The Drosophila Zinc Finger Proteins Aef1 and Cg10543 Are Co-Localized with SAGA, SWI/SNF and ORC Complexes on Gene Promoters and Involved in Transcription Regulation

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

In previous studies, we purified the DUB-module of the Drosophila SAGA complex and showed that a number of zinc proteins interact with it, including Aef1 and CG10543. In this work, we conducted a genome-wide study of the Aef1 and CG10543 proteins and showed that they are localized predominantly on the promoters of active genes. The binding sites of these proteins colocalize with the SAGA and dSWI/SNF chromatin modification and remodeling complexes, as well as with the ORC replication complex. It has been shown that the Aef1 and CG10543 proteins are involved in the regulation of the expression of some genes on the promoters of which they are located. Thus, the Aef1 and CG10543 proteins are new participants in the cell transcriptional network and colocalize with the main transcription and replication complexes of Drosophila.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Высококонсервативный коактиваторный комплекс SAGA, основной функцией которого является модификация (ацетилирование и деубиквитинирование) гистонов хроматина, содержит более 20 белковых субъединиц [1]. Субъединицы комплекса SAGA взаимодействуют с различными активаторами транскрипции, привлекая таким образом комплекс на промоторы определенных генов [2, 3]. В действии комплексов, ремоделирующих и модифицирующих хроматин, существует определенный синергизм. Показано, что комплекс SAGA ацетилирует нуклеосомы на промоторах генов в процессе активации транскрипции. Это приводит к привлечению комплекса ремоделирования хроматина dSWI/SNF и стимулированию его ремоделирующей активности [4, 5].

Комплексы SAGA и SWI/SNF дрозофилы локализованы на различных регуляторных элементах генома, включая промоторы, где зачастую колокализуются с репликационным комплексом ORC [6]. Инициация репликации происходит на множестве сайтов в геноме, которые называются участками начала (ориджинами) репликации. На ориджины репликации привлекается комплекс ORC, который состоит из шести субъединиц (ORC1–6). Этот комплекс участвует в создании платформы для связывания белков пререпликативного комплекса и в инициации репликации. Чтобы обеспечить правильный временной паттерн репликации генома в S-фазе, в клетках эукариот создается множество ориджинов репликации, определенная часть которых запускается в зависимости от стадии развития организма и условий роста. Комплекс ORC связывает определенные участки генома [7], однако субъединицы данного комплекса не проявляют явной специфичности к последовательностям ДНК. Поэтому встает вопрос, какие факторы определяют позиционирование ORC-комплексов в геноме.

В ходе предыдущих исследований нами обнаружено, что инсуляторный белок Su(Hw), содержащий домен цинковых пальцев, взаимодействует с белком ENY2 (субъединица DUB-модуля комплекса SAGA) и привлекает комплексы SAGA, SWI/SNF и ORC на Su(Hw)-зависимые инсуляторы дрозофилы, участвуя одновременно в регуляции транскрипции и в позиционировании ориджинов репликации [8–11]. Белок ENY2 является субъединицей деубиквитинирующего (DUB) модуля комплекса SAGA, связанной с различными стадиями экспрессии генов [8–15]. Высказано предположение, что существуют и другие “цинковые белки”, которые взаимодействуют с комплексом SAGA дрозофилы и функционируют сходным образом на других регуляторных элементах генома, включая промоторы. В ходе дальнейших экспериментов был идентифицирован еще один подобный цинковый белок – CG9890 [16–18]. С целью поиска новых цинковых белков, взаимодействующих с комплексом SAGA дрозофилы, был очищен DUB-модуль комплекса SAGA [19]. С использованием масс-спектрометрического анализа показано, что в состав фракций, содержащих DUB-модуль комплекса SAGA, входят несколько десятков белков с доменами цинковых пальцев, из которых отобрали белки с кластером близкорасположенных цинковых пальцев и каноническим линкером (TGE[K/R]P) между ними, так как именно такая структура с максимальной вероятностью предсказывает ДНК-связывающие свойства белка со специфичным сайтом связывания [20, 21]. В результате дальнейшего отбора осталось 12 белков, взаимодействие которых было проверено с помощью реакции коиммунопреципитации. Подтверждено взаимодействие белка CG9609, а также обнаружено его слабое взаимодействие с белками Aef1 (Adult enhancer factor 1) и CG10543. Чтобы дополнительно подтвердить взаимодействие белков Aef1 и CG10543 с комплексом SAGA дрозофилы было решено провести ChIP-Seq-анализ этих белков и определить колокализацию данных факторов на полногеномном уровне.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование клеток линии Schneider 2 (S2). РНК-интерференция. Клетки культивировали при 25°C в среде Schneider′s insect medium (“Sigma”, США), содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (“HyClone”, США). Клетки трансфицировали с использованием Effectene Transfection Reagent (“Qiagen”, Германия) по протоколу производителя. Нокдаун генов проводили с помощью РНК-интерференции согласно опубликованному протоколу [22]. дцРНК для нокдауна генов Aef1 и CG10543 синтезировали с использованием следующих праймеров:

