Применение гигантского комбинационного рассеяния для повышения чувствительности МТТ-теста

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

В настоящее время при лечении инфекционных заболеваний часто применяют эмпирические схемы терапии, не основанные на данных о резистентности возбудителя. Одна из главных причин необоснованного назначения антибактериальных препаратов – отсутствие быстрых и в то же время универсальных методов определения антибиотикорезистентности патогена. Наиболее широко применяемые культуральные технологии, такие как метод микроразведений, требуют длительного времени для наращивания нужного количества бактериальных клеток. Менее времязатратные методы оценки резистентности (геномные или протеомные) базируются на определении специфических маркеров (генов устойчивости, сверхэкспрессии определенных белков и др.); при этом конкретный протокол чаще всего применим к узкому числу как штаммов микроорганизмов, так и антибиотиков. Ранее нами продемонстрирована возможность применения технологии спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) света для количественного определения продукта жизнедеятельности бактериальных клеток в МТТ-тесте – формазана, – причем напрямую, в клеточной суспензии. Отсутствие стадии выделения формазана упрощает анализ и повышает его точность. Время проведения исследования не превышало 2 ч при сохранении универсальности самого МТТ-теста. К ограничениям разработанного протокола по КР-детекции результатов МТТ-теста следует отнести высокий порог чувствительности по концентрации бактериальных клеток – 107 КОЕ/мл, в связи с чем образцы с низким содержанием бактерий проходят предварительную стадию культивирования. Здесь мы предлагаем способ повышения чувствительности определения формазана за счет использования эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) на наночастицах золота. В результате проведенного исследования подобраны оптимальные условия проведения ГКР-спектроскопии формазана как в растворе, так и в суспензии клеток Escherichia coli. Усиление сигнала формазана за счет применения ГКР на наночастицах золота позволило снизить порог чувствительности по числу бактериальных клеток в образце не менее чем в 30 раз – до 3 × 105 КОЕ/мл. Такая чувствительность не предел возможности разработанного протокола ГКР – введение в эксперимент других типов наночастиц, например оптимизированных по форме, размеру, концентрации, может дать дополнительное усиление ГКР-сигнала.

Полный текст

Сокращения: МТТ – 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид; КР – комбинационное рассеяние; ГКР – гигантское комбинационное рассеяние.

ВВЕДЕНИЕ

Устойчивость к противомикробным препаратам была отнесена Всемирной организацией здравоохранения к числу 10 главных проблем медицины еще в XX веке [1]. Устойчивые к препаратам инфекции стали причиной (прямой или косвенной) 4.95 млн. смертей в 2019 г. [2]. Если не будут приняты меры по сдерживанию распространения лекарственно устойчивых инфекций, они станут самой частой причиной смертности к 2050 году, вызывая более 10 млн. смертей ежегодно [3]. Устойчивость бактерий к антибактериальным препаратам развивается очень быстро из-за широкого применения антибиотиков в различных сферах деятельности человека [4]. Практически ко всем используемым антибиотикам у бактерий развивается резистентность, в том числе и к недавно вошедшим в клиническую практику. Так, последний принципиально новый класс антибиотиков был открыт в 1986 г. – в результате выделения дактиномицина из почвенных микроорганизмов – и впоследствии одобрен для клинического использования [5].

Устойчивые к антибиотикам микроорганизмы вызывают тяжелые, трудноизлечимые заболевания, отличающиеся от чувствительных возбудителей более длительным течением и повышенной летальностью [6]. Наибольшую опасность представляют мультирезистентные бактерии, такие как метициллинрезистентный золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), смертность от которого достигает 38% [7, 8]. При лечении тяжелых бактериальных инфекций важно своевременно начать этиотропное лечение. В клинической практике часто применяют эмпирические схемы медикаментозной терапии, не основанные на данных о резистентности инфекционного агента. Эмпирические схемы позволяют быстро начать лечение, что важно при тяжелом течении заболевания [9], однако они часто оказываются неэффективными [10, 11] или приводят к ухудшению состояния пациента [12]. Одна из причин выбора эмпирических методик терапии – длительность проведения анализов на антибиотикорезистентность. Для этого чаще всего используют культуральные методы [13] (диско-диффузионный, микроразведений, Е-тест, автоматизированные тест-системы), главное ограничение которых заключается в необходимости культивирования клинического бактериального изолята [14]. Есть более быстрые методы определения антибиотикорезистентности, в том числе основанные на идентификации генов устойчивости методом ПЦР (например, GeneXpert MTB/RIF – тест на устойчивость Mycobacterium tuberculosis к рифампицину [15]). Однако ограничения есть и у этих методов. Так, протокол молекулярно-генетического анализа обычно предназначен для исследования конкретного микроорганизма или антибиотика и не подходит для других патогенов. Кроме того, идентифицированный ген антибиотикорезистентности может нести мутацию или быть функционально неактивным, что приведет к ложноположительному результату [14].

