Toxicity Study of Pharmacological Pair Encapsulated Citrobacter freundii C115H Methionine γ-Lyase / Methiin

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность создания новых противомикробных средств обусловлена разнообразием биологических форм возбудителей, постоянным появлением штаммов, резистентных к уже известным антибиотикам, а также обнаружением новых видов опасных патогенов. Ранее нами было разработано оригинальное противомикробное средство – фармакологическая пара, обеспечивающая образование действующего вещества-антибиотика in situ, на основе применения оптимизированного ферментного препарата и проантибиотика [1]. Показано, что мутантная форма C115H метионин-γ-лиазы (МГЛ) из Citrobacter freundii способна эффективно катализировать расщепление сульфоксидов (±)S-алк(ен)ил-L-цистеина с образованием тиосульфинатов, ингибирующих рост широкого спектра микроорганизмов [2–8], включая мультирезистентные штаммы [9]. С целью практического применения предложено создать пролекарство на основе инкапсулирования фермента в полиионные везикулы (PIC-сомы), которые значительно увеличивают его стабильность в плазме крови лабораторных животных [10, 11]. В организме такой инкапсулированный фермент в течение длительного времени способен образовывать из фармакологически инертных сульфоксидов активные противомикробные агенты. Антибактериальное действие фармакологической пары инкапсулированная C. freundii C115H МГЛ/метиин, вырабатывающей наиболее перспективное в отношении Pseudomonas aeruginosa вещество, диметилтиосульфинат (рис. 1) [9], проверено на модели острой генерализованной инфекции в испытаниях in vivo, где показало высокую эффективность [12]. При этом как сама фармакологическая пара, так и ее отдельные компоненты оказывали низкое токсическое воздействие (или не оказывали вовсе) на способность ранних эмбрионов мышей проходить все стадии доимплантационного развития в условиях in vitro [13]. Тем не менее, прежде чем использовать полученные препараты в медицинской практике, необходимо оценить их безопасность на лабораторных животных [14].

 

Рис. 1. Принцип действия фармакологической пары инкапсулированная МГЛ/метиин.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. Пиридоксаль-5’-фосфат (ПЛФ), лактатдегидрогеназа из мышцы кролика, NADH (“Sigma”, США); тиогликолевая среда, триптозосоевый бульон (“Merсk”, США); D,L-дитиотреитол, EDТА, протамина сульфат (“Serva”, США); лактоза (“Panreac”, Испания); глюкоза, глицерин, сульфат магния, сульфат аммония, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный (“Реахим”, Россия); канамицин (“Панэко”, Россия); дрожжевой экстракт, триптон (“Difco”, США); DEAE-сефароза (“GE Healthcare”, Швеция); АХД-2000 (“Lysoform”, Германия); набор для количественного анализа хромогенных эндотоксинов Limulus Amebocyte Lysate (LAL-reagent) (“Thermo Fisher Scientific”, США); Endotoxin Extractor (“Sileks”, Россия). Метиин синтезировали согласно [1]; 2-нитро-5-тиобензойную кислоту получали согласно [15]; полиэтиленгликоль-поли (L-аспарагиновую кислоту)₇₀ (ПЭГ^–P(Asp)₇₀) и поли (L-лизин)₇₀ (PLL₇₀) ^– согласно [16].

Выделение и очистка C. freundii C115H МГЛ. Рекомбинантную C. freundii C115H МГЛ выделяли и очищали согласно [1]. Гомогенность препарата подтверждали методом ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях по методу Лэммли [17]. Концентрацию фермента определяли, используя коэффициент молярного поглощения А_1%²⁷⁸ = 0.8 [18]. Эндотоксины удаляли согласно [12]. Содержание эндотоксинов в полученном препарате, определенное при помощи LAL-теста, составило 0.065 ЕЭ/мг.