Aef1 – GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGATGCATATCAAAAGCCT и GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATCCGGGATGCTCGCTATGT; CG10543 – GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGATGAGCTTCCAGCATAT и GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAATCGTTCTTCACTGGGTAGTA.

В качестве контроля использовали дцРНК, соответствующую фрагменту плазмиды pBluescipt II SK(−) (“Stratagene”, США) длиной 500 п. н. pBluesciptIISK(−), GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTACATGATCCCCCATG и GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATTTCGCCCCGAAGAACG.

В каждый эксперимент по РНК-интерференции дцРНК брали из расчета 30 мкг на 1 млн клеток. По прошествии 5 дней инкубации выделяли РНК и измеряли уровни мРНК исследуемых генов методом обратной транскрипции с последующей ПЦР в реальном времени. Использовали следующие праймеры:

sgl – CGTGATAACTCTGGTGGACAAG и GTCTCGATGTCCGTTGAGAAG; D19B – TTGCCGAAAAGGCTTTACCAC и CACTCCGTGCAGGGGAAGTC; Kek1 – ACCCTGCTGCCTGGAATGAT и GCATGTAGCCATCCTCAGTCATC; wg – ACTGCTCGACGAGAAACTTCTC и TGTAGTCGCAGGTGCAGGAC; Psc – CGCTGACTCAAAACTCAAGTGTG и TCGATTCTGGCGTCATCATAGTA; CG1907 – CCGCTAGACTTGGTCAAGACC и TGTCTCAGCAGAGCAGCTCC; CG34136 – TGCCTTGCATTCTTCGCTTG и GTCGTGGCGCTGTAGGGACT; Ras64B – GAGGGATTCCTGCTCGTCTTCG и GTCGCACTTGTTACCCACCATC.

Получение поликлональных антител к белкам Aef1 и CG10543. Поликлональные антитела α-Aef1 и α-CG10543 получали из сыворотки крови крыс, иммунизированных фрагментами соответствующих белков. Фрагменты белков нарабатывали в клетках Escherichia coli: белок Aef1 с использованием N-концевого фрагмента длиной 162 аминокислотных остатка, а белок CG10543 – С-концевого фрагмента из 136 аминокислотных остатков. Эти участки были выбраны, чтобы исключить домены цинковых пальцев из фрагментов, которые будут использоваться для иммунизации животных. Домены цинковых пальцев при получении антител к цинковым белкам не использовали, так как это может дать перекрестную реакцию с другими цинковыми белками. Антитела очищали на колонках, которые содержали соответствующие рекомбинантные белки.

Идентификация сайтов связывания белков Aef1 и CG10543 в геноме дрозофилы. Сайты связывания белков Aef1 и CG10543 идентифицировали, как описано ранее. Идентифицировано примерно по 3500 сайтов связывания каждого из белков.

Анализ распределения сайтов связывания белков Aef1 и CG10543 в геноме. Геном разбивали на точки начала транскрипции (TSS), точки терминации транскрипции (TES), транскрибируемые области (участки генов за исключением TSS и TES) и межгенные области (все остальное). Областью TSS считали интервал ±500 п. н. от старта транскрипции. Областью TES считали интервал ±500 п. н. от точки терминации транскрипции. Данные области определяли из аннотации транскриптов генома дрозофилы dmel_r6.40. Считали, что сайт связывания находится в данной области, если пик сайта связывания попадает в заданный интервал.