Оценка метаболической активности бактерий с использованием МТТ-теста. МТТ-тест основан на ферментативном восстановлении тетразолиевых солей, обычно 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолбромида (МТТ), до соответствующих формазановых красителей (рис. 1).

 

Рис. 1. Реакция восстановления МТТ.

 

Восстановление МТТ катализируется NADH-зависимыми оксидоредуктазами, активность которых напрямую зависит от метаболизма клетки, поэтому по скорости реакции и количеству полученного формазана можно определить жизнеспособность исследуемых клеток. МТТ вводят в клеточную суспензию и через определенное время детектируют образовавшийся формазан спектрофотометрически, предварительно экстрагировав его органическими растворителями [16]. Наиболее широко МТТ-тест используют для оценки жизнеспособности эукариотических клеток [17], в том числе при исследовании цитотоксичности потенциальных лекарственных средств [18, 19], пролиферативной активности клеток [20, 21], чувствительности злокачественных опухолей к химиопрепаратам [22, 23] и других. Несмотря на тот факт, что механизм восстановления тетразолов в клетках прокариот изучен плохо, в настоящее время МТТ-тест используют и для прокариот [24]: идентификации резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis [25, 26], поиска соединений с антибактериальной активностью [27, 28], анализа биопленкообразования [29], антибактериальной активности нейтрофилов [30, 31].

Спектроскопия комбинационного рассеяния. Спектроскопия комбинационного рассеяния (КР; англ. эквивалент – Raman spectroscopy) – не разрушающий образцы, высокоспецифичный метод детекции соединений, основанный на неупругом (комбинационном) рассеянии света. Рассеянный таким образом свет отличается по энергии от изначального, величина сдвига дает информацию о колебательных модах в системе [32]. Рамановская спектроскопия позволяет получать “отпечатки пальцев”, уникальные для каждого соединения и отражающие его структуру. Именно поэтому спектроскопию КР широко используют для изучения структурных превращений биомолекул [33, 34], детекции онкомаркеров [35–37], идентификации микроорганизмов [38, 39]. Низкая интенсивность КР-света может служить ограничением метода там, где требуется высокая чувствительность.

Определение формазана в МТТ-тесте методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) вместо традиционного спектрофотометрического метода имеет ряд преимуществ. Так, высокая специфичность КР позволяет определять формазан непосредственно в образце и тем самым исключить стадию экстракции формазана органическими растворителями. Это упрощает процесс пробоподготовки и позволяет избежать осаждения белков органическими растворителями, что искажает оптические характеристики исследуемого образца [40]. Спектрофотометрический метод примерно на два порядка [41] менее чувствителен, чем спектроскопия ГКР, поэтому для образования достаточного для анализа количества формазана требуется длительная инкубация бактерий с МТТ, особенно в случае медленно растущих штаммов [24].

Интенсивность и число характеристических полос формазана и МТТ в спектрах ГКР зависят от выбора длины волны возбуждающего излучения. МТТ имеет наиболее интенсивный спектр при облучении коротковолновым синим (325 нм) лазером, тогда как для определения формазана оптимален красный (633 нм) лазер [41]. Вследствие того, что длина волны красного лазера близка к максимуму оптического поглощения формазана, возникает эффект резонансного КР, проявляющийся в увеличении интенсивности характеристических полос формазана и появлению дополнительных. В спектрах МТТ и формазана интенсивность полос со сдвигом 992 и 967 см‒1 соответственно имеет линейную зависимость от концентрации (для формазана при облучении лазером с длиной волны 633 нм такую зависимость имеет также полоса 722 см‒1). Таким образом, эти полосы могут быть использованы для количественного определения этих двух соединений [42].

Определение антибиотикорезистентности. Ранее нами разработан быстрый метод определения антибиотикорезистентности на основе МТТ-теста для прокариот (см. “Экспериментальная часть”), который основан на изменении количества формазана, вырабатываемого бактериями, вследствие подавления их жизнедеятельности антибактериальными препаратами. Скорость изменения активности бактерий под действием антибиотиков достаточно высокая, поэтому достоверные различия в выработке формазана чувствительными и устойчивыми штаммами регистрируют в течение 30–60 мин после введения антибиотика. К преимуществам метода относятся небольшая длительность анализа (всего 1–2 ч) и универсальность (применим для широкого спектра бактерий и антибактериальных препаратов). Использование метода КР для определения формазана непосредственно в образце упрощает проведение анализа за счет снижения его стадийности и перечня оборудования и реактивов.

