How to shift the equilibrium of dna break repair in favor of homology recombination

Full Text

Сокращения:

CRISPR – короткие палиндромные повторы, разделенные уникальными последовательностями-спейсерами (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats); CRISPR/Cas-ассоциированная нуклеаза; PAM – смежный протоспейсерный мотив (Protospacer Adjacent Motif); PFS – последовательность нуклеотидов, фланкирующая протоспейсер (Protospacer Flanking Sequence); NHEJ – негомологичное соединение концов (Nonhomologous DNA End Joining); MMEJ – соединение концов ДНК на основе микрогомологии (Microhomology-Mediated End Joining); HDR – гомологичная рекомбинация (Homology Directed Recombination); гРНК – гидовая РНК (sgRNA – single-guide RNA), tracrРНК – транс-активирующая РНК (trans-activating RNA); crРНК – направляющая РНК (crisprRNA); ОЦР – одноцепочечные разрывы; ДЦР – двухцепочечные разрывы; RuvC – каталитический домен нуклеазы Cas9, вносящий одноцепочечный разрыв в целевой участок ДНК (протоспейсер); HNH – каталитический домен нуклеазы Cas9, вносящий одноцепочечный разрыв в целевой участок ДНК и связывающийся со спейсером crРНК; аминокислотные остатки – а. к. (при цифре).

ВВЕДЕНИЕ

Новые стратегии и подходы к направленному редактированию генома, разработанные за последние десятилетия, активно используются для решения различных задач фундаментальной биологии, биотехнологии, медицины и сельского хозяйства. Появление геномного редактирования позволило изучать функциональную роль генов млекопитающих, создавать животные модели генетических заболеваний человека и разрабатывать подходы к их диагностике и лечению, усовершенствовать значимые для сельского хозяйства виды растений. Конструирование генетических редакторов, позволяющих избирательно активировать, модифицировать или выключать целевые гены-мишени, в том числе ассоциированные с патологическими процессами и генетическими заболеваниями, является одним из приоритетных направлений развития генетических технологий. Знание принципов создания генетических редакторов, обладающих высокой эффективностью, точностью редактирования, безопасностью и доступностью для широкого круга исследователей, позволит ученым успешно решать задачи высокоточного редактирования генома растений, животных и человека. В настоящем обзоре суммированы сведения об усовершенствовании и разработке новых высокоточных геномных редакторов CRISPR/Cas с повышенной эффективностью гомологичной рекомбинации (HDR), что позволит вводить целевые генетические конструкции в заданные участки генома.

ЭНДОНУКЛЕАЗНАЯ СИСТЕМА РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА CRISPR/Cas

Изначально CRISPR/Cas – это система адаптивного иммунитета архей и бактерий, нацеленная на чужеродные генетические элементы вторгшихся фагов. Система CRISPR/Cas включает геномные локусы CRISPR, состоящие из коротких палиндромных повторов, разделенных уникальными последовательностями-спейсерами, встроенными в геном в ходе адаптивного иммунного ответа, и белков Cas, кодируемых фланкирующими локус генами. Белки Cas обеспечивают реализацию молекулярного механизма адаптивного иммунитета, который можно разделить на три стадии: адаптации – встраивания в CRISPR-кассету новых спейсеров; процессинга, во время которого происходит транскрипция CRISPR-массива в пре-crРНК (предшественник crРНК) и ее специфичный гидролиз с образованием зрелых crРНК; интерференции – распознавания целевой нуклеиновой кислоты и ее разрушения. На стадии интерференции белки Cas эффекторного комплекса, сформированного с участием CRISPR-РНК (crРНК), расщепляют ДНК или РНК атакующих фагов, содержащих участок, комплементарный последовательности спейсера, и тем самым дезактивируют их. Специфичность в отношении целевого участка нуклеиновой кислоты фагов достигается за счет малых некодирующих РНК, известных как направляющие, или гидовые РНК (гРНК), которые составляют клеточную память о прошлых инфекциях. гРНК представляет собой молекулу РНК, которая содержит вариабельную спейсерную последовательность, направляющую Cas в гомологичную целевую область протоспейсера в геноме инфекционных элементов. гРНК может содержать два сегмента: сегмент нацеливания ДНК (crРНК) и сегмент, связывающий белок (tracrРНК).

Этот механизм лег в основу системы редактирования генома CRISPR/Cas для изучения функций генов, создания мутантных клеточных линий и животных, методов диагностики и терапии различных заболеваний.

CRISPR-системы подразделяют на два класса в зависимости от архитектуры их эффекторных комплексов, в каждом из которых выделяют по три типа (табл. 1) [1]:

• – в системах первого класса несколько белковых единиц образуют эффекторный комплекс с crРНК для распознавания и расщепления целевой последовательности;
• – системы второго класса состоят из односубъединичных эффекторных нуклеаз с разнообразными функциональными свойствами.

 

Таблица 1. Классификация и организация системы CRISPR/Cas

Класс	Тип	Подтип	Белки Cas	Организация оперонов для типа Cas в зависимости от вида бактерий и архей
Класс 1	Тип 1	I-A, I-B, I–C, I-D, I-E, I-F, I-U	Cas1, Cas2, Cas3', Cas3'', Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8	I-A: Archaeoglobus fulgidus I-B: Clostridium kluyveri I–C: Bacillus halodurans I-D: Cyanothece sp. I-E: Escherichia coli K12 I-F: Yersinia pseudotuberculosis I-U: Geobacter sulfurreducens
	Тип 3	III-A, III-B, III–C, III-D	Cas1, Cas2, Cas5, Cas6, Cas7, Cas9, Cas10	III-A: Staphylococcus epidermidis III-B: Pyrococcus furiosus III–C: Methanothermobacter thermautotrophicus III-D: Synechocystis sp.
	Тип 4		Cas1, Cas2, Cas5, Cas6, Cas7	IV: Thioalkalivibrio sp. K90mix
Класс 2	Тип 2	II-A, II-B, II–C	Cas1, Cas2, Cas4, Cas9, Csn	II-A: Streptococcus pyogenes II-B: Legionella pneumophila str. Paris II–C: Neisseria lactamica 020–06
	Тип 5	V-A, V-B, V–C, V-D, V-E	Cas1, Cas2, Cas4, Cas12	V-A: Francisella cf. novicida Fx1 V-B: Alicyclobacillus acidoterrestris V–C: Oleiphilus sp. V-D: Bacterium CG09_39_24 V-E: Deltaproteobacteria bacterium
	Тип 6	VI-A, VI–C, VI-B1, VI-B2	Cas1, Cas2, Cas13	VI-A: Leptotrichia shahii VI–C: Fusobacterium prefoetens VI-B1: Prevotella buccae VI-B2: Bergeyella zoohelcum

 

Белки Cas играют важнейшую роль на всех этапах работы этой защитной системы. Они обладают различными функциональными свойствами и ферментативной активностью. Так, белки Cas1 и Cas2, задействованные в большинстве систем CRISPR/Cas на этапе адаптации, формируют комплекс, где белки Cas1 функционируют как металлзависимые оцДНК/дцДНК-эндонуклеазы, которые вырезают фрагмент из вирусной ДНК и вносят разрывы в локус CRISPR, а также как интегразы, которые встраивают новый спейсер в бактериальный геном. Белки Cas2 обладают рибонуклеазной (РНКаза, специфичная к U-богатым участкам) или дезоксирибонуклеазной (дцДНКаза) активностью в зависимости от системы, к которой принадлежат, и играют структурную роль. Белок Csn системы CRISPR/Cas класса 2 (тип 2) участвует во встраивании новых спейсеров. Белки Cas3–Cas10, Cas12 и Cas13 являются компонентами эффекторного комплекса и участвуют в интерференции. Так, белки Cas3' содержат хеликазный домен и обладают хеликазной активностью, благодаря чему расплетают двойную спираль ДНК-мишени, а также имеют нуклеазный домен (HD-домен), который разрезает оцДНК-мишень. Белки Cas3'' – это металлзависимые дцДНК-эндонуклеазы, а белки Cas4 – нуклеазы с трехцистеиновым C-концевым кластером, обладающие 5'-экзонуклеазной активностью (оцДНКаза). Рибонуклеазы Cas5 и Cas6 участвуют в процессинге пре-crРНК, Cas7 участвует в связывании crРНК, а Cas8 – в узнавании PAM. Нуклеазы Cas9 (дцДНК-эндонуклеазы) и Cas12 (оцДНК/дцДНК-эндонуклеазы) участвуют в разрезании ДНК-мишени, а Cas13 расщепляют оцРНК. Cas10 содержат Palm-домен (РНК-распознающий домен) и обладают ДНКазной активностью.