Анализ привлечения комплексов SAGA, SWI/SNF, ORC на сайты связывания белков Aef1 и CG10543. В анализе использовали ChIP-Seq профили белков GCN5 (комплекс SAGA), OSA (комплекс SWI/SNF), ORC2 (комплекс ORC), полученные нами в предыдущих работах. Был посчитан усредненный профиль каждого из этих белков на четырех группах сайтов: на сайтах связывания белков Aef1 и CG10543, на случайных промоторах и на случайных местах генома. Так как для каждого из белков Aef1 и CG10543 было идентифицировано около 3500 сайтов, мы отобрали такое же число случайных промоторов и случайных мест генома с помощью генератора псевдослучайных чисел. Для получения усредненного ChIP-Seq профиля белков GCN5, OSA и ORC2 на какой-либо группе сайтов сначала были получены локальные профили каждого из 3500 сайтов в группе в пределах ±5000 п. н. от сайта. Затем эти 3500 локальных профилей усредняли по каждой нуклеотидной позиции для получения среднего профиля. Таким образом получено 12 усредненных профилей для трех белков – GCN5, OSA и ORC2 – на четырех группах сайтов.

Результаты ChIP-Seq-анализа размещены в базе данных Gene Expression Omnibus (идентификатор эксперимента GSE250183). Кроме самих данных, в этой базе приведены также протоколы иммунопреципитации хроматина, создания библиотек и обработки данных.

ChIP-Seq профили получали с помощью программы bamCoverage 3.5.4. Значения в профиле представляют собой нормированное (CPM – Counts Per Million mapped reads) значение ДНК-фрагментов в каждой геномной позиции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Белки Aef1 и CG10543 локализованы преимущественно на промоторах генов

С целью идентификации сайтов локализации белков Aef1 и CG10543 в геноме проведен CHIP-Seq-анализ. Поликлональные антитела к белкам Aef1 и CG10543 получены и аффинно очищены на колонках, содержащих соответствующие рекомбинантные белки. Специфичность антител проверена с помощью Вестерн-блотинга. На полиакриламидный гель наносили белковые экстракты, выделенные как из нормальных клеток, так и подвергнутых РНК-интерференции (рис. 1). Вестерн-блот инкубировали с проверяемыми антителами и антителами к α-тубулину для контроля белковой нагрузки. На рис. 1 видно, что антитела узнают полосы, интенсивность которых значительно уменьшилась после РНК-интерференции соответствующих белков. При этом полосы α-тубулина не изменились.

 

Рис. 1. Проверка специфичности антител к белку Aef1 (а) и CG10543 (б) с помощью Вестерн-блот-анализа. На панели а нанесен белковый экстракт из контрольных клеток (К) в двух разведениях (1 и 1:5), а также белковый экстракт из клеток после РНК-интерференции Aef1 (Aef1i), также взятый в двух разведениях. Вестерн-блот (панель а) инкубировали с проверяемыми антителами к белку Aef1, а также с антителами к α-тубулину для контроля нанесения. На панели б каждый из образцов нанесен в трех разведениях (1, 1:3, 1:10). К – экстракт из контрольных клеток, CG10543i – экстракт из клеток после РНК-интерференции CG10543. Вестерн-блот (панель б) инкубировали с антителами к белку СG10543, а также с антителами к α-тубулину для контроля нанесения.

 

Затем была проведена иммунопреципитация хроматина из культуры клеток дрозофилы S2 с использованием антител к CG10543 и Aef1 в двух повторах и получены библиотеки для высокопроизводительного секвенирования, которое проводили на геномном секвенаторе Illumina Novaseq 6000. Полученные последовательности выравнивали на геном с помощью программы Hisat2. В дальнейший анализ брали только уникально картированные риды. Потенциальные места связывания идентифицировали с помощью программы Macs2. Характерный ChIP-seq профиль белков Aef1 и CG10543 представлен на рис. 2. В качестве примера приведен ген wg, на промоторе которого находятся оба белка. Идентифицировано примерно по 3500 сайтов связывания каждого белка (FDR <5%).

 

Рис. 2. ChIP-Seq профили белков CG10543 (черный) и Aef1 (серый) в области генa wg. На верхней панели представлена структура гена из геномного браузера. На нижней панели представлены ChIP-Seq профили в единицах CPM.