Ограничительный фактор – низкая чувствительность спектроскопии КР. Так, минимальная концентрация бактериальных клеток, при которой вырабатывается достаточное для измерения количество формазана, составляет 1 × 107 КОЕ/мл. Такого количества вполне достаточно для измерения подготовленных препаратов клеток (например, ночных культур), но не для клинических образцов. Так, в образцах мочи клинически значимая концентрация бактерий составляет в среднем 104–105 КОЕ/мл [43], а при инфекциях крови – 1–100 клеток/мл [44]. Таким образом, для определения антибиотикорезистентности бактерий в таких образцах необходимо либо вводить стадию культивирования, что усложняет анализ и увеличивает его длительность, либо повышать чувствительность детекции формазана.

Для повышения чувствительности КР-анализа применяют ГКР, или SERS (Surface-Enhanced Raman spectroscopy) [45]. Спектроскопия ГКР основана на эффекте поверхностного плазмонного резонанса, возникающем на шероховатых металлических структурах, в качестве которых часто используются наночастицы серебра или золота. Эффект ГКР проявляется на небольшом расстоянии от поверхности [46], однако обладает очень большим (до 1014) фактором усиления, позволяя детектировать в отдельных случаях единичные молекулы [47]. В работах Z. Mao с соавт. [41, 42] описана методика определения формазана, образуемого в эукариотическом МТТ-тесте, с использованием в качестве субстрата ГКР наночастиц золота, синтезированных из тетрахлорауроновой кислоты и цитрата натрия. Эти наночастицы эффективно усиливали сигнал формазана при облучении красным светом, то есть при анализе его спектра также регистрировали эффект резонансного КР, дополнительно увеличивающий чувствительность детектора.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты. Тетразолиевый краситель МТТ (“ДИА-М”, Россия) разводили до концентрации 4 мг/мл в воде и хранили при₂ 4°C. Состав PBS (pH 7.2): 0.8% NaCl, 0.02% KH₂PO₄, 0.02% KCl, 0.12% Na₂HPO₄ ∙ H₂O.

Стерильную жидкую форму среды LB (“Condalab”, Италия) готовили по протоколу, рекомендованному производителем: 4 г сухой смеси LB растворяли в 200 мл воды и автоклавировали 15 мин при 121°C.

Инструменты, параметры измерения. Для получения спектров КР и ГКР использовали спектрометр Фотон-Био RL638 (“Фотон-Био”, Россия) с длиной волны лазера 638 нм и мощностью излучения 100 мВт. Параметры измерения: экспозиция 1 000 мс, 10 повторов, мощность лазера (ШИМ) 70%. Измерения проводили в кюветах с рабочим объемом 500 мкл. Спектры обрабатывали скриптом на Python3 алгоритмами Уиттакера [48] и асимметричного взвешенного сглаживания по методу наименьших квадратов [49].

Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре ЭКРОС 5400УФ (“Экрос”, Россия).

Получение наночастиц золота. Наночастицы золота получали по методике G. Frens [50]. К 30 мл воды добавляли 347.6 мкл 25.4 мМ HAuCl4, нагревали до кипения, вносили 126 мкл 1%-ного водного раствора цитрата натрия и кипятили смесь еще 40 мин. Получали раствор бордового цвета (рН 6.0), содержащий наночастицы золота диаметром 45–50 нм (оптимальный размер для ГКР-спектроскопии [51]). Спектр поглощения раствора наночастиц после синтеза представлен на рис. S1 (см. Дополнительные материалы в электронном виде по DOI статьи и на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2024/6/supp_Mushenkov_rus.pdf).

МТТ-тест и пробоподготовка формазана для ГКР-анализа. Ночную культуру клеток Escherichia coli, штамм d1 (1 мл), обрабатывали 200 мкл раствора МТТ и инкубировали 1 ч при 37°C, после чего клеточную суспензию центрифугировали при 12 400 g в течение 1 мин. К осадку добавляли 2 мл изопропилового спирта, тщательно перемешивали и центрифугировали в тех же условиях. Супернатант отбирали и разбавляли в два раза изопропанолом. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 570 нм и доводили до 4 о. е. (соответствует концентрации формазана 0.13 г/л) [52].

Подготовка культуры клеток для ГКР-анализа. Ночные культуры бактерий Е. coli JW5503ΔtolC [53] растили в течении 8 ч в инкубаторе при 37°C, после чего разбавлялись средой LB до конечной концентрации 6 × 108 КОЕ/мл (OD600 = 0.451) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C.