Для создания мутантных животных наиболее широко используется система CRISPR/Cas9 второго класса подтипа II-A Streptococcus pyogenes (SpCas9), поскольку она относительно просто устроена и хорошо изучена [2]. Для адресации Cas9 на целевой участок генома в некоторых исследованиях используют гРНК с отдельными компонентами crРНК и tracrРНК. Этот вариант хорош, когда необходимо одновременно использовать множество различных crРНК, сочетаемых с одной tracrРНК. Для единичного разрезания более удобно использовать единую гидовую РНК (eгРНК), где специально разработанная короткая последовательность crРНК связана линкерной петлей (тетрапетля) с каркасной последовательностью tracrРНК (рис. 1) [3]. В итоге eгРНК стала наиболее популярным форматом направляющих РНК, поэтому термины егРНК и гРНК часто применяют в сообществе CRISPR в одном и том же значении.

 

Рис. 1. Варианты гидовой РНК.

 

Для более эффективного использования и повышения стабильности по отношению к нуклеазной деградации crРНК и tracrРНК модифицируют, включая в их структуру неприродные фрагменты. Так, в обзоре Филипповой и соавт. подробно описаны стратегии создания искусственных гРНК, содержащих модифицированный углеводофосфатный остов, нативные структурные мотивы и метки для визуализации. Описаны различные подходы к улучшению функции синтетической гРНК [4]. Отмечается, что химические модификации компонентов гРНК могут повышать ее устойчивость к гидролизу, изменять термодинамическую стабильность комплексов РНК-белок и РНК-ДНК, снижать иммуногенный и цитотоксический эффекты. В целом, можно проводить широкомасштабные химические модификации, изменяя около 70% нуклеотидов, при этом избегая модификации 2'-OH и фосфатных групп в eгРНК, которые взаимодействуют с белком Cas9. Продемонстрировано, что химически модифицированные направляющие РНК сохраняют в среднем высокую специфичность [5, 6]. При этом неудачный дизайн cгРНК может привести к более низкой специфичности и более высокому проценту нецелевых мутаций. Так, например, удаление с 5'-конца cгРНК 2–3 нуклеотидов значительно снижает количество нецелевых мутаций при сохранении эффективности, но если eгРНК укоротить до 16 нуклеотидов или менее, то ее активность резко падает, как и при удалении с 3'-конца или добавлении на 5'-конец динуклеотида GG [7]. Для конструирования оптимальной структуры cгРНК используют различные вычислительные инструменты, такие как CRISPR-P 2.0, E-CRISP и CasFinder [8]. Таким образом, оптимальный дизайн направляющей РНК является ключом к CRISPR/Cas-опосредованному точному редактированию генома.

Впервые систему CRISPR/Cas9 применили в 2013 году для локального редактирования генома в клетках млекопитающих. В настоящее время с использованием CRISPR/Cas9 создают животные модели с точечными мутациями в геноме, вставками или делециями нескольких нуклеотидов без добавления иных генетических элементов вблизи места редактирования, например, маркеров для селекции клеток по чувствительности к препарату в культуральной среде и рекомбинантных элементов, таких как loxP- или FRT-сайты [9]. Внедрение системы CRISPR/Cas9 позволило получать мутантных мышей на генетическом фоне, недоступном для редактирования генома с использованием более ранних подходов, например, иммунодефицитной линии NOD/Scid-ILgamma (NSG) [10]. Также CRISPR/Cas9 была адаптирована для биаллельного редактирования в разных локусах и создания мышей с мутациями в двух генах [11–14]. Прямое сравнение системы редактирования генома CRISPR/Cas с предыдущими платформами, такими как ZFN (введение двухцепочечных разрывов (ДЦР) в ДНК с помощью нуклеаз с мотивом цинковых пальцев), TALEN (введение разрывов с использованием нуклеаз TALE (transcription activator-like effector nucleases)) (рис. 2) и методами направленной модификации генома с помощью эмбриональных стволовых клеток (ES), ясно показывает, что CRISPR/Cas обладает рядом преимуществ, таких как более высокая эффективность, простота использования, относительно низкая стоимость, компактность и ряд других [9].

 

Рис. 2. Технологии редактирования генома ZFN, TALEN, CRISPR/Cas. ZFN – сайт-специфическое расщепление ДНК химерной ZF-нуклеазой, сконструированной на основе ДНК-связывающего домена типа “цинковых пальцев” (30 а. к., взаимодействующих с триплетом нуклеотидов в ДНК) и каталитического домена эндонуклеазы рестрикции FokI. TALEN – расщепление ДНК химерной нуклеазой TALE, сконструированной путем присоединения к ДНК-узнающим белкам TALE каталитического домена эндонуклеазы FokI; один мономер ДНК-связывающего домена TALEN (34 а. к.) узнает один нуклеотид целевой последовательности ДНК. CRISPR/Cas – узнавание целевой последовательности ДНК происходит с помощью гРНК, состоящей из направляющей и трансактивирующей РНК (либо с помощью егРНК, в которой направляющая и трансактивирующая РНК связаны линкером), а расщепление – нуклеазой Cas. PAM – короткий NGG-мотив, необходимый для связывания Cas и внесения разрывов в ДНК. Репарация ДНК проходит по одному из двух путей: негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологичной рекомбинации (HDR) с участием донорной ДНК-матрицы. В результате репарации разрывов в ДНК происходит нокаут определенного гена (Knockout) или встраивание в геном целевой генетической конструкции (Knock-in). тр.ак. crРНК ‒ трансактивирующая crРНК.

 

Высокая эффективность SpCas9 позволила идентифицировать потенциально важные гены с помощью полногеномного функционального скрининга. Так, используя лентивирусные гРНК для генерации большого количества клеток с нокаутом, после проведения положительной и отрицательной селекции можно идентифицировать важные гены и мишени для лекарственных средств [15–17].

Метод SpCas9 проявил себя мощным и универсальным инструментом генной инженерии, совершившим революцию в биологических и биомедицинских исследованиях, однако он имеет ряд ограничений. Так, иногда могут образовываться нежелательные ДЦР в нецелевом геномном локусе [18]. Специфичность расщепления ДНК определяется структурой Cas9, комплементарностью гРНК к ДНК и наличием последовательности PAM, прилегающей к целевой последовательности (рис. 3). Однако в процессе гибридизации возможно несовпадение нуклеотидов между гРНК и ДНК [19] или ограничения в доступности и распознавании сайтов PAM, так как SpCas9 может узнавать последовательности PAM, отличные от 5′-NGG-3'. Эффективность расщепления в этом случае становится значительно ниже (как, например, в случае 5'-NAG-3') [20]. Другим фактором может стать количество ошибок при спаривании оснований, когда при возникновении двух и более ошибок активность эндонуклеазы падает [21]. После возникновения незапланированных ДЦР могут появиться случайные мутации, обусловленные запуском подверженного ошибкам пути репарации ДНК – негомологичного соединения концов (NHEJ) [22]. Эти нежелательные нецелевые ДЦР также могут привести к аномалиям хромосомного масштаба [23]. Так, при работе с Cas9 непреднамеренно возникали крупные делеции (тысячи пар нуклеотидов), нацеленные на различные локусы в разных хромосомах, которые вызывают большую интерстициальную “потерю гетерозиготности” [24–26]. Самое опасное, что такие непредвиденные большие делеции трудно обнаружить с помощью классических методов скрининга. Описаны случаи обнаружения делеции в 5.2 т. п. н. с помощью количественной ПЦР и флуоресцентной гибридизации in situ [25] и от 100 п. н. до 9.5 т. п. н. – с помощью ПЦР длинных фрагментов [27].

К недостаткам SpCas9 относится его большой размер, что ограничивает выбор вирусных векторов для доставки. Так, емкость аденоассоциированных вирусов (AAB) равна приблизительно 4.7 т. п. н., тогда как SpCas9 вместе с гРНК занимает около 4.2 т. п. н. [28]. Клиническое применение технологии сдерживается ее иммуногенностью, отсутствием безопасной и эффективной системы доставки, нецелевыми разрезаниями и этическими проблемами [29].

Для решения обозначенных проблем разработаны усовершенствованные системы и технологии.