 

Мы аннотировали полученные сайты по признаку их локализации в одном из следующих элементов генома дрозофилы: промоторы генов, 3’-концы генов, тела генов и межгенные области. Согласно полученным данным (рис. 3), наибольшее количество ChIP-Seq-пиков белков Aef1 и CG10543 представлено в промоторных областях генов дрозофилы, 55 и 76% соответственно. Мы предполагаем, что, локализуясь преимущественно на промоторах генов, данные белки могут участвовать в функционировании регуляторных генетических элементов этого типа.

 

Рис. 3. Распределение сайтов связывания белков Aef1 (верхнее левое изображение) и CG10543 (верхнее правое изображение) относительно аннотированных элементов генома дрозофилы. Для сравнения показана относительная представленность всех аннотированных элементов в геноме (Genome) (нижнее изображение). TSS-промоторная область, TES-конец гена, Gene bodies – область гена между TSS и TES, Intergenic – межгенные области.

 

Далее были определены потенциальные консенсусные последовательности связывания белков Aef1 и CG10543. Для этого получили нуклеотидные последовательности длиной 500 п. н. вокруг каждого ChIP-Seq-пика с помощью программы bedtools, а затем проанализировали их в программе MEME-ChIP. Были определены консенсусные последовательности, которыми обогащены фрагменты ChIP-Seq, представленные на рис. 4.

 

Рис. 4. Консенсусная последовательность потенциального сайта связывания белков CG10543 (a) и Aef1 (б).

 

Эти консенсусы имеют высокую статистическую значимость, центральное обогащение во фрагментах ChIP-Seq и не являются сайтами связывания какого-либо известного белка. Таким образом, их можно рассматривать как потенциальные сайты связывания белков Aef1 и CG10543.

Белки CG10543 и Aef1 колокализуются с комплексами SAGA, SWI/SNF и ORC на своих сайтах связывания

Геномная колокализация белков Aef1 и CG10543 c комплексами SAGA, SWI/SNF и ORC изучена нами с использованием программного обеспечения собственной разработки для построения усредненного профиля исследуемого фактора на заданных сайтах генома (см. раздел Экспериментальная часть) [8]. ChIP-Seq-профили белков ORC2, GCN5, OSA получены в нашей лаборатории ранее. Рассчитаны усредненные профили данных белков на четырех группах сайтов: на сайтах связывания белка Aef1, на сайтах связывания белка CG10543, на случайных промоторах и на случайных участках генома (рис. 5). Изображение усредненных профилей на случайных сайтах генома не приведено. Эти профили представляют собой прямые линии на уровне фона (примерно 2).

 

Рис. 5. Усредненные ChIP-Seq-профили белков ORC2 (комплекс ORC), OSA (комплекс SWI/SNF) и GCN5 (комплекс SAGA) на сайтах связывания белков Aef1, CG10543 и на случайных промоторах. Слева указаны субъединицы данных комплексов: ORC2 (ORC), OSA (SWI/SNF), GCN5 (SAGA). Представлен средний ChIP-Seq-профиль белков (указаны слева) на трех группах сайтов (указаны вверху). По оси ординат профили представлены в единицах CPM, по оси абсцисс указано расстояние в т. п. н. относительно центра пика. В каждой из групп анализировали примерно по 3500 сайтов. Горизонтальными отрезками отмечен уровень сигнала на случайных промоторах. Видно, что субъединицы комплексов SAGA, SWI/SNF и ORC привлекаются на сайты Aef1 и CG10543 в большем количестве, чем на случайные промоторы.

 

Поскольку белки Aef1 и CG10543 локализованы преимущественно на промоторах генов, на их сайтах связывания можно будет найти обогащение любых промоторных факторов, включая комплексы SAGA, dSWI/SNF и ORC, относительно среднегеномного уровня. Однако, как можно видеть из рис. 5, белки GCN5 (комплекс SAGA), OSA (комплекс dSWI/SNF) и ORC2 (комплекс ORC) обогащены на сайтах связывания белков Aef1 и CG10543 не только по сравнению со среднегеномным уровнем (примерно 2), но и по сравнению со случайными промоторами. Полученный результат свидетельствует, что причиной данной колокализации является не просто случайное совпадение на промоторах генов, а то, что именно сайт связывания цинковых белков Aef1 и CG10543 способствует локализации комплексов SAGA, dSWI/SNF и ORC.