Определения антибиотикорезистентности бактериальных штаммов и минимальных ингибирующих концентраций (МИК). Этот протокол включал несколько этапов.

  1. Исследуемые штаммы бактерий (концентрация 2 по МакФарланду) разбавляли свежей средой LB и инкубировали при 37°C в течение 1 ч.
  2. Пятьдесят микролитров клеточной суспензии вносили в кювету с фосфатным буфером (PBS), содержащим антибиотик (конечный объем реакционной смеси – 400 мкл), и инкубировали при 37°C в течение 1 ч. Использовали увеличивающиеся концентрации антибиотика и отрицательный контроль (PBS без антибиотика).
  3. После инкубации добавляли 100 мкл МТТ (4 мкг/мл), инкубировали 20 мин и измеряли интенсивность пика 967 см‒1 (формазан) на КР-спектрометре. Интенсивность этого пика для контрольного образца (без антибиотика) принимали за 100%; значения, полученные для опытных образцов, нормировали по контролю. Концентрация антибиотика, при которой интенсивность сигнала формазана резко снижалась (до 40‒60% от контроля), принимали за минимальную концентрацию ингибирования (МИК) данного антибиотика. Подробное описание метода приведено в патентной заявке № 2023129249 от 13.11.2023.

КР- и ГКР-анализ спектра формазана в культуре клеток. Для получения спектров КР использовали вышеприведенную методику. К 50 мкл культуры бактериальных клеток добавляли 350 мкл PBS, 100 мкл раствора МТТ и инкубировали в течение 20 мин. Смесь переносили в кювету и регистрировали КР-спектр.

Для анализа спектра ГКР отбирали 200 мкл клеточной суспензии, добавляли 100 мкл изопропилового спирта и перемешивали, после чего вносили 300 мкл суспензии наночастиц золота, инкубировали 5 мин при комнатной температуре и регистрировали ГКР-спектр.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимизация условий ГКР-спектроскопии для регистрации формазана

Для определения оптимальных условий регистрации ГКР-спектра формазана варьировали концентрацию наночастиц и время инкубации и выбирали такие, при которых усиление сигнала было максимальным.

Различные объемы (от 0 до 400 мкл) наночастиц золота вносили в раствор формазана (5 мкл с концентрацией 0.13 г/л) в рассчитанном объеме PBS – таком, чтобы конечный объем смеси составлял 500 мкл. После 3 мин инкубации регистрировали спектр ГКР и оценивали интенсивность полос 722 и 967 см‒1. Максимальное усиление сигнала детектировали для образца, содержащего 300 мкл наночастиц, при дальнейшем увеличении их концентрации интенсивность сигнала снижалась (рис. 2).

 

Рис. 2. Подбор концентрации наночастиц золота для усиления сигнала формазана в ГКР-спектре.

 

В связи с тем, что интенсивность ГКР-спектра зависела и от времени инкубации формазана с наночастицами золота, мы проанализировали и этот параметр. Для этого подготовили ряд образцов, добавляя к 5 мкл раствора формазана (0.13 г/л) в 195 мкл фосфатного буфера 300 мкл наночастиц. Образцы инкубировали в течение различных промежутков времени, отбирая аликвоты с шагом в 1 мин, и регистрировали спектры ГКР. Как видно на рис. 3, интенсивность сигнала быстрее всего нарастала в течение первых 3 мин, в интервале 3–7 мин скорость роста постепенно замедлялась, а при длительной инкубации, 20–30 мин, снижалась из-за агрегации наночастиц (результаты не представлены). Для дальнейших экспериментов по анализу жизнеспособности бактериальных клеток был выбран 5-минутный период инкубации исследуемых образцов с наночастицами.

 

Рис. 3. Подбор времени инкубации формазана с наночастицами золота для усиления сигнала в ГКР-спектре.

 

Оптимальное разрешение полос получено в следующих условиях пробоподготовки: 5 мкл (0.13 г/л) раствора формазана в 195 мкл PBS в присутствии 300 мкл суспензии наночастиц, время инкубация – 5 мин. Полученный спектр имел интенсивные характеристические полосы формазана, отмеченные на рис. 4.

 

Рис. 4. ГКР-спектр формазана (концентрация 1.25 мкг/мл). Характеристические пики формазана подписаны; длина волны возбуждающего излучения ‒ 638 нм.