Во-первых, сконструирована серия высокоточных вариантов SpCas9 (eSpCas9 1.0 & 1.1, SpCas9-HF1, HypaCas9, Sniper-Cas9, SpG-HF1, SpRY-HF1, HiFi-iSpyMac), а также вариантов, способных распознавать широкий спектр последовательностей PAM (SpCas9-EQR/VQR/ VRER/ VRQR/ NRRH/ NRCH/ NRTH, xCas9 [30]). Во-вторых, в качестве альтернативы SpCas9 можно использовать нуклеазы Cas9 Staphylococcus aureus (SaCas9) и Campylobacter jejuni (CjCas9), которые имеют пониженную нецелевую нуклеазную активность, поскольку распознают более длинные последовательности PAM, 5'-NNGRRT-3 'и 5'-NNNVRYAC-3', соответственно [31, 32], или варианты Cas10 и Cas14, которым вообще не требуется последовательность PAM [33]. Мутантный вариант Acidaminococcus sp. BV3L6 Cas12a (AsCas12a) – E174R/S542R/K548R распознает различные PAM, включая 5'-TTYN-3', 5'-VTTV-3' и 5'-TRTV-3', а другие мутанты AsCas12a – RR и RVR, распознают TYCV и 5'-TATV-3' PAM соответственно [34]. Кроме того, мутации G532R/K595R были введены в Lachnospiraceae bacterium ND Cas12a (LbCas12a) для создания варианта LbCas12a-RR, который распознает 5'-TYCV-3' PAM, расширяя область нацеливания [35]. В-третьих, во избежание появления хромосомных транслокаций, нецелевых и неконтролируемых мутаций, образующихся в результате ДЦР (см. выше), разработаны дополнительные инструменты редактирования генов, в которых не происходит образования ДЦР. Так, инактивация одного из нуклеазных доменов Cas9 (как расщепляющего цепь, на которую направлена гРНК, так и расщепляющего нецелевую цепь ДНК), приводит к образованию никазы Cas9 (nCas9), осуществляющей только одноцепочечный разрыв (ОЦР) ДНК [3, 36]. Инактивация обоих нуклеазных доменов приводит к образованию каталитически полностью неактивной формы Cas9 (dead Cas9, или dCas9) [37]. Белки nCas9 и dCas9 составляют строительные блоки редакторов в усовершенствованных технологиях редактирования CRISPR/Cas: редактирования оснований и праймированного редактирования. В последующих поколениях генетических редакторов белок dCas был объединен с белками-регуляторами транскрипции или ферментами, модифицирующими хроматин, чтобы регулировать только уровень транскрипции без необратимого изменения генома. Это привело к созданию систем интерференции (CRISPRi) и активации (CRISPRa). Так, в системах CRISPRi репрессор KRAB (Krüppel-associated box), объединенный с dCas9, взаимодействует с комплексами, образующими гетерохроматин. Эти комплексы могут индуцировать метилирование и деацетилирование гистонов и, как следствие, ингибирование связывания РНК-полимераз с энхансерными или промоторными областями и инактивацию транскрипции [38]. Напротив, системы CRISPRa активируют транскрипцию с помощью доменов активации VP16 или более эффективных in vivo VP64 и VP192 путем взаимодействия с ТАТА-связывающим белком, транскрипционным фактором TFIIB и гистон-ацетилазой SAGA [39, 40]. Технологии CRISPRi и CRISPRa представляют интерес для проведения генетического скрининга, иммунотерапии опухолей и перепрограммирования плюрипотентных стволовых клеток [41–43].

Получить устойчивую наследуемую модификацию метилирования ДНК, подавляющую транскрипцию генов, можно с помощью временной экспрессии эпигенетического редактора CRISPRoff, созданного путем слияния dCas9 с KRAB и ДНК-(цитозин-5)-метилтрансферазой 3A (DNMT3A). Ранее было показано, что комплекс dCas9-DNMT3A может индуцировать сайт-специфическое метилирование CpG, приводящее к сайленсингу транскрипции. CRISPRoff может найти применение в скрининге генома, клеточной инженерии, подавлении энхансеров и генетическом механизме эпигенетической модификации [44].

Уменьшить нецелевые эффекты CRISPR/Cas9 можно также путем снижения чрезмерной и длительной экспрессии этой системы. С этой целью используют механизм, защищающий фаги от CRISPR/Cas-опосредованного иммунитета бактерий, а именно, белки Acr, нацеленные на нуклеазы Cas. В общей сложности идентифицировано 44 белка Acr для CRISPR/Cas типа I, II и V, но не для подтипа II-B и типа VI [45]. Известны три механизма Acr-опосредованного ингибирования: подавление связывания Cas9 с ДНК, воздействие на связывание Cas9 с гРНК и блокирование активности Cas9 [46, 47]. В настоящее время для снижения нецелевых эффектов используют только AcrIIA2 и AcrIIA4. Конкурируя с сайтом PAM и/или другими участками ДНК за Cas9, белки Acr блокируют расщепляющую активность Cas9, предотвращая чрезмерную и длительную активацию CRISPR/Cas9, и уменьшают таким образом нецелевые эффекты [48].

Решить проблемы, связанные с большим размером нуклеазы SpCas9, можно, используя ее ортологи меньшего размера, которые легче упаковать в вирусные векторы. Однако в этом случае необходимо учитывать архитектуру нуклеаз, разнообразие необходимых последовательностей PAM и относительную эффективность редактирования. Так, белки CjCas9 размером 2.95 т. п. н., SaCas9 (3.16 т. п. н.), CasX/Cas12e (2.94 т. п. н.), Cas14 (2.85 т. п. н.), Cas13d (2.79 т. п. н.) и даже более крупный белок Cas12a размером 3.6–3.9 т. п. н. можно упаковать в аденоассоциированные вирусные векторы [49–52].

Значительные успехи в применении системы CRISPR/Cas9 дали толчок к изучению других систем CRISPR/Cas для достижения потенциально более высокой эффективности редактирования и новых приложений.

 

Рис. 3. Организация систем CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12 и CRISPR/Cas13. Стрелками обозначены места одноцепочечных разрывов ДНК каталитическими доменами RuvC и HNH (Cas9 и Cas12) и места разрыва РНК белком HEPN (Cas13).

 

К наиболее хорошо изученным, после Cas9, относятся белки Cas12 и Cas13 (рис. 3). Cas12 представляет собой эффекторный белок класса 2 типа V. У этого белка отсутствует каталитический домен HNH, вместо него для индукции расположенных в шахматном порядке “ступенчатых” разрывов с липкими концами за пределами сайта PAM используется домен RuvC-подобной нуклеазы, тогда как Cas9 имеет оба домена и создает разрезы с тупыми концами в области PAM. Показано, что Cas12 успешно распознает дцДНК (Cas12a/Cpf1) и может расщеплять оцДНК (Cas12f/Cas14). Кроме того, Cas12 регулируется единственной относительно компактной crРНК и не нуждается в tracrРНК. Cas12 удобно использовать для мультиплексного редактирования, поскольку она обладает активностью РНКазы III (катализирующий процессинг пре-crРНК в зрелые crРНК), что позволяет получать множество crРНК из единого предшественника. В отличие от Cas9, нуклеаза Cas12 может расщеплять целевую последовательность (цис-расщепление), а также активировать свою способность расщеплять нецелевые последовательности (транс- или коллатеральное расщепление) [53]. Благодаря транс-расщепляющей активности, Cas12 можно использовать для обнаружения нуклеиновых кислот [54]. Белок Cas12 был перепрофилирован в нацеленный на ДНК-эндонуклеазу CRISPR трансрепортер (DETECTR), способный обнаруживать присутствие оцДНК. Эта технология применима для детекции ДНК-вирусов в клинических образцах [53]. Известно множество вариантов семейства Cas12: Cas12a (Cpf1), Cas12b, Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12f (Cas14), Cas12j (CasF), Cas12h, Cas12i и Cas12c [33]. Эффективность наиболее известного из них, Cas12a, сравнима с эффективностью SpCas9, однако широкого применения в клетках млекопитающих этот вариант не нашел, в основном из-за строгой потребности в последовательности смежного мотива протоспейсера TTTV (PAM). Напротив, его ортолог Mb3Cas12a (Moraxella bovoculi AAX11_00205) может эффективно редактировать геном мыши (последовательность TTV PAM). Более того, использование Mb3Cas12a, меченного мономерным стрептавидином, в сочетании с биотинилированной донорной ДНК-матрицей для HDR приводит в 40% случаев к рождению мышей F0 с нужной отредактированной последовательностью [55]. Недавно при реконструкции эволюции эндонуклеаз Cas9 и Cas12 как в прокариотических, так и в эукариотических клетках обнаружили семейство кодируемых транспозонами РНК-управляемых систем, названных OMEGA. Хотя эти программируемые нуклеазы, включая IscB, IsrB и TnpB, имеют большие перспективы для нацеливания и редактирования генома, их активность и биологическая значимость до сих пор не полностью охарактеризованы [56].