Белки CG10543 и Aef1 принимают участие в регуляции экспрессии генов

Учитывая, что исследуемые белки найдены преимущественно на промоторах генов, мы решили с помощью метода РНК-интерференции определить, к каким изменениям в экспрессии генов приведет снижение внутриклеточного уровня этих белков. В эксперимент взяли гены, на промоторах которых присутствуют оба белка. Используя метод ОТ-кПЦР, мы проанализировали количество РНК семи генов в образцах, выделенных из контрольных клеток и клеток после РНК-интерференции. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 6. После нокдауна CG10543 и Aef1 количество мРНК части генов возросло. Таким образом, эти белки действительно могут участвовать в регуляции экспрессии тех генов, на промоторах которых они локализуются, выступая в роли репрессоров.

 

Рис. 6. Транскрипция некоторых генов, содержащих оба белка, CG10543 и Aef1, на своих промоторах, при нокдауне CG10543 и Aef1 в индивидуальных экспериментах. Названия генов указаны внизу. Светло-серые столбцы соответствуют транскрипции генов при РНК-интерференции Aef1, темно-серые столбцы – при РНК-интерференции CG10543. Белые столбцы соответствуют транскрипции гена в норме (контроль), принято за единицу. По оси ординат указано соотношение транскрипции в опыте и в контроле. В качестве нормировочного гена использовали ген ras64B. Эксперименты проводили в трех повторах. Планки погрешностей отмечают стандартную ошибку среднего. Звездочкой указаны статистически значимые изменения с p < 0.05 (использован t-критерий Стьюдента).

 

В ходе предыдущих исследований мы обнаружили, что инсуляторный белок Su(Hw) дрозофилы, содержащий домен цинковых пальцев, взаимодействует с белком ENY2 (субъединица DUB-модуля комплекса SAGA) и привлекает комплексы SAGA, SWI/SNF и ORC на Su(Hw)-зависимые инсуляторы, участвуя одновременно в регуляции транскрипции и в позиционировании ориджинов репликации [8–10]. Предполагалось, что существуют и другие цинковые белки, которые взаимодействуют с комплексом SAGA дрозофилы и функционируют сходным образом на других регуляторных элементах генома, включая промоторы. В дальнейшем были идентифицированы еще два цинковых белка CG9890 [16–18] и CG9609. В данной работе показана полногеномная колокализация еще двух белков – Aef1 и CG10543 – с комплексами SAGA, SWI/SNF и ORC. Все четыре белка, CG9890, CG9609, Aef1 и CG10543, содержат домены цинковых пальцев, локализованы на промоторах активных генов, колокализуются с основными транскрипционными и репликационными комплексами и участвуют в регуляции транскрипции. Мы предполагаем, что подобно Su(Hw) эти четыре белка могут участвовать в привлечении комплексов SAGA, SWI/SNF и ORC на свои сайты связывания, организуя, таким образом, регуляторные элементы генома, необходимые для функционирования клетки. Нокдаун генов Aef1 и CG10543 приводит к изменению транскрипции некоторых из проверенных генов (рис. 6). По всей видимости, на промоторах генов присутствует множество цинковых белков, которые стабилизируют транскрипционные комплексы, и нокдаун одного из них не всегда приводит к заметному влиянию на транскрипцию.

 

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП ИБГ РАН и при поддержке Российского научного фонда (грант № 20-14-00269).

Данная работа выполнена без привлечения людей и животных в качестве объектов исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

J. V. Nikolenko

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: krasnov@genebiology.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

M. M. Kurshakova

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: krasnov@genebiology.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

D. V. Kopytova

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: krasnov@genebiology.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

Y. A. Vdovina

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: krasnov@genebiology.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

N. E. Vorobyova

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: krasnov@genebiology.ru
Russian Federation, Москва, 119334

A. N. Krasnov

Институт биологии гена Российской академии наук

Author for correspondence.
Email: krasnov@genebiology.ru
Russian Federation, Москва, 119334

