Genomic and functional analysis of a representative of the rare genus Krasilnikoviella ‒ Strain YrIIa5 with multiple antibiotic resistance

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The increasing interest in the so-called “rare genera” of actinomycetes is associated with insufficiently studied of their potential as producers of valuable metabolites, primarily antibiotics. The use of selective methods made it possible to isolate the YrIIa5 strain from the soil collected near the “Dutch Fortress” (Rostov, Yaroslavl Region). Phylogenetic analysis based on the similarity of the 16S rRNA genes and five housekeeping genes (MLSA) allowed us to assign the isolate to the genus Krasilnikoviella. Genome analysis revealed many genes responsible for resistance to a wide range of antibiotics, which was confirmed by studying the strain for sensitivity to antimicrobial compounds using the agar diffusion method.

Full Text

Со времен Ваксмана представители рода Streptomyces остаются основным источником антимикробных метаболитов, однако за десятки лет исследований большинство соединений, продукцию которых у природных изолятов можно индуцировать в лабораторных условиях, уже обнаружены и описаны. В связи с ростом глобальной антибиотикорезистентности поиск новых природных антимикробных соединений становится еще более актуальным, поэтому фокус внимания исследователей чаще обращается к так называемым “редким” представителям актиномицетных сообществ, сделав выбор в пользу изучения их биоразнообразия как потенциального источника новых молекул (Parra et al., 2023).

Редкими в литературе принято называть таксоны актиномицетов, не принадлежащие к роду Streptomyces, что не характеризует их абсолютную численность в природных локусах, но подчеркивает сложность их выделения и культивирования в лабораторных условиях по сравнению со стрептомицетами (Subramani, Sipkema, 2019; Parra et al., 2023).

Современные исследования редких представителей филума Actinomycetota включают в себя детализацию систематики, особенностей жизненного цикла, физиологических характеристик и различных аспектов экологии наряду с анализом генома, описанием новых биосинтетических кластеров, изучением механизмов регуляции экспрессии “молчащих генов” через поиск сигнальных молекул и совместное культивирование – с целью обнаружения новых биоактивных метаболитов (Ngamcharungchit et al., 2023).

Задачами данного исследования были поиск актиномицетов редких родов с применением селективных подходов и оценка их биосинтетического потенциала. В результате нам удалось выделить штамм, принадлежащий к роду Krasilnikoviella, имеющему всего два дочерних таксона ‒ Krasilnikoviella flava (Jiang et al., 2009; Nishijima et al., 2017) и Krasilnikoviella muralis (Nishijima et al., 2017).

Штамм YrIIa5 был выделен из верхнего гумусированного слоя тяжелосуглинистой почвы, в городе Ростов Ярославской области, на территории музея-заповедника “Ростовский Кремль” вблизи Голландской крепости (57°11′18.9″N 39°25′08.2″E). Отбор почвенного образца был произведен согласно методике, описанной ранее (Volynkina et al., 2022). Для выделения редких родов актиномицетов использовали селектирующие агенты (Синева, Терехова, 2015): нистатин (250 мкг/мл), налидиксовую кислоту (10 мкг/мл) и рубомицин (1 мкг/мл). Выделение, поддержание и хранение штамма осуществляли на средах IPS3 и органическом агаре 79 согласно методике, описанной ранее (Белик и соавт., 2024). ДНК штамма была выделена в соответствии с методикой, описанной ранее (Zakalyukina et al., 2022). Геном был секвенирован с использованием платформы Illumina MiSeq (“Illumina”, Сан-Диего, Калифорния, США). Сборка генома была осуществлена с помощью алгоритма SPAdes v3.13.0. Наличие генов, кодирующих синтез вторичных метаболитов, было проанализировано с помощью бактериальной версии браузера antiSMASH 6.1.0 (https://antismash.secondarymetabolites.org). Последовательности, кодирующие 16S рРНК и пяти генов “домашнего хозяйства”: atpD, gyrB, recA, rpoB, trpB изучаемого изолята и 12 близкородственных типовых представителей семейства Promicromonosporaceae, были выровнены с помощью алгоритма MUSCLE и объединены в единые последовательности протяженностью 10751 п.н. Филогенетическое древо было построено методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood) с помощью алгоритмов Neighbor-Join и BioNJ, оцененных с использованием модели Тамуры‒Нея (Tamura, Nei, 1993). Номера доступа в GenBank для последовательностей, кодирующих 16S рРНК, atpD, gyrB, recA, rpoB, trpB штамма Krasilnikoviella sp. YrIIa5 соответствуют PP916625.1, PP955951, PP955947, PP955948, PP955949, PP955950. Аннотирование генома проводили с использованием Prokka (Seemann, 2014).

