Substrate behavior of dissimilar CY5-deoxypyrimidine nucleotides in PCR with DNA matrices of different GC-composition

Cover Page

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

The substrate properties of six pairs of fluorescently labeled deoxyuridine and deoxycytidine triphosphates (Cy5-dUTPs and Cy5-dCTPs) in PCR with Taq polymerase were compared. In each pair, the modified dU and dC contained identical fluorescently labeled Cy5 substituents; for different pairs, the substituent structures differed in the length of the linker between the nitrogenous base and the fluorophore, the length of the linker between the quaternary ammonium group and the second heterocycle of the fluorophore, as well as the structure of the fluorophore itself. DNA fragments of Staphylococcus aureus (AT-rich template) and Mycobacterium tuberculosis (GC-rich template) were used as matrices. With both templates, deoxycytidine derivatives showed slightly higher amplification efficiency (E). The influence of the fluorophore structure and the GC-composition of the template on the kinetics of the reaction was insignificant. At the same time, a high incorporation efficiency was observed on the AT-rich matrix for uridine derivatives, and on the GC-rich matrix for cytidine derivatives (and in both cases — for substituents with a longer linker length). Nevertheless, the specific incorporation density, which takes into account the number of similar nucleotides in the DNA chain, was in all cases higher for dU derivatives. It was found that in pairs with similar fluorophore modifications, uridine derivatives, compared with cytidine, are characterized by a higher incorporation density, regardless of the composition of the template, but at the same time they have a greater inhibitory effect. The results obtained will increase the sensitivity of fluorescence analysis using the immobilized phase (microarray analysis).

Full Text

Restricted Access

About the authors

P. M. Monakova

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: polina.monakova02@gmail.com
Russian Federation, Moscow

V. E. Shershov

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: polina.monakova02@gmail.com
Russian Federation, Moscow

V. E. Kuznetsova

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: polina.monakova02@gmail.com
Russian Federation, Moscow

A. V. Chudinov

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: polina.monakova02@gmail.com
Russian Federation, Moscow

S. A. Lapa

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: polina.monakova02@gmail.com
Russian Federation, Moscow

References

  1. Salic A., Mitchison T.J. (2008) A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2415–2420.
  2. Smith C.I.E., Zain R. (2019) Therapeutic oligonucleotides: state of the art. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 59, 605–630.
  3. Yu H., Chao J., Patek D., Mujumdar R., Mujumdar S., Waggoner A.S. (1994) Cyanine dye dUTP analogs for enzymatic labeling of DNA probes. Nucl. Acids Res. 22, 3226–3232.
  4. Lapa S.A., Chudinov A.V., Timofeev E.N. (2016) The toolbox for modified aptamers. Mol. Biotechnol. 58, 79–92.
  5. Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Лысов Ю.П., Гусейнов Т.О., Барский В.Е., Спицын М.А., Заседателева О.А., Василисков В.А., Суржиков С.А., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2015) Влияние заряда хромофора на эффективность включения флуоресцентно-меченных нуклеотидов при матричном синтезе ДНК Taq-полимеразой. Биофизика. 60, 1216–1218.
  6. Лапа С.А., Гусейнов Т.О., Павлов А.С., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2020) Одновременное применение Cу5-модифицированных производных дезоксиуридина и дезоксицитидина в ПЦР. Биоорган. химия. 46, 418–424.
  7. Лисица Т.С., Шершов В.Е., Спицын М.А., Гусейнов Т.О., Иконникова А.Ю., Фесенко Д.О., Лапа С.А., Заседателев А.С., Чудинов А.В., Наседкина Т.В. (2017) Кинетика флуоресцентного маркирования ДНК с помощью полимеразной цепной реакции в зависимости от химического строения модифицированных нуклеотидов при использовании различных Taq-полимераз. Биофизика. 62, 49–56.
  8. Лапа С.А., Волкова О.С., Спицын М.А., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Гусейнов Т.О., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2019) Эффективность амплификации и субстратные свойства флуоресцентно-меченных трифосфатов дезоксиуридина в ПЦР с ДНК-полимеразами, не обладающими 3ʹ-5ʹ-экзонуклеазной активностью. Биоорган. химия. 45, 392–402.
  9. Spitsyn M.A., Kuznetsova V.E., Shershov V.E., Emelyanova М.А., Guseinov T.O., Lapa S.A., Nasedkina T.V., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. (2017) Synthetic route to novel zwitterionic pentamethine indocyanine fluorophores with various substitutions. Dyes Pigments. 147, 199–210.
  10. Zasedateleva O.A., Vasiliskov V.A., Surzhikov S.A., Kuznetsova V.E., Shershov V.E., Guseinov T.O., Smirnov I.P., Yurasov R.A., Spitsyn M.A., Chudinov A.V. (2018) dUTPs conjugated with zwitterionic Cy3 or Cy5 fluorophore analogues are effective substrates for DNA amplification and labelling by Taq polymerase. Nucl. Acids Res. 46, e73.
  11. Шершов В.Е., Лапа С.А., Левашова А.И., Шишкин И.Ю., Штылев Г.Ф., Шекалова Е.Ю., Василисков В.А., Заседателев А.С., Кузнецова В.Е., Чудинов А.В. (2023) Синтез флуоресцентно-меченных нуклеотидов для маркирования продуктов изотермической амплификации. Биоорган. химия. 49, 649–656.
  12. Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. (2003) Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci. Lett. 339, 62–66.
  13. Peirson S.N., Butler J.N., Foster R.G. (2003) Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis. Nucl. Acids Res. 31, e73.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
2. Fig. 1. Structural formulas of fluorescent dyes Dye 1 (a), Dye 2 (b), Dye 3 (c), fluorescently labeled 5-allylamine-2ʹ-deoxyuridine-5ʹ-triphosphate (AAdUTP) (d) and 5-allylamine-2ʹ-deoxycytidine-5ʹ-triphosphate (AAdCTP) (d).

Download (403KB)
3. Fig. 2. The rate of accumulation of the PCR product on the AT-rich S. aureus matrix (a) and the GC-rich M. tuberculosis matrix (b) using dUss and dCss as an example. Control is a sample without modified deoxyribonucleoside triphosphates.

Download (263KB)

Copyright (c) 2025 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».