 

Сравнение чувствительности спектроскопии ГКР и КР для формазана

Эффект ГКР был оценен прямым сравнением интенсивности спектра формазана в присутствии золотых наночастиц и без них. Для этого к различным объемам формазана добавляли PBS до объема 200 мкл, затем 300 мкл наночастиц (в случае ГКР) или 300 мкл PBS (в случае КР). Спектры были сняты после инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре. На рис. 5 приведено сравнение интенсивностей полосы 967 см‒1.

 

Рис. 5. Сравнительный анализ ГКР- и КР-спектров формазана.

 

Для ГКР-спектра наиболее выраженное, приблизительно 50-кратное, усиление сигнала регистрировали в области низких концентраций формазана (до 2 мкг/мл); при повышении концентрации интенсивность усиления снижалась, но оставалась на уровне, значимо превышающем сигнал КР-спектра. В случае ГКР предел обнаружения формазана составил 0.1 мкг/мл, в то время как для спектроскопии без усиления – 7 мкг/мл, то есть в 70 раз больше (табл. 1).

 

Таблица 1. Сравнение интенсивности пика формазана при 967 см‒1 в спектрах КР и ГКР

Метод

[Формазан], мкг/мл при интенсивности сигнала, импульс/мин

500

1 000

2 000

4 000

КР

11.00

14.50

17.50

21.00

ГКР

0.17

0.25

0.38

1.20

Усиление (КР/ГКР)

65

58

46

17

 

Измерение ГКР-спектра бактерий

В отличие от раствора формазана, при добавлении наночастиц к образцам бактерий, обработанных МТТ, усиления сигнала за счет ГКР практически не было. Дело в том, что эффективность ГКР быстро падает с увеличением расстояния от рассеивающей свет молекулы до поверхности наночастицы [54]. Добавляемый в ходе МТТ-теста тетразол восстанавливается внутри клеток и образующийся формазан накапливается внутри них (наружу формазан выходит лишь при высокой концентрации – когда формируемые им игольчатые кристаллы разрушают клетки) [55], поэтому наночастицы, находящиеся вне клеток, не могут оказаться достаточно близко к формазану для формирования ГКР-сигнала. Следовательно, для измерения спектра ГКР формазана в бактериях их необходимо предварительно лизировать – чтобы формазан вышел наружу и смог контактировать с поверхностью наночастиц. Ранее для эукариотических клеток было предложено использовать классическую методику проведения МТТ-теста, но без стадии выделения формазана. Так, к образцам после инкубации с МТТ добавляли ДМСО и непосредственно после добавления наночастиц проводили измерения [41].

Нами предложена модификация методики МТТ-теста с целью получения ГКР-спектра формазана в прокариотических клетках. Для лизиса клеток E. coli был выбран изопропиловый спирт и подобран его оптимальный объем, соответствующий максимальному усилению интенсивности сигнала формазана. Изопропиловый спирт эффективно высвобождал формазан из клеток E. coli, при этом не влиял на свойства наночастиц и не искажал спектр формазана (рис. S1—S4, табл. S1; см. электронное приложение). Результаты сравнения спектров формазана, полученных ГКР- и КР-спектроскопией, приведены на рис. 6.

 

Рис. 6. Сравнение чувствительности ГКР- и КР-спектроскопии для определения концентрации формазана, образовавшегося из МТТ в жизнеспособных клетках E. coli.

 

В результате проведенного анализа выявлено, что пороговое значение концентрации клеток E. coli в МТТ-тесте составило 3 × 105 КОЕ/мл в случае ГКР-спектроскопии и 1 × 107 КОЕ/мл для КР. Таким образом, благодаря применению наночастиц золота нам удалось снизить минимальную концентрацию анализируемых клеток в 30 раз. Интенсивность сигнала формазана в ГКР-спектре достигла максимума при концентрации бактериальных клеток 3 × 107 КОЕ/мл и резко снижалась при дальнейшем увеличении концентрации клеток, что сопровождалось агрегацией наночастиц и обесцвечиванием раствора.

Таким образом, нами была рассмотрена возможность повышения чувствительности определения формазана, образующегося в МТТ-тесте, при помощи ГКР-активных наночастиц золота. По сравнению с КР-спектроскопией ГКР на наночастицах золота имеет существенно более низкий предел обнаружения формазана и позволяет снизить минимальную концентрацию клеток E. coli до 3 × 105 КОЕ/мл в МТТ-тесте. Это значит, что теперь МТТ-тест можно использовать для анализа жизнеспособности образцов с низким содержанием бактериальных клеток – без предварительного их накопления культивированием.