Cas13 представляет собой белок класса II и типа VI. Члены семейства CRISPR/Cas13 работают как двухкомпонентные системы, в которых crРНК без участия tracrРНК образует комплекс с белком Cas13, состоящим из двух нуклеотидсвязывающих доменов HEPN. Каждый из этих доменов содержит сайт расщепления РНК. Для Cas13, также как для Cas9 и Cas12, требуются фланкирующие последовательности протоспейсеров (PFS), которые действуют аналогично PAM Cas9 и, следовательно, необходимы для расщепления РНК. Недавно обнаружили, что PFS нужны не для всех систем типа VI–Cas13 (например, для Cas13d (930 а. к.)), что обеспечивает большую гибкость для нацеливания и расщепления любой последовательности нуклеиновых кислот. Кроме того, Cas13 – единственная известная прокариотическая система CRISPR/Cas, нацеленная на одиночную РНК, т. е. нуклеаза Cas13, обладая уникальной двойной РНКазной активностью, способна катализировать HEPN-независимый процессинг пре-crРНК в зрелую crРНК и производить HEPN-зависимое расщепление РНК [33, 51]. Cas13 также можно перепрофилировать в редактор оснований РНК. Так, каталитически неактивный ортолог Cas13 из Prevotella sp. (dPspCas13b) был объединен с дезаминазой ADAR2 для разработки редактора REPAIR, который может преобразовать A→I в РНК. В процессе трансляции и сплайсинга инозин читается как гуанин, поэтому инструмент REPAIR может восстанавливать патогенные мутации G→A. Впоследствии получили систему RESCUE, которая не только сохраняет исходную активность дезаминазы A→I, но также осуществляет переход C→U. Эффективность редактирования и специфичность редакторов оснований РНК пока невысоки, поэтому необходимы дальнейшие исследования [57, 58]. Как уже упоминалось, существуют различные варианты Cas13 (Cas13a (1250 а. к.), Cas13b (1150 а. к.), Cas13d (930 а. к.)), одним из самых перспективных из которых считается Cas13d (CasRx). Cas13d имеет ряд преимуществ, особенно при работе с млекопитающими, в том числе:

1. небольшой размер, подходящий для упаковки в вирусные векторы;
2. низкая нейротоксичность;
3. двойная нуклеазная активность;
4. для расщепления РНК не требуется фланкирующая последовательность протоспейсера;
5. значимо низкая нецелевая активность, более высокая эффективность и специфичность в расщеплении целевой РНК.

Характеристики Cas13d делают его важным кандидатом для пространственно-временной инженерии транскриптома, обнаружения нуклеиновых кислот, мультиплексной регуляции генов, посттранскрипционного сайленсинга генов, альтернативного сплайсинга, отслеживания и эпигенетической регуляции РНК [51].

РАЗРЫВЫ ДНК

Клеточная ДНК постоянно подвергается многочисленным спонтанным повреждениям (до 10⁵ на клетку ежедневно), потенциально нарушающим стабильность генома, провоцирующим хромосомные перестройки, дестабилизирующим структуру и функции генов и приводящим к развитию патологических состояний [59–61]. Известны различные виды повреждений ДНК, включая модификации гетероциклических оснований и углеводофосфатного остова, разрыв N-гликозидных связей, образование ковалентных связей между цепями ДНК, а также между ДНК и белками (например, гистонами). Наиболее радикальными среди них являются ДЦР. В этом случае оба конца ДНК оказываются топологически разделенными, что может вызвать изменения кариотипа. Разрывы ДНК занимают центральное место в важнейших биологических процессах, включая мейоз [62] и V(D)J-рекомбинацию, при которой гены, кодирующие компоненты антител, рекомбинируют с образованием огромного разнообразия конечных продуктов [63]. Целенаправленная индукция сайт-специфических расщеплений ДНК стала краеугольным камнем технологий редактирования генома. Так, нуклеазы Cas вносят различные разрывы, например, Cas9 может производить ДЦР с тупыми концами, Cas12a (Cpf1) – с “липкими’, а nCas9 вносит парные или одиночные ОЦР [64].

В свою очередь, клетки развили способность восстанавливать повреждения ДНК, инициируя сложный сигнальный ответ, который модулирует клеточный цикл, изменяет хроматиновое окружение и рекрутирует факторы репарации [64]. Считается, что оба варианта разрывов ДНК репарируются с использованием различных путей, хотя на практике граница между восстановлением ОЦР и ДЦР размыта, так как ОЦР могут превращаться в ДЦР, например, в результате прохождения репликативной вилки или когда два соседних ОЦР спонтанно образуют ДЦР с липкими концами [65].

Клетки млекопитающих используют два основных механизма репарации разрывов ДНК: NHEJ и репарацию с помощью HDR. Восстановление ДЦР на протяжении всего клеточного цикла происходит преимущественно путем NHEJ. Этот путь может приводить к мутациям, чаще всего к небольшим вставкам и/или делециям (InDel) размером 1–4 п. н. Однако при наличии гомологичной матрицы в виде сестринской хроматиды или искусственно добавленных донорных ДНК-матриц в поздней S-фазе и в фазе G2 запускается путь HDR. HDR может пойти по нескольким направлениям в зависимости от типа и размера матричной ДНК. Так, в присутствии донорной дцДНК-матрицы со средними плечами гомологии >200 п. н. репарация может осуществляться путем одноцепочечного отжига по прямым повторам (SSA, single strand annealing). При более длинных плечах (≥ 400 п. н.) восстановление пойдет по пути HDR, а если плечи гомологии равны примерно 30 н. и используется донорная оцДНК-матрица, то выбирается путь синтеззависимого отжига цепей (SDSA, synthesis-dependent strand annealing). Донорная дцДНК-матрица без плеч гомологии может быть встроена в место ДЦР ДНК путем гомологичной независимой целевой интеграции – этот путь обозначен как HITI (Homology-Independent Targeted Integration). Альтернативным путем репарации является путь микрогомологичного соединения концов (MMEJ), который имеет сходство как с NHEJ, так и с HDR. Подобно NHEJ, MMEJ активен в большинстве стадий клеточного цикла, однако, как и HDR, нуждается в первоначальной резекции концов ДЦР, при этом используются чрезвычайно короткие плечи гомологии – 5–40 п. н. (рис. 4) [66].

 

Рис. 4. Репарация разрывов ДНК. Приведены пути репарации HDR, NHEJ, MMEJ, проходящие с участием белковых факторов и ферментов нуклеинового обмена (указаны рядом со стрелками, указывающими направление пути репарации), и соответствующие донорные ДНК-матрицы.

 

Понимание детерминант, которые направляют восстановление Cas-индуцированного разрезания ДНК по определенному пути репарации, имеет решающее значение для прогнозирования и контроля результата редактирования генома; на эффективность этого процесса влияет также регуляция ключевых факторов конкурирующих путей репарации ДНК.

ИНГИБИТОРЫ NHEJ

Выбор пути репарации ДЦР ДНК может иметь принципиальное значение при создании трансгенных животных. Пути NHEJ и HDR – это конкурирующие пути репарации Cas9-индуцируемых ДЦР. При этом NHEJ является основным путем восстановления ДЦР в клетках млекопитающих, поскольку HDR зависит от фаз клеточного цикла и наличия эндогенных матриц. Если необходимо только нарушить функцию гена, “сбив” рамку считывания, то путь NHEJ считается оптимальным, однако, если требуется внести точные правки в целевые участки гена, то необходимо задействовать путь HDR. В этом случае нужно искусственно сместить баланс в сторону HDR. Самым очевидным решением становится подавление пути NHEJ. Известно несколько регуляторов ключевых факторов NHEJ. Сравним их эффективность, достоинства и недостатки.

 

Рис. 5. Схема активации каскада 53BP1-PTIP-RIF1-Шелдин-CST. Стрелками обозначена последовательность этапов активации, в прямоугольных вставках приведено их описание. Вверху справа приведены сведения о роли белка BRCA1, вовлеченного в процесс HDR, на разных фазах клеточного цикла.

 

В основе пути NHEJ лежит механизм прямого лигирования разъединенных концов ДНК независимо от степени гомологии между нуклеотидными последовательностями. На данном этапе подавить NHEJ можно с помощью регуляции каскада (комплекса) хроматинсвязывающего белка 53BP1 с белками-эффекторами RIF1, Шелдин и CST, участвующими в репарации ДЦР (53BP1–PTIP/RIF1–Шелдин-CST). Этот комплекс ингибирует резекцию концов ДНК в фазе G1 клеточного цикла (рис. 5). Ключевым фактором каскада является белок 53BP1; вычленяя его из процесса репарации, можно подавить NHEJ-путь. Существуют два подхода к контролю 53BP1. Один из них заключается в подавлении его рекрутирования в ДЦР. Так, Е3 убиквитин-протеин-лигаза RAD18 связывает убиквитинированный гистон H2AK15Ub с большей аффинностью, чем белок 53BP1, тем самым ингибируя рекрутирование 53BP1 в ДЦР. Аналогичным образом белок DN1S, доминантно-негативный мутант 53BP1, конкурирует с эндогенным 53BP1 или вытесняет его, уменьшая привлечение эффекторов NHEJ [67–69]. Другой подход предполагает удаление 53BP1 из участка ДЦР, например, полиубиквитинированием 53BP1, опосредованным убиквитинлигазой E3 SPOP [70].