Культуральные и морфологические признаки, а также утилизацию источников углерода исследовали в соответствии с методами, опубликованными ранее (Volynkina et al., 2022). Чувствительность штамма к антибактериальным препаратам (АБП) исследовали с помощью диско-диффузионного метода с использованием дисков (“Bioalalyse”, Турция).

В результате секвенирования и последующей сборки генома были реконструированы последовательности общей протяженностью 4577545 п.о., характеризующиеся содержанием Г + Ц 73.87%, что характерно для членов семейства Promicromonosporaceae (Schumann, Stackebrandt, 2015a; 2015b). Филогенетический анализ изучаемого изолята и близкородственных типовых штаммов показал высокую степень родства между YrIIa5 и Krasilnikoviella flava DSM 21481T (рис. 1).

 

Рис. 1. Филограмма, основанная на шести соединенных последовательностях генов “домашнего хозяйства” (16S рРНК, atpD, gyrB, recA, rpoB, trpB, суммарно 10751 п.н.), построенная методом максимального правдоподобия с наибольшим логарифмическим правдоподобием (‒54397.04). Масштабный отрезок соответствует 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Звездочкой отмечены кластеры с высоким уровнем достоверности (bootstrap >70%), также подтвержденные методами Minimum Evolution, UPGMA, Neighbor-Joining в программе MEGA v.11.

 

Штамм YrIIa5 хорошо растет в аэробных условиях на средах IPS2, IPS3, формируя компактные гладкие колонии от белого до светло-желтого цвета. По мере развития клетки претерпевают морфологические изменения согласно модели “кокк‒палочка‒кокк”: спустя 48 ч клетки из кокковидных становятся изогнутыми, ветвящимися палочками, которые по мере старения снова приобретают округлую форму (рис. 2). Клетки положительно окрашиваются по Граму, лишены жгутиков, размер их составляет 0.56‒0.65 мкм в диаметре.

Тестирование YrIIa5 на чувствительность к антимикробным препаратам показало, что данный штамм резистентен ко многим клинически значимым антибиотикам, таким как амикацин, тобрамицин, гентамицин, канамицин, апрамицин, гигромицин Б, амоксициллин/клавулановая кислота, пиперациллин/тазобактам, азтреонам, цефепим, цефтазидим, ципрофлоксацин, норфлоксацин, левофлоксацин, триметоприм, клиндамицин, эритромицин, фосфомицин, хлорамфеникол в рекомендованных для тестирования концентрациях.

В результате автоматического аннотирования генома у штамма YrIIa5 были найдены гены, обусловливающие устойчивость к пуромицину, тосуфлоксацину, норфлоксацину, хлорамфениколу, новобиоцину, даунорубицину и доксорубицину, линеармицину, фосфомицину, бицикломицину, а также гены, обусловливающие устойчивость к антисептикам, органическим пероксидам, мышьяку, бромистому этидию, дезоксихолату, окислительном стрессу. У близкородственных видов так же были обнаружены некоторые общие гены устойчивости: у Isoptericola cucumis AP-38 ‒ к мышьяку, даунорубицину, у K. flava DSM 21481T ‒ к антибиотику семейства тетрациклина (таблица).

Впервые вид K. flava, представитель рода Krasilnikoviella, был выделен из образца донных отложений Балтийского моря на побережье Германии и описан в 2009 году как представитель рода Promicromonospora (Jiang et al., 2009). В 2017 году Nishijima и соавт. описали новый род Krasilnikoviella внутри семейства Promicromonosporaceae, в котором в качестве типового вида был предложен описанный ими Krasilnikoviella muralis, а для Promicromonospora flava была осуществлена реклассификация в Krasilnikoviella flava (Nishijima et al., 2017).

 

Рис. 2. Электронные микрофотографии штамма Krasilnikoviella sp. YrIIa5 спустя 48 ч (а) и 6 сут (б) инкубирования на среде Органическая 79 при 28°C.

