT-диагностики в сравнении с бактериологическим методом является невозможность получения фенотипических данных об устойчивости изолята к антибиотикам, для чего требуется выделение чистой культуры.

Разнообразие молекулярных детерминант лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae не позволяет рассматривать тесты на основе ПЦР как оптимальные для идентификации широкого спектра генетических маркеров резистентности к АМП. Интенсивно разрабатываются новые методы выявления детерминант устойчивости и предсказания уровня МПК на основе данных о генотипе изолята [110, 177, 311]. Особенно информативным могут быть сведения о полном геноме N. gonorrhoeae, полученные с использованием методов высокопроизводительного секвенирования. Полногеномный анализ с помощью как коротких (“Illumina”, США; “MGI Tech”, Китай), так и длинных прочтений (“Охford Nanopore Technologies”, Великобритания), как правило, проводят, используя геномную ДНК изолятов, выращенных на специальных микробиологических средах [312]. Задачу получения геномных данных из клинических образцов N. gonorrhoeae без предварительного культивирования изолятов можно решить, используя процедуру целевого обогащения (target enrichment) [313], позволяющую перед секвенированием увеличить концентрацию геномов или геномных фрагментов, представляющих интерес. Процедура основана на применении биотинилированных РНК-олигонуклеотидных зондов, дающих возможность захватывать и увеличивать долю интересующих регионов путем гибридизации и выделения на магнитных частицах [313]. Вместе с тем, эффективность полногеномного анализа N. gonorrhoeae на клиническом материале еще предстоит установить.

Модели машинного обучения для предсказания устойчивости N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам

Технологии машинного обучения сегодня являются глобальным направлением развития научных исследований и клинической диагностики. Предсказание устойчивости к АМП становится неотъемлемым компонентом диагностических тест-систем и эпидемиологических баз данных. Устойчивые тенденции увеличения объема данных и развития методов их анализа дают надежду на увеличение чувствительности и специфичности предсказательных моделей.

Существующие методы предсказания устойчивости N. gonorrhoeae к АМП можно концептуально разделить на два класса, различающихся априорными данными о генетических детерминантах лекарственной устойчивости. В первом случае в качестве размеченных данных выступают значения МПК и сведения о выявленных детерминантах, во втором – значения МПК и весь геном патогена. Методы предсказания МПК можно подразделить на бинарные/тернарные (деление на устойчивые и чувствительные, либо устойчивые, промежуточные и чувствительные) и многоклассовые. В бинарных методах классификации, основанных на анализе известных детерминант, часто применяют логические правила и решающие деревья [314, 315]. Так, база данных Pathogenwatch (https://pathogen.watch/genomes/all?genusId=482&speciesId=485) содержит (на апрель 2024 г.) информацию о 38000 геномов N. gonorrhoeae и алгоритм предсказания устойчивости по бинарной/тернарной классификации к азитромицину, цефтриаксону, цефиксиму, ципрофлоксацину, тетрациклину, пенициллинам, спектиномицину, сульфаниламидам, используя данные о генетических детерминантах резистентности, автоматически определяемых при анализе генома [314]. На тестовой выборке значения специфичности и чувствительности предсказания устойчивости N. gonorrhoeae к различным АМП находились в диапазонах 61.3–99.9% и 33.3–99.2% соответственно [314]. В многоклассовой классификации по известным локусам применяют прежде всего регрессию [311, 316–318].

Согласно валидированным регрессионным моделям предсказания устойчивости N. gonorrhoeae к цефалоспоринам, наибольший вклад в увеличение МПК цефтриаксона внесли замены Ala501Pro, Ala311Val, Gly545Ser, вставка Asp(345–346) в ПСБ2, а также замена Gly120Arg в PorB [311, 316]. При сравнении моделей наибольшее значение точности и площади под кривой при ROC-анализе показано с использованием логистической регрессии, k-соседей, дерева решений и случайного леса [318].