Инкапсулирование C. freundii C115H МГЛ в полимерные везикулы. Инкапсулирование фермента проводили в 50 мМ калий-фосфатном буфере (КФБ) рН 7.5 при температуре 37°C. Растворы 1 мг/мл ПЭГ^–P(Asp)₇₀ и PLL₇₀ (1 мг/мл) пропускали через мембранный фильтр 0.22 мкм, смешивали в эквивалентном соотношении звеньев полимеров -COO- и -NH₃⁺ и интенсивно перемешивали на вибрационном смесителе типа Vortex при скорости 2000 об/мин в течение 2 мин, затем добавляли раствор фермента С115Н МГЛ (6 мг/мл в 10 мМ КФБ рН 7.5, 0.1 мМ ПЛФ) и перемешивали при той же скорости в течение еще 2 мин. Полученные полимерные везикулы, содержащие C115H МГЛ (C115H МГЛ-PIC-сом), очищали от неинкапсулированного фермента центрифугированием при 12000 об/мин. Затем промывали 4 раза буферным раствором (10 мМ КФБ рН 7.5, 0.1 мМ ПЛФ) до полного исчезновения пика 420 нм в супернатанте. Формирование нанокапсул подтверждено с помощью сканирующей электронной [16] и ядерно-силовой микроскопии [13]. Размер нанокапсул оценивали методом динамического рассеяния света с помощью ZetaPALS (“Brookhaven Instruments Corp.”, США) при 25°C. Средний гидродинамический диаметр составил 52 ± 0.33 нм, z-потенциал ^– 3.45 ± 0.36 мВ. Для определения степени включения С115Н МГЛ в PIC-сомы фермент модифицировали родамином. Образцы анализировали при помощи флуориметра (“Varian”) при длине волны возбуждения 552 нм и длине волны эмиссии 575 нм. Степень включения фермента составила 10%.

Определение активности фермента. Активность МГЛ определяли в реакции β-элиминирования, измеряя скорость образования пирувата в сопряженной реакции с лактатдегидрогеназой по снижению поглощения NADH при 340 нм (ε = 6220 M^–1cм^–1) и 37°C. Реакционная смесь содержала рабочий буфер, 0.2 мМ NADH, 10 Ед лактатдегидрогеназы и 30 мМ S-метил-L-цистеин. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ/мин пирувата.

Лабораторные животные. В работе использовали самок аутбредных мышей ICR возрастом 8–10 недель, содержавшихся в контролируемых условиях (температура, влажность, освещение) в НПП “Питомник лабораторных животных” ФИБХ РАН (УНУ “Био-модель” ИБХ РАН; Биоресурсная коллекция “Коллекция лабораторных грызунов SPF статуса для фундаментальных, биомедицинских и фармакологических исследований” ИБХ РАН, № 075-15-2021-1067) в клетках изоляторного типа IsoCage (“Techniplast”, Италия) социальными группами по три‒пять особей. Исследование токсичности проводили в соответствии с руководящими принципами токсикологических исследований Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) для тестирования химикатов [19]. В опытах использовали самок мышей, поскольку самки более чувствительны к токсическим воздействиям, чем самцы [20].

Манипуляции с животными (инъекции препаратов, взвешивание, клинический осмотр, забор биоматериала и пр.) проводили в асептических условиях с использованием биозащищенного бокса с ламинарным потоком воздуха (2-й класс биозащиты). Эвтаназию животных выполняли в соответствии с международными требованиями [21] с помощью автоматизированного СО₂-бокса “Bioscape”. Все эксперименты и манипуляции одобрены институтской комиссией по уходу за лабораторными животными и их использованию (IACUC № 709/19 от 01.07.2019).

Контроль стерильности препаратов. Стерильность вводимых животным препаратов проверяли с использованием тест-систем: тиогликолевой среды и триптозосоевого бульона. Смывы со всех пробирок, в которых содержались препараты, переносили во флакон с триптозосоевым бульоном и во флакон с тиогликолевой средой (по 1 мл в каждый). Флаконы инкубировали при 37°C в течение 48 ч, после чего проводили визуальный анализ изменения окраски сред и степени их мутности.

Острая и субхроническая токсичность. Подопытных животных распределяли в случайном порядке на пять групп. Группы исследования острой токсичности (группы 1–3, по шесть мышей в каждой) получали однократно дозу препаратов в первый день эксперимента. Животным группы 1 вводили инкапсулированную C115H МГЛ (1.5 Ед/мышь) и метиин 2 мг/мышь (×1 терапевтическая доза [12]), мышам группы 2 вводили по 1.5 Ед инкапсулированной C115H МГЛ и 10 мг метиина (×5 терапевтическая доза), группе 3 вводили инкапсулированную C115H МГЛ 1.5 Ед/мышь и метиин 20 мг/мышь (×10 терапевтическая доза). Спустя 7 дней животных подвергали эвтаназии, выделяли почки и печень, проводили гистологическое исследование. Животным группы оценки субхронической токсичности (группа 4; восемь мышей) инкапсулированную C115H МГЛ 1.5 Ед/мышь и метиин 2 мг/мышь вводили ежедневно с 1 по 7 день исследования. Через 7 дней после отмены препаратов животных подвергали эвтаназии, выделяли почки и печень и проводили гистологическое исследование. Контрольная группа животных (группа 5) получала 0.9%-ный раствор NaCl. Две мыши контрольной группы получали препарат согласно протоколу для групп исследования острой токсичности, три ^– согласно протоколу для группы субхронической токсичности.