 

В отличие от типового штамма K. flava DSM 21481T, выделенного из донных осадков Балтийского моря (Jiang et al., 2009), средняя соленость поверхностных вод которого составляет около 8%, и способного расти в диапазоне 1‒15% (мас. /об.) NaCl, изолят YrIIa5, выделенный из почв с низкой минерализацией, оказался способен расти при концентрации NaCl не более 1%. Кроме того, выявлено, что YrIIa5 растет в диапазоне рН 5.0–8.0 с оптимумом при рН 7.0, а DSM 21481T проявляет большую алкалотолерантность и способен расти при рН 10.5. Поскольку воды Балтийского моря являются слабощелочными ‒ рН 8.33–8.35 (Кудрявцева, Александров, 2019), алкало- и галотолерантность K. flava DSM 21481T может являться проявлением индивидуальной адаптации к условиям окружающей среды. Кроме того, изолят YrIIa5 показал способность к образованию кислот из маннозы, рамнозы, фруктозы и целлобиозы, чем отличается от типового представителя вида K. flava DSM 21481T.

Тестирование на антибиотикочувствительность выявило у YrIIa5 устойчивость к широкому спектру антибиотиков, представляющих такие классы как β-лактамы, цефалоспорины, аминогликозиды, сульфаниламиды, фторхинолоны, макролиды, линкозамиды. В геноме штамма было выявлено большое количество генов, ответственных как за специфические, так и неспецифические механизмы устойчивости бактерий к антибактериальным препаратам (таблица).

 

Таблица. Гены, кодирующие белки резистентности к лекарственным препаратам, в последовательности ДНК штамма Krasilnikoviella sp. YrIIa5

Ген

Кодируемый белок

Номер доступа
аминокислотной
последовательности
в GenBank

Формируемая устойчивость

аbaF

Белок устойчивости к фосфомицину AbaF

PP727274

Фосфомицин

bmr3

Белок множественной лекарственной устойчивости 3

PP727277

Тосуфлоксацин, норфлоксацин, левофлоксацин, пуромицин

mdtH

Белок множественной лекарственной устойчивости MdtH

PP727276

Норфлоксацин

mdtL

Белок множественной лекарственной устойчивости MdtL

PP727279

Хлорамфеникол

mdtC

Белок множественной лекарственной устойчивости MdtC

PP751657

Новобиоцин

bmrA

ABC-транспортер АТФ-связывающий/ пермеазный белок множественной лекарственной устойчивости BmrA

PP727275

Бисбензимид, бромистый этидий, доксорубицин

drrA

АТФ-связывающий белок устойчивости к доксорубицину DrrA

PP727278

Даунорубицин/доксорубицин

bcr1

Белок устойчивости к бицикломицину/ хлорамфениколу

PP759621

Бицикломицин/хлорамфеникол

lnrL1

АТФ-связывающий белок устойчивости к линеармицину LnrL

PP759622

Линкомицин

 

Одним из распространенных механизмов формирования лекарственной устойчивости бактерий является экспорт лекарственных соединений эффлюксными помпами (ЭП). В зависимости от семейства ЭП способны “выкачивать” антибиотики определенного класса и тем самым формировать устойчивость к ним (Фелькер и соавт., 2021). Штамм YrIIa5 обладает широким спектром генов, кодирующих именно ЭП основных семейств. К представителям MFS-транспортеров, найденных в геноме, относятся: белок AbaF, обусловливающий устойчивость к фосфомицину; белок bmr-3 ‒ к пуромицину, тосуфлоксацину и норфлоксацину; MdtH ‒ к норфлоксацину, офлоксацину и левофлоксацину; MdtL ‒ к хлорамфениколу (Sharma et al., 2017; Ohki, Murata, 1997; Saidijam et al., 2006; Fanelli et al., 2020). Представитель семейства RND, белок MdtC, обеспечивает устойчивость к новобиоцину (Elkins, Nikaido, 2002; Nagakubo et al., 2002). Представитель семейства ABC, мембранный АТФ-связывающий/пермеазный белок BmrA (Di Cesare et al., 2024), способствует оттоку из клетки таких веществ, как бисбензимид, бромистый этидий, а также доксорубицин и других лекарственных веществ антрациклинового типа. К этому же семейству относится еще один АТФ-связывающий белок DrrA, который также обусловливает устойчивость к даунорубицину/доксорубицину.