На следующем этапе пути NHEJ гетеродимеры белка Ku70/Ku80 (ДНК-связывающий компонент ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК, Ku) распознают концы ДЦР и связываются с ними, защищая свободные концы ДНК в месте разрыва и предотвращая резекцию 5'-конца. Комплекс Ku70/Ku80 рекрутирует и активирует ДНК-зависимую каталитическую субъединицу, активность которой необходима для реализации пути NHEJ. Несмотря на решающую роль субъединиц Ku на ранних этапах пути NHEJ, разработано ограниченное количество ингибиторов Ku70/80, а их эффективность дает неоднозначные результаты. Так, использование Ku-специфической малой интерферирующей РНК (siРНК) подавляло Ku70/Ku80 и в 2 раза увеличивало CRISPR/Cas9-опосредованную эффективность HDR в фибробластах свиньи [71]. Многообещающие результаты получены с использованием низкомолекулярных ингибиторов Ku70/80. Показано, что использование арилалкиловых эфиров производных арилпиразолонкарбоновой кислоты уменьшало связывание Ku до 50% [72], а замена сложноэфирной связи на амидную приводила к четырехкратному увеличению способности подавлять связывание Ku-ДНК. В результате дальнейших модификаций этих соединений создан отдельный класс ингибиторов Ku-DBi – высокоэффективных и специфичных ингибиторов связывания Ku-ДНК, которые напрямую взаимодействовали с Ku и подавляли NHEJ [73]. Ингибирование Ku70 и Ku80 с помощью CRISPR значительно повышало эффективность HDR [74]. Так, активация системы CRISPRi (CRISPR interference) приводила к увеличению эффективности HDR в 1.85 раза при ингибировании Ku70 и в 1.58 раза в случае Ku80 [75]. Вместе с тем, в некоторых исследованиях показано, что подавление Ku не влияет на эффективность HDR [76], а также может приводить к снижению эффективности обоих путей репарации ДНК [77].

Интересно отметить, что ингибирование Ku не всегда может сместить равновесие в сторону HDR. Например, в качестве ингибитора гетеродимеров Ku70/Ku80 предложено низкомолекулярное соединение L – STL127705, идентифицированное с помощью скрининга библиотеки in silico [78]. Хотя нет отчетов о проверке влияния непосредственно этого ингибитора на эффективность HDR, изучение его 4-фторфенильного аналога STL127685 не влияло на снижение эффективности пути NHEJ или увеличение эффективности HDR [79].

Низкомолекулярные ингибиторы комплекса Ku70/Ku80 устраняют до 90% активности холофермента ДНК-ПК, содержащего помимо ДНК-связывающего комплекса Ku70/Ku80 еще и каталитическую субъединицу [72]. Каталитическая субъединица ДНК-ПК отвечает за распознавание ДЦР, фосфорилирование компонента X семейства гистонов H2A (H2AX) и рекрутирование/активацию механизма репарации для индукции пути NHEJ [80]. Обработка клеток HEK293T ингибиторами ДНК-ПК NU7441 (или KU57788) и KU-0060648 приводила к двукратному увеличению эффективности HDR [81], в эмбрионах рыбок Danio rerio соединение NU7441 увеличивало эффективность HDR в 13.4 раза [82]. Эти данные согласуются с результатами, полученными на плюрипотентных стволовых клетках, где еще один ингибитор ДНК-ПК, NU7026, повышал эффективность интеграции донорных олигонуклеотидов примерно в 1.6 раза [79]. Более мощным ингибитором ДНК-ПК считается M3814, его активность вызывает увеличение HDR в 4 раза и позволяет проводить редактирование нескольких локусов одновременно [83]. Комбинация нескольких ингибиторов может иметь синергический эффект. Например, ингибитор M3814 в сочетании с трихостатином A в 3 раза снижал эффективность NHEJ [84], а в сочетании с линеаризацией донорной плазмиды и транзиентного нокдауна ДНК-полимеразы θ (метод BiPoD) почти полностью подавлял NHEJ/MMEJ и обеспечивал создание биаллельных knock-in в эмбриональных стволовых клетках мышей [13].

ДНК-ПК фосфорилирует множество субстратов, включая Artemis, XRCC4, ДНК-лигазу IV и XLF, что способствует удержанию концов ДЦР ДНК и облегчает рекрутирование ферментов процессинга и лигирования.

Использование ингибиторов ДНК-лигазы IV, играющей важную роль в лигировании концов ДЦР в процессе NHEJ, крайне актуально для подавления этого пути и смещения равновесия в сторону HDR. Наиболее хорошо охарактеризованным ингибитором ДНК-лигазы IV является низкомолекулярное производное дигидроптерина – соединение SCR7, механизм действия которого подробно рассмотрен в работах [85, 86]. Отмечено, что совместная инъекция компонентов CRISPR/Cas9 и SCR7 в зиготы повышает эффективность HDR-опосредованного инсерционного мутагенеза, что приводит к появлению мышей со вставками в нескольких локусах. Применение SCR7 смещает баланс в сторону HDR в 10 раз в эмбрионах мышей и на 46% у крыс, а также в широком диапазоне клеточных линий, включая клетки рака легкого, молочной железы, толстой кишки, меланомы, и первичные фибробласты. В случае вставок длинных фрагментов ДНК использование SCR7 повышает результативность до 13 раз, а с короткими вставками – до 19 раз [76]. Комбинация SCR7 с другими факторами может значительно повысить эффективность пути HDR, например, при использовании Rad52 до 40% [87], а при совместной инъекции с компонентами CRISPR/Cas9 в зиготы можно получить вставки в нескольких локусах [88]. Показано, что применение SCR7 увеличивает результативность стратегии повышения эффективности HDR до 30 раз [89]. Однако вопрос о роли SCR7 в повышении эффективности HDR за счет снижения эффективности NHEJ остается спорным. В целом, активность SCR7, по-видимому, является ткане- и организмспецифичной. Об этом свидетельствуют сообщения о слабом влиянии SCR7 на подавление NHEJ или усиление HDR в локусах ROSA26-like (RLL) генома кролика [90], MALAT1 клеток HEK293T [91], pROSA26 в эмбриональных фибробластах свиньи [92], при обработке линии эмбриональных стволовых клеток H1 [93], клеток U2OS DR-GFP [94], HSPC [95] и линии клеток миелогенного лейкоза K562 [96], при создании CRISPR/Cas12a-опосредованного нокаута в плюрипотентных стволовых клетках человека [97], а также в эмбрионах D. rerio [82]. Представлены и модифицированные варианты SCR7. Так, более стабильная циклическая форма SCR7 может быть дополнительно окислена до SCR7-пиразина с сохранением способности подавлять NHEJ [98]. Показано, что SCR7-пиразин увеличивает эффективность генетического редактирования на 50% в клетках MCF7 [99], но в создании нокаута в Xenopus это соединение было менее эффективным [100], что также свидетельствует о ткане- и видоспецифичности SCR7. Другая модификация SCR7, идентифицированная как SCR130, индуцирует апоптоз и обладает противоопухолевой активностью [101]. Блокировать активность ДНК-лигазы IV можно также путем shРНК-опосредованного (shРНК – образующая шпилечные структуры малая РНК) сайленсинга генов и совместной экспрессии системы Cas9 и белков E1B55K и E4orf6 аденовируса 4 вплоть до повышения эффективности HDR до 8 раз и практически полного подавления NHEJ в клеточных линиях человека и мыши [74].

Когда концы ДЦР невозможно напрямую лигировать с помощью комплексов XLF-XRCC4 и ДНК-лигазы IV (например, из-за выступающих фрагментов нескольких нуклеотидов), такие нуклеазы, как Artemis, полинуклеотидкиназа-3'-фосфатаза (PNKP) и ДНК-полимеразы (Polµ и Polλ) могут модифицировать места разрывов оцДНК-дцДНК с образованием совместимых тупых концов [85, 102].

Если не задействовать описанные механизмы подавления NHEJ, то на заключительном этапе этого пути лигирование выполняет комплекс XRCC4-ДНК-лигаза IV–XLF. Основания ДНК случайным образом добавляются и удаляются ДНК-полимеразами и нуклеазами, что приводит к образованию вставок, небольших по сравнению с исходной геномной матрицей, которая составляет основу подверженного ошибкам редактирования на основе NHEJ.

Повысить эффективность направленного редактирования генома можно не только с помощью ингибирования NHEJ, но и путем прямой активации HDR. Последнее может быть более безопасным для клеток, так как не приводит к их гибели из-за нерепарируемых разрывов ДНК.

РЕГУЛЯЦИЯ КЛЮЧЕВЫХ ФАКТОРОВ ПУТИ HDR

Репарация ДНК по пути HDR протекает значительно медленнее, чем по пути NHEJ. Этот процесс продолжается в течение 7 ч и более и приводит к резекции не менее 10³ нуклеотидов с 5'-конца от места разрыва с образованием 3'-выступающего конца ДНК. Концевая резекция – это важная часть механизмов MMEJ и HDR. Наличие участка оцДНК необходимо для гибридизации с комплементарной последовательностью матрицы для HDR, чтобы при удлинении этого конца ДНК-полимеразой можно было точно восстановить последовательность, утраченную, возможно, в месте разрыва.

Большинство вариантов пути HDR, таких как канонический путь, путь синтеззависимого отжига цепей (SDSA), путь индуцированного разрыва репликации (BIR) и одноцепочечного отжига по прямым повторам (SSA), протекают при наличии матрицы, и ДНК-трансфераза RAD51 опосредует поиск донорной ДНК-матрицы в процессе HDR. Так, сборка нуклеопротеиновых филаментов RAD51-оцДНК необходима для реализации путей HDR, SDSA и некоторых BIR, но путь SSA не зависит от RAD51 [103].