Дальнейшее повышение чувствительности определения формазана – продукта жизнедеятельности клеток в МТТ-тесте – возможно за счет модификации поверхности наночастиц или изменения их формы/размера. Применение ГКР-спектроскопии для детекции результатов МТТ-теста при анализе антибиотикорезистентности бактерий позволит быстро и точно определять этот параметр и оперативно разрабатывать персонализированную схему лечения инфекционных заболеваний.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (№ 24-65-00015, https://rscf.ru/project/24-65-00015/).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием людей или животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

Об авторах

В. А. Мушенков

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: vladimir.mushenkov@mail.ru
Россия, Москва, 119991

Д. А. Лукьянов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Сколковский институт науки и технологий

Email: vladimir.mushenkov@mail.ru
Россия, Москва, 119991; Москва, 121205

Н. Ф. Мещерякова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vladimir.mushenkov@mail.ru
Россия, Москва, 119991

В. И. Кукушкин

Институт физики твердого тела им. Ю.А. Осипьяна Российской академии наук

Email: vladimir.mushenkov@mail.ru
Россия, Московская область, Черноголовка, 142432

Е. Г. Завьялова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vladimir.mushenkov@mail.ru
Россия, Москва, 119991

Список литературы

  1. Walsh T.R., Gales A.C., Laxminarayan R., Dodd P.C. (2023) Antimicrobial resistance: addressing a global threat to humanity. PLoS Med. 20(7), e1004264.
  2. Ranjbar R., Alam M. (2024) Antimicrobial Resistance Collaborators (2022). (2023) Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Evid. Based Nurs. 2023, ebnurs-2022–103540. https://doi.org/ 10.1136/ebnurs-2022-103540
  3. O’Neill J. (2016) Tackling Drug-Resistant Infections Globally: Final Report and Recommendations. https://apo.org.au/node/63983
  4. Klein E.Y., Van Boeckel T.P., Martinez E.M., Pant S., Gandra S., Levin S.A., Goossens H., Laxminarayan R. (2018) Global increase and geographic convergence in antibiotic consumption between 2000 and 2015. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 115(15), E3463–E3470.
  5. Durand G.A., Raoult D., Dubourg G. (2019) Antibiotic discovery: history, methods and perspectives. Int. J. Antimicrob. Agents. 53(4), 371–382.
  6. de Kraker M.E.A., Lipsitch M. (2021) Burden of antimicrobial resistance: compared to what? Epidemiol. Rev. 43(1), 53–64.
  7. Hanberger H., Walther S., Leone M., Barie P.S., Rello J., Lipman J., Marshall J.C., Anzueto A., Sakr Y., Pickkers P. (2011) Increased mortality associated with meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in the Intensive Care Unit: results from the EPIC II study. Int. J. Antimicrob. Agents. 38(4), 331–335.
  8. Yang C.C., Sy C.L., Huang Y.C., Shie S.S., Shu J.C., Hsieh P.H., Hsiao C.H., Chen C.J. (2018) Risk factors of treatment failure and 30-day mortality in patients with bacteremia due to MRSA with reduced vancomycin susceptibility. Sci. Rep. 8(1), 7868.
  9. Dellinger R.P., Levy M.M., Carlet J.M., Bion J., Parker M.M., Jaeschke R., Reinhart K., Angus D.C., Brun-Buisson C., Beale R. (2008) Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008. Crit. Care Med. 36(1), 296–327.
  10. Chen H.C., Lin W.L., Lin C.C., Hsieh W.H., Hsieh C.H., Wu M.H., Wu J.Y., Lee C.C. (2013) Outcome of inadequate empirical antibiotic therapy in emergency department patients with community-onset bloodstream infections J. Antimicrob. Chemother. 68(4), 947–953.
  11. Dickinson J.D., Kollef M.H. (2011) Early and adequate antibiotic therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. Curr. Infect. Dis. Rep. 13, 399–405.
  12. Goneau L.W., Delport J., Langlois L., Poutanen S.M., Razvi H., Reid G., Burton J.P. (2020) Issues beyond resistance: inadequate antibiotic therapy and bacterial hypervirulence. FEMS Microbes. 1(1), xtaa004.
  13. Reller L.B., Weinstein M., Jorgensen J.H., Ferraro M.J. (2009) Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clin. Infect. Dis. 49(11), 1749–1755.
  14. Khan Z.A., Siddiqui M.F., Park S. (2019) Current and emerging methods of antibiotic susceptibility testing. Diagnostics (Basel). 9(2), 49.