Препараты вводили через хвостовую вену одноразовым шприцем с диаметром иглы 29G– сначала 100 мкл инкапсулированной C115H МГЛ в буферном растворе (50 мМ КФБ, 0.1 мМ ПЛФ pH 7.5), затем 100 мкл метиина в физиологическом растворе. Промежуток времени между инъекциями фермента и метиина не превышал 15 мин. Перед введением препаратов область инъекции обрабатывали кожным антисептиком АХД-2000. На протяжении всего эксперимента проводили ежедневный клинический осмотр животных. Взвешивание выполняли на 1, 7 и 14 сутки эксперимента.

Гистологические исследования. Образцы биоматериала (печень и почки) фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, далее промывали в проточной воде, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4–5 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином, изучали с помощью световой микроскопии на микроскопе AxioScope.A1 (“Carl Zeiss”, Германия). Микрофотографии гистологических препаратов получали с помощью камеры высокого разрешения Axiocam 305 color (“Carl Zeiss”). Cтепень выраженности морфологических отклонений оценивали с использованием следующей шкалы [22]: несущественное повреждение или отклонение от нормы (MI) – 1 балл, слабовыраженное повреждение или отклонение от нормы (SL) – 2 балла, умеренное повреждение или отклонение от нормы (MO) – 3 балла, выраженное повреждение или отклонение от нормы (MA) – 4 балла, резко выраженное повреждение или отклонение от нормы (SE) – 5 баллов (табл. S1, S2, см. Дополнительные материалы в электронном виде по DOI статьи и на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2024/6/supp_Revtovich_rus.pdf).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Терапия пролекарствами обычно имеет ряд преимуществ перед традиционными препаратами благодаря более плавному повышению концентрации активных действующих веществ и их пролонгированному действию, что, в свою очередь, позволяет снизить частоту приема препарата и уменьшить токсическую нагрузку. Одним из кандидатов в противомикробные препараты, действующих на широкий спектр патогенов, является двухкомпонентная система, состоящая из инкапсулированной C. freundii C115H МГЛ и пролекарства-метиина. Замена Cys115 на гистидин в активном центре фермента повышает его каталитическую активность в реакции β-элиминирования S-замещенных сульфоксидов L-цистеина на порядок по сравнению с МГЛ дикого типа. В ходе ферментативной реакции МГЛ с метиином образуется наиболее стабильный из природных тиосульфинатов диметилтиосульфинат [1, 6], основной противомикробный компонент растений рода Brassica [23]. Доклинические исследования токсичности на лабораторных мышах при однократной и многократной инфузии фармакологической пары с оценкой патофизиологических изменений позволяют оценить безопасность терапии фармакологической парой на основе инкапсулированной C. freundii C115H МГЛ/метиина.

Ежедневные осмотры показали, что поведение, внешний вид и изменение веса подопытных мышей в группах исследования острой токсичности не отличались от показателей у мышей контрольной группы и соответствовали здоровым животным. Животные группы субхронической токсичности на момент окончания эксперимента потеряли около 14% начальной массы (табл. 1), не имели явных признаков интоксикации, однако были менее активными, а их шерстный покров был более взъерошенным по сравнению с контрольной группой. Определение массы почек и печени не выявило существенных различий в весе внутренних органов у животных всех групп (табл. 1).