References

  1. Koutelou E., Hirsch C.L., Dent S.Y. (2010) Multiple faces of the SAGA complex. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 374–382.
  2. Baker S.P., Grant P.A. (2007) The SAGA continues: expanding the cellular role of a transcriptional co-activator complex. Oncogene. 26, 5329–5340.
  3. Brown C.E., Howe L., Sousa K., Alley S.C., Carrozza M.J., Tan S., Workman J.L. (2001) Recruitment of HAT complexes by direct activator interactions with the ATM-related Tra1 subunit. Science. 292, 2333–2337.
  4. Chatterjee N., Sinha D., Lemma-Dechassa M., Tan S., Shogren-Knaak M.A., Bartholomew B. (2011) Histone H3 tail acetylation modulates ATP-dependent remodeling through multiple mechanisms. Nucl. Acids Res. 39, 8378–8391.
  5. Li B., Carey M., Workman J.L. (2007) The role of chromatin during transcription. Cell. 128, 707–719.
  6. MacAlpine D.M., Rodriguez H.K., Bell S.P. (2004) Coordination of replication and transcription along a Drosophila chromosome. Genes Dev. 18, 3094–3105.
  7. Eaton M.L., Prinz J.A., MacAlpine H.K., Tretyakov G., Kharchenko P.V., MacAlpine D.M. (2011) Chromatin signatures of the Drosophila replication program. Genome Res. 21, 164–174.
  8. Vorobyeva N.E., Mazina M.U., Golovnin A.K., Kopytova D.V., Gurskiy D.Y., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G., Georgiev P.G., Krasnov A.N. (2013) Insulator protein Su(Hw) recruits SAGA and Brahma complexes and constitutes part of Origin Recognition Complex-binding sites in the Drosophila genome. Nucl. Acids Res. 41, 5717–5730.
  9. Мазина М.Ю., Воробьева Н.Е., Краснов А.Н. (2013) Способность Su(Hw) создавать платформу для формирования ориджинов репликации не зависит от типа окружающего хроматина. Цитология. 55(4), 218–224.
  10. Kurshakova M., Maksimenko O., Golovnin A., Pulina M., Georgieva S., Georgiev P., Krasnov A. (2007) Evolutionarily conserved E(y)2/Sus1 protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila. Mol. Cell. 27, 332–338.
  11. Vorobyeva N.E., Erokhin M., Chetverina D., Krasnov A.N., Mazina M.Y. (2021) Su(Hw) primes 66D and 7F Drosophila chorion genes loci for amplification through chromatin decondensation. Sci. Rep. 11, 16963.
  12. Vorobyeva N.E., Nikolenko J.V., Krasnov A.N., Kuzmina J.L., Panov V.V., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G., Shidlovskii Y.V. (2011) SAYP interacts with DHR3 nuclear receptor and participates in ecdysone-dependent transcription regulation. Cell Cycle. 10, 1821–1827.
  13. Kopytova D.V., Krasnov A.N., Orlova A.V., Gurskiy D.Y., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G., Shidlovskii Y.V. (2010) ENY2: couple, triple…more? Cell Cycle. 9, 479–481.
  14. Krasnov A.N., Kurshakova M.M., Ramensky V.E., Mardanov P.V., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G. (2005) A retrocopy of a gene can functionally displace the source gene in evolution. Nucl. Acids Res. 33, 6654–6661.
  15. Gurskiy D., Orlova A., Vorobyeva N., Nabirochkina E., Krasnov A., Shidlovskii Y., Georgieva S., Kopytova D. (2012) The DUBm subunit Sgf11 is required for mRNA export and interacts with Cbp80 in Drosophila. Nucl. Acids Res. 40, 10689–10700.
  16. Николенко Ю.В., Фурсова Н.А., Мазина М.Ю., Воробьева Н.Е., Краснов А.Н. (2022) Белок CG9890 дрозофилы участвует в регуляции экдизонзависимой транскрипции. Молекуляр. биология. 56(4), 557–563.
  17. Фурсова Н.А., Мазина М.Ю., Николенко Ю.В., Воробьева Н.Е., Краснов А.Н. (2020) Белок CG9890 дрозофилы, содержащий домены цинковых пальцев, колокализуется с комплексами модификации и ремоделирования хроматина на промоторах генов и участвует в регуляции транскрипции. Acta Naturae. 12, 114–119.
  18. Фурсова Н.А., Николенко Ю.В., Сошникова Н.В., Мазина М.Ю., Воробьева Н.Е., Краснов А.Н. (2018) Белок CG9890 с доменами цинковых пальцев – новый компонент ENY2-содержащих комплексов дрозофилы. Acta Naturae. 10, 110–114.
  19. Николенко Ю.В., Вдовина Ю.А., Фефелова Е.И., Глухова А.А., Набирочкина Е.Н., Копытова Д.В. (2021) Деубиквитинирующий (DUB) модуль SAGA участвует в Pol III-зависимой транскрипции. Молекуляр. биология. 55(3), 500–509.
  20. Enuameh M.S., Asriyan Y., Richards A., Christensen R.G., Hall V.L., Kazemian M., Zhu C., Pham H., Cheng Q., Blatti C., Brasefield J.A., Basciotta M.D., Ou J., McNulty J.C., Zhu L.J., Celniker S.E., Sinha S., Stormo G.D., Brodsky M.H., Wolfe S.A. (2013) Global analysis of Drosophila Cys(2)-His(2) zinc finger proteins reveals a multitude of novel recognition motifs and binding determinants. Genome Res. 23, 928–940.
  21. Laity J.H., Dyson H.J., Wright P.E. (2000) DNA-induced alpha-helix capping in conserved linker sequences is a determinant of binding affinity in Cys(2)-His(2) zinc fingers. J. Mol. Biol. 295, 719–727.
  22. Clemens J.C., Worby C.A., Simonson-Leff N., Muda M., Maehama T., Hemmings B.A., Dixon J.E. (2000) Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 6499–6503.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Testing the specificity of antibodies to Aef1 (a) and CG10543 (b) proteins using Western blot analysis. Panel a shows the protein extract from control cells (K) in two dilutions (1 and 1:5), as well as the protein extract from cells after Aef1 RNA interference (Aef1i), also taken in two dilutions. The Western blot (panel a) was incubated with the tested antibodies to the Aef1 protein, as well as with antibodies to α-tubulin as a control for loading. In panel b, each of the samples was applied in three dilutions (1, 1:3, 1:10). K is the extract from control cells, CG10543i is the extract from cells after CG10543 RNA interference. Western blot (panel b) was incubated with antibodies to the CG10543 protein, as well as with antibodies to α-tubulin as a loading control.