  15. Steingart K.R., Schiller I., Horne D.J., Pai M., Boehme C.C., Dendukuri N. (2014) Xpert® MTB/RIF assay for pulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults. Cochrane Database Syst. Rev. 2014(1), CD009593.
  16. Kumar P., Nagarajan A., Uchil P.D. (2018) Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harb. Protoc. 2018(6), pdb-prot095505.
  17. Van Meerloo J., Kaspers G.J.L., Cloos J. (2011) Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol. Biol. 2011, 237–245.
  18. Bahuguna A., Khan I., Bajpai V.K., Kang S.C. (2017) MTT assay to evaluate the cytotoxic potential of a drug. Bangl. J. Pharm. 12(2), 115–118.
  19. Tolosa L., Donato M. T., Gómez-Lechón M. J. (2015) General cytotoxicity assessment by means of the MTT assay. Methods Mol. Biol. 2015, 333–348.
  20. Weichert H., Blechschmidt I., Schröder S., Ambrosius H. (1991) The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL). Allerg. Immunol. (Leipz). 37(3–4), 139–144.
  21. Molaae N., Mosayebi G., Pishdadian A., Ejtehadifar M., Ganji A. (2017) Evaluating the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells using MTT assay. Int. J. Basic Sci. Med. 2(1), 25–28.
  22. Cole S.P.C. (1986) Rapid chemosensitivity testing of human lung tumor cells using the MTT assay. Cancer Chemother. Pharmacol. 17(3), 259–263.
  23. Campling B.G., Pym J., Baker H.M., Cole S.P.C., Lam Y.M. (1991) Chemosensitivity testing of small cell lung cancer using the MTT assay. Br. J. Cancer. 63(1), 75–83.
  24. Grela E., Kozłowska J., Grabowiecka A. (2018) Current methodology of MTT assay in bacteria — a review. Acta Histochem. 120(4), 303–311.
  25. Montoro E., Lemus D., Echemendia M., Martin A., Portaels F., Palomino J.C. (2005) Comparative evaluation of the nitrate reduction assay, the MTT test, and the resazurin microtitre assay for drug susceptibility testing of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. J. Antimicrob. Chemother. 55(4), 500–505.
  26. Mshana R.N., Tadesse G., Abate G., Miörner H. (1998) Use of 3–(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide for rapid detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 36(5), 1214–1219.
  27. Moodley S., Koorbanally N.A., Moodley T., Ramjugernath D., Pillay M. (2014) The 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, -5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay is a rapid, cheap, screening test for the in vitro anti-tuberculous activity of chalcones. J. Microbiol. Methods. 104, 72–78.
  28. Shi L., Ge H.M., Tan S.H., Li H.Q., Song Y.C., Zhu H.L., Tan R.X. (2007) Synthesis and antimicrobial activities of Schiff bases derived from 5-chloro-salicylaldehyde. Eur. J. Med. Chem. 42(4), 558–564.
  29. Brambilla E., Ionescu A., Cazzaniga G., Edefonti V., Gagliani M. (2014) The influence of antibacterial toothpastes on in vitro Streptococcus mutans biofilm formation: a continuous culture study. Am. J. Dent. 27(3), 160–166.
  30. Stevens M.G., Olsen S.C. (1993) Comparative analysis of using MTT and XTT in colorimetric assays for quantitating bovine neutrophil bactericidal activity. J. Immunol. Methods. 157(1–2), 225–231.
  31. Stevens M.G., Kehrli Jr M.E., Canning P.C. (1991) A colorimetric assay for quantitating bovine neutrophil bactericidal activity. Vet. Immunol. Immunopathol. 28(1), 45–56.
  32. Kudelski A. (2008) Analytical applications of Raman spectroscopy. Talanta. 76(1), 1–8.
  33. Kuhar N., Sil S., Umapathy S. (2021) Potential of Raman spectroscopic techniques to study proteins. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 258, 119712.
  34. Martinez M.G., Bullock A.J., MacNeil S., Rehman I.U. (2019) Characterisation of structural changes in collagen with Raman spectroscopy. Appl. Spectrosc. Rev. 54(6), 509–542.
  35. Beljebbar A., Bouché O., Diébold M.D., Guillou P.J., Palot J.P., Eudes D., Manfait M. (2009) Identification of Raman spectroscopic markers for the characterization of normal and adenocarcinomatous colonic tissues. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 72(3), 255–264.
  36. Depciuch J., Kaznowska E., Zawlik I., Wojnarowska R., Cholewa M., Heraud P., Cebulski J. (2016) Application of Raman spectroscopy and infrared spectroscopy in the identification of breast cancer. Appl. Spectrosc. 70(2), 251–263.