 

Таблица 1. Изменение веса тела, массы почек и печени подопытных животных

Препарат (доза)	Физраствор	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 2 мг метиина (×1)	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 10 мг метиина (×5)	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 20 мг метиина (×10)	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 2 мг метиина (×1)
Число животных	5	6	6	6	8
Изменение массы тела, г
1 день	32.40 ± 1.28	31.17 ± 1.22	32.67 ± 1.44	33.17 ± 0.89	32.63 ± 1.03
7 день	31.40 ± 1.52	30.67 ± 1.67	33.00 ± 2.00	30.00 ± 1.33	29.38 ± 1.72
14 день	30.33 ± 0.89*	–	–	–	28.13 ± 1.41
Масса внутренних органов, г
Печень	1.51 ± 0.17	1.53 ± 0.12	1.59 ± 0.18	1.35 ± 0.06	1.53 ± 0.17
Почки	0.37 ± 0.02	0.41 ± 0.03	0.43 ± 0.05	0.39 ± 0.01	0.41 ± 0.03

*Число мышей в группе, n = 3.

 

Острая токсичность. Печень. У мышей контрольной группы на 7-й день после однократного введения физраствора в паренхиме печени находили единичные мелкие очаги мононуклеарной инфильтрации (рис. 2а). В одном случае отмечали очаговую гипертрофию гепатоцитов (рис. 2б). В группе введения однократной дозы препарата практически у всех животных в печеночной паренхиме обнаруживали многочисленные мелкие очаги мононуклеарной инфильтрации на месте погибших гепатоцитов с поздними проявлениями их фагоцитоза (рис. 3а) (табл. 2). У двух мышей данной группы отмечали очаговую гипертрофию гепатоцитов, у одной – единичные случаи кариомегалии гепатоцитов (рис. 3б). В группе введения пятикратной дозы препарата у двух животных в печеночной паренхиме находили также немногочисленные очаги нейтрофильной инфильтрации (рис. 4а), еще в двух случаях в очагах мононуклеарной инфильтрации присутствовали сегментоядерные лейкоциты (рис. 4б). В группе введения 10-кратной дозы препарата в печени встречали те же изменения, что и при введении тестируемого вещества в дозировке ×5. Вместе с тем, у двух животных данной группы в печени находили мелкие свежие очаги гепатоцитов с начальными явлениями некроза (рис. 5а). Еще у одной мыши в одной из долей органа наблюдали единичные гепатоциты с пигментными включениями в цитоплазме (рис. 5б).

 

Рис. 2. Фрагменты печени самок мышей контрольной группы. Окраска гематоксилином и эозином. Стрелками указаны: а – мелкий очаг мононуклеарной инфильтрации в паренхиме одной из долей органа (мышь 5.1); б – гипертрофия отдельных гепатоцитов (мышь 5.2).

 

Рис. 3. Фрагменты печени самок мышей на 7-й день после однократного введения 1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ/2 мг метиина. Окраска гематоксилином и эозином. Стрелками указаны: а – мелкий очаг мононуклеарной инфильтрации в паренхиме одной из долей органа (мышь 1.2); б – кариомегалия гепатоцита (мышь 1.3).

 

Таблица 2. Изменение морфологии печени и почек экспериментальных животных

Препарат (доза)	Физраствор	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 2 мг метиина (×1)	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 10 мг метиина (×5)	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 20 мг метиина (×10)	Физраствор	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 2 мг метиина (×1)
Число животных	2	6	6	6	3	8
Период введения препарата, дни	1				7
Некропсия, день	7				14
Число образцов	2	6	6	6	3	8
Характер изменений в органах	Количество и степень выраженности изменений
Печень:
Препарат (доза)	Физраствор	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 2 мг метиина (×1)	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 10 мг метиина (×5)	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 20 мг метиина (×10)	Физраствор	1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 2 мг метиина (×1)
Число образцов с изменением морфологии	2	6	6	6	2	6
Очаговая гипертрофия гепатоцитов	1MI	2MI	2MI 1SL	2MI	0	3MI 1SL
Кариомегалия гепатоцитов	0	1MI	1MI	3MI	0	1MI
Мононуклеарные инфильтраты в печеночной паренхиме	2MI	1MI 5SL	5MI 1SL	2MI 3SL	1MI 1SL	3MI 1SL
Фагоцитоз погибших гепатоцитов в очагах мононуклеарной инфильтрации	0	5SL	1SL	2SL	1SL	0
Очаги инфильтрации печеночной паренхимы сегментоядерными лейкоцитами	0	0	2MI 2SL	2MI	1SL	1MI
Свежие мелкие очаги некроза гепатоцитов	0	0	0	2MI	0	1SL
Пигментные включения в цитоплазме гепатоцитов	0	0	0	1MI	0	1MI
Очаги экстрамедуллярного гемопоэза	0	0	0	0	0	1SL
СУММАРНЫЙ БАЛЛ	3	24	20	22	7	17
Почки:
Число образцов с изменением морфологии	0	2	2	0	0	0
Явления хронической прогрессирующей нефропатии	0	2MI	2MI	1MI	0	0
Тубулярные кисты в корковом веществе, выстланные кубическим или уплощенным эпителием	0	1SL	0	0	0	0
Мелкий периваскулярный очаг мононуклеарной инфильтрации	0	0	0	1MI	0	0
СУММАРНЫЙ БАЛЛ	0	4	2	2	0	0