Недавно было показано, что компоненты пути анемии Фанкони (Fanconi Anemia, FA) – пути репарации межцепочечных сшивок в ДНК, участвуют и в репарации ДЦР ДНК. Анемия Фанкони – генетическое заболевание, вызываемое мутациями в генах, регулирующих зависимое от репликации удаление межцепочечных сшивок ДНК, характеризуется недостаточностью костного мозга и предрасположенностью к раку. Сигнальный путь FA координирует сложный механизм, в котором задействованы элементы трех классических путей репарации ДНК: HDR, эксцизионной репарации нуклеотидов и транслезионного синтеза ДНК. Для этого в пути FA используется уникальный ядерно-белковый комплекс, который убиквитинирует белки FANCD2 и FANCI, приводя к образованию структур репарации ДНК. В сигнальном пути FA задействованы 19 белков – от FANCA до FANCT, а также множество ассоциированных белков. Считают, что HDR является одним из этапов пути FA, в котором реализуется SSTR-путь рекомбинации с использованием олигонуклеотидных оцДНК-матриц (Single-Stranded Templated Repair). Белки FA – FANCD1 (BRCA2), FANCR (RAD51) и FANCD2, участвуют в инициации репарации ДЦР ДНК по механизму HDR. Изучение взаимодействия между FA и путями репарации ДЦР приводит к появлению все большего числа доказательств того, что FA не только участвует в репарации межцепочечных поперечных сшивок дцДНК, но также играет роль в ДЦР-опосредованном редактировании генома [104].

Как уже отмечено, основным шагом, который определяет выбор HDR в качестве пути репарации ДЦР, является 5'-3'-резекция конца ДНК с образованием 3'-выступающего одноцепочечного фрагмента. Этот процесс инициируется белковым комплексом MRN (MRX у дрожжей), состоящим из белков MRE11, RAD50 и NBS1, который имеет решающее значение для короткой концевой резекции [105]. Одной из стратегий, применяемых для смещения равновесия репарации разрывов ДНК в сторону HDR, стала разработка химерной конструкции Cas9 для привлечения комплекса MRN к участку ДЦР. В этой системе белок SpCas9 слит с доменом из 126 а. к. щелочной нуклеазы HSV-1 (UL12), который и рекрутирует комплекс MRN [106].

Неоднозначная ситуация наблюдается и с участием в выборе пути репарации ДНК белка PARP1, представителя семейства поли(ADP-рибозо)полимераз, участвующего в репарации повреждений ДНК и ремоделировании хроматина. С одной стороны, этот белок может способствовать привлечению комплекса MRN, что стимулирует пути MMEJ, SSA или HDR [107], однако PARP1 быстро рекрутируется в новые ДЦР и может ингибировать резекцию и привлекать Ku-комплекс, способствуя реализации пути NHEJ [108].

Установлено, что фосфорилированный фактор резекции CtIP и комплекс BRCA1-BARD1 стимулируют процесс резекции с помощью MRN, в ходе которого субъединица MRN NBS1 генерирует короткие выступающие концы [109, 110]. На данном этапе сместить равновесие в пользу HDR можно, используя нуклеазу Cas9, гибридизованную с HE, N-концевым фрагментом CtIP, за счет рекрутирования эндогенного CtIP в месте расщепления. Этот эффект показан на клеточных линиях человека, iPS-клетках и зиготах крыс. Его результативность зависела от сrРНК и варьировала в зависимости от локуса [111].

Короткие одноцепочечные фрагменты, генерируемые MRN, служат местом связывания таких ферментов, как экзонуклеаза 1 (EXO1), хеликаза Блума (BLM) и нуклеаза DNA2 [112]. EXO1 генерирует длинные 3'-одноцепочечные последовательности ДНК за счет своей процессирующей 5'-экзонуклеазной активности. Стимулировать резекцию с помощью EXO1 может гетеротримерный комплекс SOSS1, связывающий оцДНК [113]. Сам комплекс MRN также рекрутирует и усиливает процессивность EXO1, а хеликаза BLM увеличивает сродство EXO1 к местам разрыва ДНК [112]. Отмечено, что репликативный белок А (RPA) может как стимулировать, так и ингибировать активность EXO1 в зависимости от того, фосфорилирован он или нет [114]. Комплекс BLM/DNA2 обладает как 5'-, так и 3'-эндонуклеазной активностью: хеликаза BLM разделяет нити ДНК, позволяя нуклеазе DNA2 расщеплять оцДНК [112]. Хеликазная активность BLM увеличивается при взаимодействии с фактором резекции CtIP, который усиливает также DNA2-опосредованное расщепление ДНК [115]. RPA ингибирует 3'-эндонуклеазную активность DNA2, одновременно стимулируя ее 5'-эндонуклеазную активность, чтобы обеспечить 5'-3'-направление резекции [114]. Как уже упоминалось, регуляторный механизм 53BP1–PTIP/RIF1–Шелдин-CST ингибирует дальнюю резекцию концов (Long Range Resection), причем хроматинсвязывающий белок 53BP1 блокирует привлечение белка BRCA1 к ДЦР во время G1-фазы, в то время как белок BRCA1 предотвращает образование очагов 53BP1 и RIF1 в ДЦР во время фазы S/G2 [116]. Антагонистические отношения между BRCA1-BARD1 (BARD1 – белок, ассоциированный с BRCA1, BRCA1-associated RING domain protein 1) и 53BP1 могут быть связаны с двумя состояниями посттрансляционной модификации гистонов H2A и H4: убиквитинированием лизина-15 гистона H2A и метилированием лизина-20 гистона H4, что влияет на выбор пути репарации ДЦР [117]. Также RAD18, а именно его улучшенный вариант e18, подавляя локализацию 53BP1 в ДЦР, стимулирует CRISPR-опосредованную HDR, тем самым повышая эффективность точного редактирования генома [118].

Поскольку образующиеся одноцепочечные фрагменты ДНК очень нестабильны, они связываются с белком RPA, который защищает оцДНК от нуклеазной деградации и предотвращает образование вторичных структур. С помощью “посредников” рекомбинации, таких как белки BRCA1, BRCA2, а также партнера BRCA2 – белка PALB2, RPA вытесняется белком RAD51, который затем образует протяженные спиральные нуклеопротеиновые филаменты на оцДНК путем блокирования гидролиза АТР. RPA представляет собой барьер для сборки филаментов RAD51. В G2/S-фазе циклинзависимая киназа 1 (CDK1) фосфорилирует RAD51, что усиливает способность RAD51 конкурировать с RPA за оцДНК [119]. Установлено, что небольшая молекула RS-1, идентифицированная в результате скрининга библиотеки из 10 000 соединений, может усиливать ДНК-связывающую активность RAD51, что в несколько раз увеличивает эффективность Cas9-опосредованной HDR в клетках HEK293A, плюрипотентных стволовых клетках человека, в эмбрионах кроликов и D. rerio. После формирования нуклеопротеинового филамента RAD51-оцДНК происходит поиск комплементарной ДНК-матрицы для HDR. Инвазия 3'-выступающего конца ДНК в матрицу приводит к образованию D-петли, за которым следует удлинение 3'-выступающего конца ДНК с помощью ДНК-полимеразы δ. Способствовать инвазии ДНК может сверхэкспрессия дрожжевого RAD52 (yRAD52), но не его человеческого аналога, HDRAD52. Показано, что применение слитого белка yRAD52-Cas9 приводит к увеличению эффективности HDR в клетках разных организмов. Предполагается, что после образования D-петли процесс репарации может пойти тремя путями, в зависимости от того, образуются одна или две структуры Холлидея. Затем действует группа ферментов, называемых резольвазами, которые завершают процесс репарации и восстанавливают хромосому до ее неповрежденного состояния [68].

Скрининг около 4000 малых молекул выявил две небольшие молекулы, L755507 и брефельдин A, способных повысить эффективность HDR. Так, использование соединения L755507, агониста β3-адренергических рецепторов, приводило к увеличению эффективности вставки GFP в 3 раза по сравнению с контрольными клетками. Применение брефельдина A, ингибитора внутриклеточного транспорта белка из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, также приводило к повышению эффективности встраивания в 2 раза [120].

Следует отметить, что активность некоторых ключевых факторов, участвующих в HDR в клетках дрожжей и млекопитающих, регулируется с помощью высококонсервативного белка SUMO (небольшой белок примерно из 100 а. к.), способного регулировать активность того белка, к которому он присоединяется [121]. Как правило, сумоилирование положительно воздействует на концевую резекцию. Например, SUMO оказывает сильное влияние на функционирование CtIP [122] и способствует стабильности белка EXO1 в клетках млекопитающих [123]. Следовательно, можно предположить, что сумоилирование этих ключевых факторов может обеспечить более высокую эффективность HDR.