Download (52KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. ChIP-Seq profiles of CG10543 (black) and Aef1 (gray) proteins in the wg gene region. The top panel shows the gene structure from the genome browser. The bottom panel shows the ChIP-Seq profiles in CPM units.

Download (300KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Distribution of Aef1 (upper left) and CG10543 (upper right) protein binding sites relative to annotated elements of the Drosophila genome. Relative abundance of all annotated elements in the genome (lower) is shown for comparison. TSS is the promoter region, TES is the end of the gene, Gene bodies are the region of the gene between the TSS and TES, Intergenic are the intergenic regions.

Download (116KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Consensus sequence of the potential binding site of the proteins CG10543 (a) and Aef1 (b).

Download (100KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Averaged ChIP-Seq profiles of ORC2 (ORC complex), OSA (SWI/SNF complex), and GCN5 (SAGA complex) proteins at the binding sites of Aef1, CG10543 proteins, and at random promoters. The subunits of these complexes are indicated on the left: ORC2 (ORC), OSA (SWI/SNF), GCN5 (SAGA). The average ChIP-Seq profile of proteins (indicated on the left) at three groups of sites (indicated at the top) is shown. The ordinate axis shows the profiles in CPM units, the abscissa axis shows the distance in kb relative to the peak center. Approximately 3500 sites were analyzed in each group. The horizontal bars indicate the signal level at random promoters. It is evident that the subunits of the SAGA, SWI/SNF, and ORC complexes are recruited to the Aef1 and CG10543 sites in greater quantities than to random promoters.

Download (206KB)
Indexing metadata
7. Fig. 6. Transcription of some genes containing both proteins, CG10543 and Aef1, at their promoters upon knockdown of CG10543 and Aef1 in individual experiments. Gene names are indicated at the bottom. Light gray bars correspond to gene transcription upon Aef1 RNA interference, dark gray bars – upon CG10543 RNA interference. White bars correspond to gene transcription under normal conditions (control), taken as unity. The ordinate axis shows the ratio of transcription in the experiment and in the control. The ras64B gene was used as a normalization gene. The experiments were performed in triplicate. Error bars indicate the standard error of the mean. Statistically significant changes with p < 0.05 (Student's t-test was used) are indicated by an asterisk.

Download (117KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».