Найденный штамм Krasilnikoviella sp. YrIIa5 характеризуется ранее не описанной множественной устойчивостью к антибиотикам большинства применяемых в терапии классов, что подтверждается наличием в его геноме генов устойчивости к АМП. Полученные результаты делают YrIIa5, перспективным объектом для изучения совместного действия трансмембранных белков и их роли в защите клеток от неблагоприятного воздействия извне.

 
ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Финансирование работы осуществлялось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-10-2021-093; проект [BTH-RND-2127]). Полногеномное секвенирование было осуществлено при поддержке гранта Министерства науки и высшего образования РФ (Соглашение № 075–15-2021-1085).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Статья не содержит результатов, полученных с использованием животных в качестве объектов исследования.

×

About the authors

A. R. Kiriy

Sirius University of Science and Technology, Scientific Center for Translational Medicine

Email: metrim@gmail.com
Russian Federation, Sochi, 354340

Yu. V. Zakalyukina

Sirius University of Science and Technology, Scientific Center for Translational Medicine; Lomonosov Moscow State University

Email: metrim@gmail.com
Russian Federation, Sochi, 354340; Moscow, 119234

Yu. A. Buyuklyan

Sirius University of Science and Technology, Scientific Center for Translational Medicine

Email: metrim@gmail.com
Russian Federation, Sochi, 354340

M. V. Biryukov

Sirius University of Science and Technology, Scientific Center for Translational Medicine; Lomonosov Moscow State University; Center of Life Sciences, Skolkovo Institute of Science and Technology

Author for correspondence.
Email: metrim@gmail.com
Russian Federation, Sochi, 354340; Moscow, 119234; Moscow, 121205