Из-за неравномерного распределения активности NHEJ и HDR по клеточному циклу, когда NHEJ активен на протяжении всего цикла, а HDR ограничена лишь поздней фазой G2 и S, когда происходит репликация ДНК перед делением клетки, ингибиторы клеточного цикла используют для повышения эффективности HDR, останавливая или задерживая клетки-мишени в фазах S или G2.

КОНТРОЛЬ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

Поскольку репарация разрывов в ДНК по пути HDR ограничена фазами S и G2 клеточного цикла, синхронизация клеток в этих фазах с помощью химических соединений может значительно повысить ее эффективность. Такими соединениями стали блокаторы G1/S: афидиколин, гидроксимочевина, мимозин и тимидин, повышающие вероятность восстановления ДНК по пути HDR в неонатальных фибробластах [124]. Нокодазол и ABT-751 останавливают клетки в фазе G2/M, ингибируя полимеризацию микротрубочек. Нокодазол способствует увеличению эффективности HDR в 1.38 раза в клетках HEK293T [124], а ABT-751 увеличивает в 6 раз эффективность редактирования генома в линиях стволовых клеток человека [93]. Некоторые блокаторы M/G1 не всегда показывают высокие результаты в стимуляции HDR, как например, ловастатин в неонатальных фибробластах [124]. Недавно было показано, что низкомолекулярное соединение XL413, ингибитор киназы CDC7, участвующей в инициации репликации ДНК, замедляет S-фазу, удлиняя фазы S/G2/M, и увеличивает эффективность HDR до 3.5 раз [96]. Тиазольное производное хинона, соединение RO-3306, может временно останавливать переход от фазы G2 к фазе M путем ингибирования функции циклинзависимой киназы (CDK1), увеличивая количество клеток в фазах S и G2 [125]. Соединение RO-3306, ингибитор CDK1, применяемое в сочетании с белком Cas9, нуклеазная активность которого снижена в фазе G1, может улучшить соотношение путей HDR/NHEJ в 20 раз в пользу HDR [126]. Вместе с тем, эффекты блокаторов клеточного цикла зависят от типа клеток-мишеней и могут иметь ограничения для использования in vivo из-за потенциальной токсичности. Зависимая от фазы клеточного цикла экспрессия Cas9 может быть дополнительным подходом к синхронизации образования ДЦР с фазами клеточного цикла. Стратегия контроля экспрессии Cas9 в фазах S и G2 основана на создании комплекса Cas9-hGem (Cas9-геминин). Слияние первых 110 а. к. геминина с Cas9 приводит к протеолитической деструкции такого гибридного белка, вызванной APC/CDH1-опосредованным убиквитинированием в поздних фазах M и G1, и в итоге увеличивает эффективность HDR до 87% в клетках HEK293T [91]. Эффективность этого подхода подтверждена на плюрипотентных стволовых клетках человека и фибробластах свиньи, что делает его многообещающим инструментом для повышения эффективности HDR [127, 128]. Кроме того, существуют непрямые методы замедления клеточного цикла. Так, например, инкубация эмбрионов D. rerio на льду увеличивает результативность HDR в 1.5 раза [82].

СТАТУС ХРОМАТИНА

Статус хроматина, его компоненты и структура значительно влияют на выбор пути репарации ДЦР, однако детальные механизмы этого процесса остаются неясными. Система CRISPR-Cas функционирует в различных хромосомных контекстах, таких как эухроматин или гетерохроматин.

Фундаментальной единицей хроматина является нуклеосома, состоящая из двух копий каждого корового гистона (H3, H4, H2A и H2B), обернутых 147 парами оснований ДНК. Неструктурированные концевые области коровых гистонов подвергаются множеству различных посттрансляционных модификаций, среди которых наиболее хорошо изучены фосфорилирование, метилирование, ацетилирование и убиквитинирование. Посттрансляционные модификации гистонов, а также метилирование ДНК помогают сформировать эухроматин и гетерохроматин. Эухроматин соответствует открытому состоянию хроматина, он связан с активной транскрипцией и обогащен метилированными (например, H3K4me3, H3K36me3) и ацетилироваными гистонами. Напротив, гетерохроматин более компактен, менее доступен для аппарата транскрипции и обогащен репрессивными гистоновыми посттрансляционными модификациями и, таким образом, транскрипционно неактивен. Гетерохроматин разделяют на факультативный, конститутивный и центромерный. Последний включает вариант гистона H3, CENP-A, который эпигенетически определяет расположение центромер и перемежается с активными гистоновыми посттрансляционными модификациями H3K4me3, H3K36me3, но лишен репрессивного H3K9me3, характерного для конститутивного гетерохроматина [129, 130].

Установлено, что триметилирование остатка лизина-36 гистона H3 (H3K36me3) играет критическую роль в репарации ДНК по пути HDR в эухроматине [130]. Триметилированный гистон H3K36me3 обнаружен также в участках, которые репарируются по пути NHEJ [131]. Установлено, что содержание аналогичного гистона, содержащего диметилированный лизин-36 (H3K36me2), снижено в ДЦР, которые репарируются по пути HDR, и характерно для ДЦР, которые репарируются по пути NHEJ [130]. Модифицированный гистон H3, содержащий диметилированный остаток лизина-4 (H3K4me2) в центромерах, способствует репарации по пути HDR в фазе G1 клеточного цикла [132], триметилирование лизина-9 гистона H3 (H3K9me3) также способствует восстановлению разрывов в ДНК по пути HDR и уменьшает эффективность репарации по пути NHEJ.

В среднем для гетерохроматина более характерны пути репарации HDR и MMEJ. Так, использование системы KRAB (Krüppel-associated box), которая рекрутирует компоненты ремоделирования хроматина и нуклеосом, создавая локальные гетерохроматиновые области в геноме, в конечном счете приводит к смещению баланса от NHEJ к HDR [133, 134]. Показано подобное смещение равновесия и от NHEJ к MMEJ [129]. Такое распределение выглядит логичным, так как NHEJ по умолчанию (особенно на этапе G1) более активен, чем MMEJ или HDR и, следовательно, в эухроматине может реализоваться в основном NHEJ. В то же время ремоделирование участка разрыва ДНК в гетерохроматине может быть медленным, что дает время для активации MMEJ и HDR. Использование ингибиторов гистоновых деацетилаз HDAC1 или HDAC2, которые поддерживают компактную природу гетерохроматина, показало значительное увеличение скорости как NHEJ, так и HDR – примерно в 2–3 раза [135]. Так, применение трихостатина А, ингибитора HDAC класса I/II, увеличивало примерно в 2.2 раза эффективность редактирования генов в экспрессирующих nCas9 клетках, а применение вальпроевой кислоты, также ингибитора HDAC класса I/II, в сочетании со сверхэкспрессией RAD51 значительно повысило эффективность биаллельной HDR в клетках ES/iPS человека [136]. Следует отметить, что в более раннем исследовании не зафиксировано очевидных различий в соотношении HDR/NHEJ в различных состояниях хроматина [137].

Таким образом, выбор пути репарации ДЦР контролируется статусом метилирования H3K36, а посттрансляционные модификации H3K4me2 и H3K9me3 способствуют реализации HDR [138]. На сегодняшний день вопрос о точном механизме того, как структуры хроматина влияют на выбор пути репарации Cas9-опосредованного ДЦР, остается открытым. В отношении репарации опосредованных Cas9 разрывов ДНК существует обобщенное мнение, что структура хроматина влияет на активность Cas9 как in vivo, так и in vitro, при этом гетерохроматин препятствует CRISPR-Cas-опосредованному редактированию генома [139].

ДНК-МАТРИЦЫ ДЛЯ ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ

Выбор правильного варианта ДНК-матрицы для репарации по пути HDR может значительно повлиять на результативность редактирования генома. Существуют три основных варианта донорных матриц: дцДНК, оцДНК, а также линейная оцДНК аденоассоциированного вируса.

Матрицы дцДНК удобно получать, они имеют низкую стоимость и поэтому широко используются. HDR c использованием в качестве доноров дцДНК менее эффективна, чем с оцДНК-матрицами, однако дцДНК позволяет создавать вставки больших фрагментов (до 7.1 т. п. н.) [66]. Плечи гомологии, необходимые для дцДНК-матриц, обычно относительно длинные (0.5–2 т. п. н.), но успешно используются и плечи гомологии <100 п. н. [140]. Размер плеча является ограничивающим фактором, поскольку эффективность knock-in HDR (HDR с введением в целевое место генома заданной последовательности) положительно коррелирует с длиной плеча гомологии дцДНК и отрицательно коррелирует с размером вставки [76].

Матрицы оцДНК имеют короткие плечи гомологии (70–100 нуклеотидов), их легко синтезировать с введением различных модификаций для повышения эффективности трансформации и стабильности in vivo. Общий уменьшенный размер оцДНК делает ее более подходящей для точечного редактирования со стратегией короткой вставки (<100 нуклеотидов) вместо целых генов [66].