  37. Chan J.W., Taylor D.S., Lane S.M., Zwerdling T., Tuscano J., Huser T. (2008) Nondestructive identification of individual leukemia cells by laser trapping Raman spectroscopy. Anal. Chem. 80(6), 2180–2187.
  38. Pahlow S., Meisel S., Cialla-May D., Weber K., Rösch P., Popp J. (2015) Isolation and identification of bacteria by means of Raman spectroscopy. Adv. Drug. Deliv. Rev. 89, 105–120.
  39. Stöckel S., Kirchhoff J., Neugebauer U., Rösch P., Popp J. (2016) The application of Raman spectroscopy for the detection and identification of microorganisms. J. Raman. Spectrosc. 47(1), 89–109.
  40. Riss T. (2017) Is your MTT assay really the best choice? Promega Corporation website http://www.promega.in/resources/pubhub/is-your-mtt-assay-really-the-best-choice/
  41. Mao Z., Liu Z., Chen L., Yang J., Zhao B., Jung Y.M., Wang X., Zhao C. (2013) Predictive value of the surface-enhanced resonance Raman scattering-based MTT assay: a rapid and ultrasensitive method for cell viability in situ. Anal. Chem. 85(15), 7361–7368.
  42. Mao Z., Liu Z., Yang J., Han X., Zhao B., Zhao C. (2018). In situ semi-quantitative assessment of single-cell viability by resonance Raman spectroscopy. Chem. Commun. (Camb.). 54(52), 7135–7138.
  43. Wilson M.L., Gaido L. (2004) Laboratory diagnosis of urinary tract infections in adult patients. Clin. Infect. Dis. 38(8), 1150–1158.
  44. Lamy B., Dargère S., Arendrup M.C., Parienti J.J., Tattevin P. (2016) How to optimize the use of blood cultures for the diagnosis of bloodstream infections? A state-of-the art. Front. Microbiol. 7, 191111.
  45. Stiles P.L., Dieringer J.A., Shah N.C., Van Duyne R.P. (2008) Surface-enhanced Raman spectroscopy. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 601–626.
  46. Bell S.E.J., Charron G., Cortés E., Kneipp J., de la Chapelle M.L., Langer J., Procházka M., Tran V., Schlücker S. (2020) Towards reliable and quantitative surface‐enhanced Raman scattering (SERS): from key parameters to good analytical practice. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 59(14), 5454–5462.
  47. Lin C., Li Y., Peng Y., Zhao S., Xu M., Zhang L., Huang Z., Shi J., Yang Y. (2023) Recent development of surface-enhanced Raman scattering for biosensing. J. Nanobiotechnology. 21(1), 149.
  48. Eilers P.H.C. (2003) A perfect smoother. Anal. Chem. 75(14), 3631–3636.
  49. Baek S.J., Park A., Ahn Y.J., Choo J. (2015) Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140(1), 250–257.
  50. Frens G. (1973) Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Nat. Phys. Sci. 241(105), 20–22.
  51. Hong S., Li X. (2013) Optimal size of gold nanoparticles for surface‐enhanced Raman spectroscopy under different conditions. J. Nanomater. 2013(1), 790323.
  52. Gerlier D., Thomasset N. (1986) Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. J. Immunol. Methods. 94(1–2), 57–63.
  53. Baba T., Ara T., Hasegawa M., Takai Y., Okumura Y., Baba M., Datsenko K.A., Tomita M., Wanner B.L., Mori H. (2006) Construction of Escherichia coli K‐12 in‐frame, single‐gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2(1), 2006–2008.
  54. Kumari G., Kandula J., Narayana C. (2015) How far can we probe by SERS? J. Phys. Chem. C. 119(34), 20057–20064.
  55. Xu W., Shi D., Chen K., Palmer J., Popovich D.G. (2023) An improved MTT colorimetric method for rapid viable bacteria counting. J. Microbiol. Methods. 214, 106830.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Приложение
Скачать (522KB)
Метаданные
3. Рис. 1. Реакция восстановления МТТ.

Скачать (137KB)
Метаданные
4. Рис. 2. Подбор концентрации наночастиц золота для усиления сигнала формазана в ГКР-спектре.

Скачать (215KB)
Метаданные
5. Рис. 3. Подбор времени инкубации формазана с наночастицами золота для усиления сигнала в ГКР-спектре.

Скачать (207KB)
Метаданные
6. Рис. 4. ГКР-спектр формазана (концентрация 1.25 мкг/мл). Характеристические пики формазана подписаны; длина волны возбуждающего излучения ‒ 638 нм.

Скачать (160KB)
Метаданные
7. Рис. 5. Сравнительный анализ ГКР- и КР-спектров формазана.

Скачать (190KB)
Метаданные
8. Рис. 6. Сравнение чувствительности ГКР- и КР-спектроскопии для определения концентрации формазана, образовавшегося из МТТ в жизнеспособных клетках E. coli.

Скачать (193KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».