В методах без априорного задания локусов (входными данными является последовательность полного генома) предсказание значений МПК сводится к задаче классификации или регрессии с применением методов машинного обучения. В качестве исходных данных берут набор нередуцированных перекрывающихся нуклеотидных k-меров из анализируемых геномов и значения МПК препаратов. Получают матрицу, в которой k-меры и значения МПК рассматриваются как признаки каждого генома. Для решения задачи классификации при предсказании МПК применяется, в том числе и для N. gonorrhoeae [319], метод решающих списков, называемый также “машиной покрывающих множеств” (set covering machine (SCM)), и метод случайного леса (СЛ) и СЛ-регрессия. Yasir и соавт. сравнивали разные методы машинного обучения без априорного задания локусов и получили наилучшие результаты на моделях случайного леса, CATBoost и XGBoost [320]. В работе Eyre и соавт. показана неравнозначная эффективность прогностических моделей на основе машинного обучения в случае разных лекарственных препаратов, что может быть объяснено размером выборки и ее несбалансированностью [317]. Может показаться, что предпочтительными являются модели предсказания МПК, построенные не по известным детерминантам, а по k-мерам. Однако сравнение эффективности прогностических моделей с использованием геномных наборов показало, что даже при относительно больших и фенотипически сбалансированных наборах данных нельзя ожидать, что алгоритмы машинного обучения смогут успешно моделировать сложные и разнообразные механизмы резистентности, особенно учитывая, что представленность механизмов резистентности в обучающих наборах данных априори неизвестна [319].

АЛЬТЕРНАТИВА ПРИМЕНЕНИЮ АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ В БОРЬБЕ С ГОНОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

Способность N. gonorrhoeae формировать устойчивость к АМП представляет глобальную угрозу и побуждает искать альтернативные методы борьбы с гонококковой инфекцией. Одним из таких подходов могла бы стать эффективная и доступная вакцина. Основные факторы, препятствующие разработке эффективной вакцины – антигенная и фазовая вариация потенциальных мишеней, а также отсутствие защитного иммунитета после инфекции. Первые попытки получить вакцину против N. gonorrhoeae были сделаны более 40 лет назад и стартовали с таких антигенов, как убитые клетки возбудителя [321] и пили [322]. За прошедшие годы были проанализированы антигены к компонентам внешней мембраны (PorB, Opa, OpcA, OmpA, OmpU), участникам метаболизма железа (TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, FetB), цинка (TdfJ, TdfH) и анаэробного метаболизма (AniA), эффлюксной помпе (MtrE) и многим другим клеточным компонентам [323]. Подающие надежды результаты получены при использовании менингококковой вакцины серогруппы B4CMenB (Bexsero) [324]. 4CMenB это многокомпонентная вакцина, содержащая четыре основных иммуногенных компонента, включая нейссериальный гепаринсвязывающий антиген (NHBA), слитый с геномным антигеном Neisseria GNA1030; fHbp, слитый с GNA2091; и нейссериальный адгезин А (NadA); обработанные детергентом OMV, содержащие белок PorA в качестве основного антигена [324]. К достоинствам менингококковых OMV следует отнести растворимость и нативную форму белковых антигенов внешней мембраны [325]. Интерес к изучению антигонококкового потенциала менингококковых вакцин возник после ретроспективного исследования пациентов из Новой Зеландии [326]. В данной работе показано, что снижение частоты диагностики гонореи (эффективность вакцины 31%) связано с вакцинацией MeNZB [326] – вакциной на основе OMV, выделенных из менингококкового штамма NZ98/254 [327]. В настоящее время вакцина 4CMenB находится на II–III фазах клинических исследований. Математическое моделирование последствий использования вакцины предсказывает значительное снижение уровня заболевания гонококковой инфекцией даже при низкой эффективности вакцин [328, 329].

Альтернативный метод терапии гонококковой инфекции может исходить из механизмов межвидовой борьбы бактерий, выраженной в продукции бактериоцинов, выработке токсичных липидов, конкуренции за питательные вещества. Бактериоцины – это белковые вещества, продуцируемые одной бактерией и обладающие бактерицидной активностью против того же или родственного вида бактерий. Считается, что летальное действие бактериоцинов обусловлено их связыванием с поверхностными рецепторами с последующим взаимодействием с внутриклеточной мишенью. Ряд штаммов стафилококка содержит плазмиду вирулентности 56S, которая кодирует бактериоцин “Bac R1”. Показано, что он ингибирует рост значительного количества грамположительных бактерий, а также и N. gonorrhoeae. Потеря жизнеспособности 7/7 штаммов гонококка через 30 мин роста составила около 90%, а через 5 ч достигла 99.9% [330]. Показано что пиоцины – бактериоцины, вырабатываемые P. aeruginosa, также подавляют рост Neisseria, в том числе 56/56 протестированных штаммов N. gonorrhoeae, 3/20 N. meningitidis и 5/16 N. lactamica [331]. Гибель гонококков происходила одномоментно и требовала всего одну молекулу пиоцина на колониеобразующую единицу, сопровождаясь эндогенным лизисом. Однако выяснилось, что N. gonorrhoeae может развивать устойчивость к бактериоцинам P. aeruginosa, изменяя структуру LOS последовательными делециями и инсерциями сахаридов [332].