Примечание. MI (несущественное повреждение или отклонение от нормы) – 1 балл, SL (слабовыраженное повреждение или отклонение от нормы) – 2 балла, MO (умеренное повреждение или отклонение от нормы) – 3 балла, MA (выраженное повреждение или отклонение от нормы) – 4 балла, SE (резко выраженное повреждение или отклонение от нормы) – 5 баллов.

 

Рис. 4. Фрагменты печени самок мышей на 7-й день после однократного введения 1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ / 10 мг метиина. Окраска гематоксилином и эозином. Стрелками указаны: а – мелкие очаги инфильтрации сегментоядерными лейкоцитами (мышь 2.1), б – очаг мононуклеарной инфильтрации с единичными сегментоядерными лейкоцитами и явлениями фагоцитоза погибших гепатоцитов (мышь 2.6).

 

Рис. 5. Фрагменты печени самок мышей на 7-й день после однократного введения 1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ/20 мг метиина. Окраска гематоксилином и эозином. Стрелками указаны: а – очаг гепатоцитов с начальными явлениями некроза (мышь 3.4), б – гепатоциты с пигментными включениями в цитоплазме (мышь 3.5).

 

Таким образом, проведенное гистологическое исследование выявило слабое/умеренное дозозависимое гепатотоксическое действие однократного введения тестируемого препарата, проявляющееся, прежде всего, в мелкоочаговой гибели гепатоцитов.

Острая токсичность. Почки. У мышей группы негативного контроля не выявлено каких-либо отклонений морфофункционального состояния почек от нормы (рис. 6). В группе однократного введения препарата (1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ/2 мг метиина) в почках двух особей обнаружены начальные проявления хронической прогрессирующей нефропатии (рис. 7а). В одном из этих случаев в корковом веществе одной из почек присутствовали две тубулярные кисты, выстланные кубическим или уплощенным эпителием (рис. 7б). В группе тестирования пятикратной терапевтической дозы (1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ/10 мг метиина) в почках двух животных также найдены начальные проявления хронической прогрессирующей нефропатии. В группе введения 10-кратной дозы препарата только в одном случае в почках обнаружены начальные проявления хронической прогрессирующей нефропатии (рис. 8а), у той же мыши найден мелкий периваскулярный очаг мононуклеарной инфильтрации (рис. 8б). В гистологических образцах почек остальных животных отклонений от нормы не наблюдали.

 

Рис. 6. Фрагменты коркового (а) и мозгового (б) вещества почки самки мыши контрольной группы (мышь 5.1). Обычное гистологическое строение органа. Окраска гематоксилином и эозином.

 

Рис. 7. Фрагменты коркового вещества почки самок мышей на 7-й день после однократного введения 1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ/2 мг метиина. Окраска гематоксилином и эозином. Стрелками указаны: а – явления хронической прогрессирующей нефропатии (мышь 1.5), б – тубулярная киста (сплошная стрелка), выстланная уплощенным эпителием (пунктирные стрелки; мышь 1.3).

 

Рис. 8. Фрагменты коркового вещества почки мыши (мышь 3.5) на 7-й день после однократного введения 1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ/20 мг метиина. Окраска гематоксилином и эозином. Стрелками указаны: явления хронической прогрессирующей нефропатии (а) и периваскулярный очаг мононуклеарной инфильтрации (б).

 

Таким образом, гистологическое исследование не привело к получению каких-либо убедительных данных о наличии нефротоксического действия тестируемого препарата в указанных дозах при однократном введении. Описанные единичные патоморфологические изменения в почках являются фоновыми, не связанными с токсическим действием препарата.