Один из вариантов оцДНК – короткий одноцепочечный олигонуклеотид (оцОНК) длиной около 200 нуклеотидов. оцОНК содержит плечо гомологии ≥30 нуклеотидов как на 5'-, так и на 3'-конце, где более длинное плечо гомологии может повысить эффективность редактирования, но при этом проявляет более выраженную цитотоксичность. Ограниченная длина оцОНК не позволяет делать крупные вставки, хотя использование нескольких оцОНК с перекрывающимися областями увеличивает возможность вставок крупных фрагментов ДНК [66]. Повышение результативности редактирования при использовании оцОНК достигнуто путем фосфоротиоатной модификации, которая стабилизировала матрицу за счет уменьшения вне- и внутриклеточной деградации нуклеазами и увеличивала ее способность проникать через плазматическую мембрану клетки-мишени [141]. В настоящее время оцОНК стали рутинным инструментом редактирования как in vitro, так и in vivo, особенно в экспериментах по изменению нескольких генов [142].

Для расширения использования оцОНК разработана система Easi-CRISPR, в которой в качестве донорных матриц используется длинная оцДНК [143], которая позволяет получать вставки более крупных фрагментов, чем оцОНК, заменять гены в выбранных местах генома и получать условные аллели. Как и в случае оцОНК, расстояние между участком целевой модификации и сайтом Cas-расщепления должно быть как можно меньше. Средняя длина такой ДНК составляет 0.2–2 т. п. н. (максимальная длина 5 т. п. н., после чего ДНК склонны к спонтанным разрывам). При этом используется короткое плечо гомологии, обычно 55–329 нуклеотидов на каждом конце. Длинная оцДНК обладает рядом недостатков: она более токсична, чем оцОНК, а ее получение дороже и сложнее, кроме того, репарация с помощью длинной оцДНК приводит к большей частоте ошибок, чем в случае дцДНК [66, 119].

В дополнение к оцОНК и длинным оцДНК в качестве матриц для HDR используется линейная оцДНК аденоассоциированного вируса (ААВ), упакованная в капсид после удаления всех вирусных генов. Сообщается, что оцДНК-ААВ-матрица обладает высокой эффективностью точечных мутаций и вставок больших фрагментов ДНК, поскольку вирус обладает естественной способностью стимулировать HDR [144, 145]. В целом, длина плеча гомологии оцДНК-ААВ-матрицы составляет 400–800 нуклеотидов. Средняя длина вставки при использовании оцДНК-ААВ матрицы составляет 771–3300 нуклеотидов и не может превышать 3800. Однако c помощью двух доноров оцДНК-ААВ-матриц и нуклеазы CRISPR-Cas в HSPC и Т-клетки можно вставить ДНК длиной 5700 оснований [146].

HDR с использованием донорной дцДНК-матрицы проходит в основном по пути HDR, тогда как при использовании оцДНК матрицы репарация проходит по пути одноцепочечного отжига (SSA) и синтез-зависимого отжига цепи (SDSA) [103]. Однако донорные дцДНК-матрицы как плазмидные, так и линейные, задействованы в системах репарации HMEJ, Tild и PITCh в качестве альтернативы HDR. В качестве донорных ДНК-матриц в HMEJ использовали суперскрученные плазмиды, несущие сайты-мишени синтетической гРНК, и два плеча гомологии (600–900 п. н.) [147], которые в стратегии Tild были заменены линейными дцДНК с двумя плечами гомологии по 800 п. н. [148]. При этом оба типа донорных ДНК-матриц могли эффективно и точно встраивать экзогенную ДНК в сайт-мишень. В системе PITCh также используются сверхскрученные плазмиды, несущие сайты-мишени синтетической гРНК, но с микрогомологичными последовательностями в качестве плеч гомологии (5–25 п. н.). В итоге донорная последовательность встраивалась в геном по MMEJ-пути [149], что позволило работать системе во время G1/ранних S-фаз клеточного цикла в отличие от HDR. В целом разработка этих стратегий позволила в разы увеличить эффективность HDR в следующем порядке Tild > HMEJ > PITCh ≥ HDR, где разрыв между Tild и HDR достигал шести порядков (рис. 6) [148].

 

Рис. 6. Схемы гомологичной репарации (HDR) ДЦР ДНК с использованием в качестве донорных матриц дцДНК.

 

Также показано, что встроить донорную последовательность можно и с использованием пути NHEJ. В этом случае ДЦР вводятся как в целевой геном, так и в донорную матрицу. Сначала донорную плазмиду линеаризуют и разрезают (при этом донорная матрица с двойным разрезом менее эффективна, чем с единичным, так как в первом случае образуются два фрагмента ДНК, конкурирующих за геномную интеграцию), а затем напрямую лигируют с концами разрезанной геномной ДНК по пути NHEJ. NHEJ эффективно повторно лигирует концы ДНК без ошибок и не требует областей гомологии для точной вставки. Однако донорная матрица может быть вставлена в любой ориентации относительно концов разорванной геномной ДНК, и нецелевые ДЦР также могут привести к непреднамеренной вставке в случайные участки генома. Чтобы обойти эту проблему, в донорную плазмиду вводили короткую гомологичную последовательность – “приманку”. Оказалось, что вставка не зависит от гомологии между локусом-мишенью и “приманкой” в донорной плазмиде [150, 151]. Аналогичный результат можно получить с использованием белка Cas12a (Cpf1), который в отличие от Cas9 генерирует ДЦР с липкими концами, потенциально способствующими точному редактированию генома [152]. Недавно обнаружено, что матрица репарации короткой дцДНК, содержащая липкий конец, соответствующий одному из концов Cpf1-опосредованного ДЦР, и гомологичное плечо, разделяющее гомологию с геномной областью, примыкающей к другому концу ДЦР, обеспечивает точную репарацию и вводит желаемую нуклеотидную замену. Эта стратегия задействует механизмы как HDR, так и MMEJ, и названа HDR с помощью лигирования [153].

Таким образом, оптимальные результаты редактирования могут быть получены путем выбора подходящей донорной ДНК-матрицы в соответствии с экспериментальными требованиями. Однако важны также формат предоставления матрицы донорной ДНК, ее доступность и концентрация в ядре. Обычно матрица добавляется в виде очищенной или “голой” ДНК, но в нормальной клеточной среде спираль ДНК обернута вокруг кластера белков – гистонов. Показано, что сконструированные ДНК-матрицы в форме, имитирующей хроматин, наряду со сниженной цитотоксичностью демонстрируют в 2.3–7.4 раза более высокую эффективность HDR по сравнению с развернутой ДНК [154]. Для сближения компонентов CRISPR с донорной ДНК-матрицей внутри клеток разработано несколько систем. Во-первых, модульная стратегия РНК-аптамер-стрептавидин (S1mplex), состоящая из егРНК, дополненной стрептавидинсвязывающим РНК-аптамером, самого стрептавидина и белка Cas, созданная для формирования комплекса рибонуклеопротеинов CRISPR-Cas9 с биотинилированной донорной оцДНК-матрицей (bio-оцДНК) [155]. Во-вторых, получен вариант Cas9, слитый с авидином через гибкий линкер и соединенный мостиком с модифицированной биотином оцДНК (bio-оцДНК) для увеличения сродства [156], а также с использованием SNAP-метки сконструирован комплекс рибонуклеопротеинов CRISPR-Cas9 и bio-оцДНК [157].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эволюция развития технологии CRISPR/Cas привела к получению гибкой, простой в использовании молекулярной платформы для редактирования генома различных организмов. За последние годы разработаны разнообразные стратегии CRISPR-опосредованного редактирования генома, включая новые эффективные подходы к редактированию генома CRISPR-Cas9 с повышенной эффективностью HDR для встраивания в геномы протяженных фрагментов ДНК. Это позволяет добиться значительных достижений в фундаментальных и биомедицинских исследованиях и расширяет понимание биологии живых организмов и патогенетических основ болезней человека.

 

Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 21-64-00006) и частично профинансирована из бюджета Института функциональной геномики МГУ имени М.В. Ломоносова.

Настоящая статья не содержит описания исследований, выполненных с использованием человека и животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

About the authors

O. A. Averina

Institute of Functional Genomics, Lomonosov Moscow State University; Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University; Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University

Email: svetlana@belozersky.msu.ru
Russian Federation, Moscow, 119991; Moscow, 119991; Moscow, 119991

S. A. Kuznetsova

Institute of Functional Genomics, Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: svetlana@belozersky.msu.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

O. A. Permyakov

Institute of Functional Genomics, Lomonosov Moscow State University; Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University

Email: svetlana@belozersky.msu.ru
Russian Federation, Moscow, 119991; Moscow, 119991

P. V. Sergiev

Institute of Functional Genomics, Lomonosov Moscow State University; Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University; Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University

Email: svetlana@belozersky.msu.ru
Russian Federation, Moscow, 119991; Moscow, 119991; Moscow, 119991

References

Supplementary files