Исследовано подавление роста N. gonorrhoeae in vitro с использованием микроорганизмов, титры которых в вагинальном или цервикальном секрете превышают 10⁵ КОЕ/мл. Установлено, что большинство штаммов S. epidermidis, S. aureus, меньшинство штаммов S. viridans, Neisseria spp., Candida и Bifidobacterium могут ингибировать рост гонококка [333]. Помимо этого, во влагалище обитает около 50 различных видов микроорганизмов, например Lactobacillus. Вырабатывая молочную кислоту, лактобациллы могут способствовать поддержанию низкого уровня рН во влагалище, что может подавлять рост других бактерий. Так, колонизация Lactobacillus sp., продуцирующими пероксид водорода, ассоциирована с более низкой частотой гонореи [334].

Отношения между культурами клеток облигатно-патогенных и комменсальных нейссерий далеки от благоприятных. N. cinerea [335] подавляет рост N. meningitidis в культуре эпителиальных клеток, а ДНК, выделяемая N. elongata и несколькими другими непатогенными видами Neisseria, способна убивать N. gonorrhoeae [258]. Aho и соавт. [336] сообщали об антимикробной активности N. mucosa по отношению к N. gonorrhoeae, хотя позднее это было опровергнуто [337]. Обнаруженная же способность N. cinerea подавлять рост N. meningitidis и N. gonorrhoeae обусловлена экспрессией системы секреции типа VI (T6SS), что не стало сюрпризом [338]. T6SS – это одна из важнейших систем межвидовой борьбы, она присутствует более чем в 25% всех грамотрицательных бактерий и способна вводить токсины как в другие бактерии, так и в эукариотические клетки [339].

Еще одной альтернативой борьбы с гонококковой инфекцией могла бы стать фаговая терапия [340, 341]. К преимуществам бактериофагов относится их нетоксичность и специфичность, а значит и отсутствие неблагоприятного влияния на микробиом человека. Сообщается об успешной терапии уропатогенной E. coli [342]. Основная проблемой фаговой терапии – выделение литических фагов. В 1955 году был описан полученный из смывов носоглотки человека бактериофаг, активный против ряда штаммов N. perflava [343]. Проверить активность этого фага в отношении N. gonorrhoeae не удалось, но была показана его активность в отношении N. subflava, N. sicca, N. flavescens, M. catarrhalis и N. meningitidis [343]. В 1967 г. выделены фаги с лизогенной активностью в отношении нескольких штаммов N. perflava и N. subflava, однако не удалось добиться эффективного лизиса N. gonorrhoeae этими фагами [344]. В 2021 г. описали антигонококковую активность орофарингеальных и аноректальных смывов в отношении клинических штаммов N. gonorrhoeae [345]. Наблюдали образование фаговых бляшек, но попытка выделения антигонококкового бактериофага закончилась неудачно [345]. Таким образом фаговая терапия имеет большой потенциал, но пока еще остается темой для умозрительных рассуждений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокая генетическая пластичность позволяет N. gonorrhoeae формировать устойчивость ко всем терапевтическим антимикробным препаратам, что на фоне множества механизмов ускользания от иммунного ответа справедливо ставит гонококк в ряд патогенов, представляющих глобальную угрозу. Для отслеживания тенденций в развитии устойчивости к антимикробным препаратам необходим постоянный мониторинг с применением глубокого секвенирования гонококковой, менингококковой и комменсальной популяций Neisseria spp. Усилия, предпринимаемые на пути разработки вакцин, а также новых антимикробных препаратов и альтернативных методов терапии, оставляют надежду на возможность благоприятного прогноза развития эпидемиологической ситуации, возможного при комплексном подходе к решению вопроса о гонококковой инфекции, сочетающего не только терапию, но и профилактику.

Авторы благодарят В.С. Гоголеву за ценные замечания и предложения при обсуждении раздела “Развитие инфекции и патогенез”.

Работа выполнена при поддержке Соглашения с Министерством науки и высшего образования РФ № 075-15-2019-1660 на осуществление государственной поддержки создания и развития центра геномных исследований мирового уровня “Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины” ИМБ РАН в рамках реализации Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019–2027 годы.

Работа выполнена без привлечения людей и животных в качестве объектов изучения.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Б. Л. Шаскольский

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: bls@shaskolskiy.ru
Россия, Москва, 119991

И. Д. Кандинов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: bls@shaskolskiy.ru
Россия, Москва, 119991

Д. А. Грядунов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: bls@shaskolskiy.ru
Россия, Москва, 119991

Д. В. Кравцов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: bls@shaskolskiy.ru
Россия, Москва, 119991

Список литературы

Дополнительные файлы