Субхроническая токсичность. Печень. У двух животных контрольной группы (n = 3) в паренхиме разных долей печени обнаружены мелкие очаги мононуклеарной инфильтрации, в одном случае – с явлениями фагоцитоза погибших гепатоцитов и присутствием в части таких очагов сегментоядерных лейкоцитов (рис. 9а). Еще у одного животного не выявлено отклонений функциональной морфологии печени от нормы (рис. 9б). В группе определения субхронической токсичности через 7 дней после отмены препарата выявлены следующие отличия морфофункционального состояния печени от контрольной группы: у четырех животных отмечена очаговая гипертрофия гепатоцитов – у одной самки наблюдались также единичные случаи кариомегалии гепатоцитов и свежие мелкие очаги некроза гепатоцитов в разных долях органа (рис. 10а); у одной мыши обнаружены единичные гепатоциты с пигментными включениями в цитоплазме (рис. 10б); еще в одном случае выявлены многочисленные мелкие очаги экстрамедуллярного гемопоэза в разных долях органа (рис. 10в). У двух животных не отмечено отклонений функциональной морфологии печени от нормы (рис. 10г). Тем не менее, возникновение свежих очагов некроза гепатоцитов у одной мыши спустя 7 дней после окончания введения препарата не позволяет исключить гепатотоксическое действие тестируемого препарата. Однако все остальные изменения функциональной морфологии печени можно отнести к единичным фоновым находкам.

 

Рис. 9. Фрагменты печени самок мышей контрольной группы. Окраска гематоксилином и эозином. а – Стрелками указан очаг мононуклеарной инфильтрации с сегментоядерными лейкоцитами (мышь 5.4). б – Обычное гистологическое строение органа (мышь 5.3).

 

Рис. 10. Фрагменты печени самок мышей на 15-й день после 7-кратного введения 1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ/2 мг метиина. Окраска гематоксилином и эозином. Стрелками указаны: а – очаг гепатоцитов с начальными явлениями некроза (мышь 4.1); б – гепатоциты с пигментными включениями в цитоплазме (мышь 4.3); в – мелкие очаги экстрамедуллярного гемопоэза (мышь 4.6); г – обычное гистологическое строение органа (мышь 4.7).

 

Субхроническая токсичность. Почки. Гистологическое исследование почек животных группы субхронической токсичности и мышей контрольной группы не выявило в них каких-либо патоморфологических изменений (рис. 11). Таким образом, ежедневное введение 1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ/2 мг метиина (×1) в течение 7 дней не привело к гистологически заметным проявлениям нефротоксического действия препаратов.

 

Рис. 11. Фрагменты коркового (а) и мозгового (б) вещества почки мыши на 15-й день после 7-кратного введения 1.5 Ед С115Н-PIC-сом МГЛ/2 мг метиина (мышь 4.4). Обычное гистологическое строение органа. Окраска гематоксилином и эозином.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изменения морфологии печени во всех экспериментальных группах относились к несущественным или слабовыраженным повреждениям/отклонениям от нормы. Отмечено, что исследуемый препарат оказывает негативное дозозависимое влияние на печень: умеренное при однократном введении ×10 терапевтической дозы (ранняя и отсроченная гибель клеток печени) и слабое при однократном введении ×5 и ×1 терапевтических доз (поздняя стадия фагоцитоза погибших гепатоцитов). Низкое гепатотоксическое действие наблюдалось и при ежедневном однократном введении терапевтической дозы в течение 7 дней; морфология печени у четверти животных группы субхронической токсичности не отличалась от нормы. Нефротоксический эффект во всех группах исследования не был обнаружен. Таким образом, фармакологическая пара инкапсулированный фермент С115Н МГЛ/метиин не вызвала существенных отклонений от нормы при исследовании на мышиных моделях и может стать перспективным лекарственным препаратом, способным блокировать развитие патогенных бактерий в организме.

Исследование поддержано Российским научным фондом (грант № 20-74-10121-П).

Проведение экспериментов и содержание животных на базе Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (филиал в г. Пущино) соответствовали правилам Европейского Парламента и Совета Европейского Союза (Директива 2010/63/EU от 22 сентября 2010 г.) и были одобрены комиссией Филиала института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных IACUC № 709/19 от 01.07.2019.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

作者简介

S. Revtovich

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

V. Kulikova

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

V. Koval

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

A. Lyfenko

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

V. Kazakov

Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290

A. Chernov

Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290

G. Telegin

Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290

A. Zemskaya

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

N. Anufrieva

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

E. Morozova

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

P. Solyev

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: svetla21@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

参考

补充文件