References

  1. Белик А. Р., Закалюкина Ю. В., Алферова В. А., Буюклян Ю. А., Остерман И. А., Бирюков М. В. Streptomyces phaeochromogenes БВ-204 – штамм-продуцент антрахинона К-1115А, нового ингибитора биосинтеза белка // Acta Naturae. 2024. Т. 16. С.14–23.
  2. Belik A. R., Zakalyukina Yu.V., Alferova V. A., Buyuklyan Y. A., Osterman I. A., Biryukov M. V. Streptomyces phaeochromogenes BV-204, K-1115А anthraquinone-producing strain: a new protein biosynthesis inhibitor // Acta Naturae. 2024. V. 16. P.14–23.
  3. Кудрявцева Е. А., Александров С. В. Гидролого-гидрохимические основы первичной продуктивности и районирование Российского сектора Гданьского бассейна Балтийского моря // Океанология. 2019. Т. 59. С. 56‒71.
  4. Kudryavtseva E. A., Aleksandrov S. V. Hydrological and hydrochemical underpinnings of primary production and division of the Russian sector in the Gdansk basin of the Baltic Sea // Oceanology. 2019. V. 59. P. 49‒65.
  5. Cинева О. Н., Терехова Л. П. Направленное выделение актиномицетов редких родов из почвы // Антибиотики и химиотерапия. 2015. Т. 60. № 7‒8. С. 27–33.
  6. Sineva O. N., Terekhova L. P. Selective isolation of rare actinomycetes from soil // Antibiot. Chemother. 2015. V. 60. № 7‒8. P. 27‒33.
  7. Фелькер И. Г., Гордеева Е. И., Ставицкая Н. В., Першина В. А., Батыршина Я. Р. Перспективы и препятствия для клинического применения ингибиторов эффлюксных помп Mycobacterium tuberculosis // Биол. мембраны. 2021. Т. 38. С. 317–339.
  8. Cesare Di M., Kaplan E., Rendon J., Gerbaud G., Valimehr S., Gobet A., Ngo T. A. T., Chaptal V., Falson P., Martinho M., Dorlet P., Hanssen E., Jault J. M., Orelle C. The transport activity of the multidrug ABC transporter BmrA does not require a wide separation of the nucleotide-binding domains // J. Biol. Chem. 2024. V. 300. Art. 105546.
  9. Elkins C. A., Nikaido H. Substrate specificity of the RND-type multidrug efflux pumps AcrB and AcrD of Escherichia coli is determined predominantly by two large periplasmic loops // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 6490–6498.
  10. Fanelli G., Pasqua M., Colonna B., Prosseda G., Grossi M. Expression profile of multidrug resistance efflux pumps during intracellular life of adherent-invasive Escherichia coli strain LF82 // Front. Microbiol. 2020. V. 11. Art. 1935.
  11. Jiang Y., Wiese J., Cao Y. R., Xu L. H., Imhoff J. F., Jiang C. L. Promicromonospora flava sp. nov., isolated from sediment of the Baltic Sea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. V. 59. P. 1599–1602.
  12. Nagakubo S., Nishino K., Hirata T., Yamaguchi A. The putative response regulator BaeR stimulates multidrug resistance of Escherichia coli via a novel multidrug exporter system, MdtABC // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 4161–4167.
  13. Ngamcharungchit C., Chaimusik N., Panbangred W., Euanorasetr J., Intra B. Bioactive metabolites from terrestrial and marine actinomycetes // Molecules. 2023. V. 28. Art. 5915.
  14. Nishijima M., Tazato N., Handa Y., Umekawa N., Kigawa R., Sano C., Sugiyama J. Krasilnikoviella muralis gen. nov., sp. nov., a member of the family Promicromonosporaceae, isolated from the Takamatsuzuka Tumulus stone chamber interior and reclassification of Promicromonospora flava as Krasilnikoviella flava comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017. V. 67. P. 294–300.
  15. Ohki R., Murata M. Bmr3, a third multidrug transporter gene of Bacillus subtilis // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 1423–1427.
  16. Parra J., Beaton A., Seipke R. F., Wilkinson B., Hutchings M. I., Duncan, K.R. Antibiotics from rare actinomycetes, beyond the genus Streptomyces // Curr. Opin. Microbiol. 2023. V. 76. Art. 102385.
  17. Saidijam M., Benedetti G., Ren Q., Xu Z., Hoyle C., Palmer S., Ward A., Bettaney K., Szakonyi G., Meuller J., Morrison S., Pos MK.., Butaye P., Walraven K., Langton K., Herbert R. B., Skurray RA.., Paulsen I. T., O’Reilly J., Rutherford N. G., Brown M. H., Bill R. M., Henderson P. J.F. Microbial drug efflux proteins of the major facilitator superfamily // Curr. Drug Targets. 2006. V. 7. P. 793–811.
  18. Schumann P., Stackebrand E. Bergey’s Manual of systematics of archaea and bacteria. Promicromonospora. 1st ed. // Ed. Whitman W. B. Hoboken: Wiley, 2015. P. 1–10.
  19. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation // Bioinform. 2014. V. 30. P. 2068–2069.
  20. Sharma A., Sharma R., Bhattacharyya T., Bhando T., Pathania R. Fosfomycin resistance in Acinetobacter baumannii is mediated by efflux through a major facilitator superfamily MFS transporter ‒ AbaF // J. Antimicrob. Chemother. 2017. V. 72. P. 68–74.
  21. Subramani R., Sipkema D. Marine rare Actinomycetes: a promising source of structurally diverse and unique novel natural products // Marine Drugs. 2019. V. 17. Art. 249.
  22. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Mol. Biol. Evol. 1993. V. 10. P. 512–526.
  23. Volynkina I. A., Zakalyukina Y. V., Alferova V. A., Belik A. R., Yagoda D. K., Nikandrova A. A., Buyuklyan Y. A., Udalov A. V., Golovin E. V., Kryakvin M. A., Lukianov D. A., Biryukov M. V., Sergiev P. V., Dontsova O. A., Osterman I. A. Mechanism-based approach to new antibiotic producers screening among actinomycetes in the course of the citizen science project // Antibiotics (Basel). 2022. V. 11. Art. 1198.
  24. Zakalyukina Y. V., Osterman I. A., Wolf J., Neumann-Schaal M., Nouioui I., Biryukov M. V. Amycolatopsis camponoti sp. nov., new tetracenomycin-producing actinomycete isolated from carpenter ant Camponotus vagus // Antonie van Leeuwenhoek. 2022. V. 115. P. 533–544.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Phylogram based on six concatenated sequences of housekeeping genes (16S rRNA, atpD, gyrB, recA, rpoB, trpB, 10751 bp in total), constructed by the maximum likelihood method with the highest log-likelihood (‒54397.04). The scale bar corresponds to 5 substitutions per 100 nucleotides. Clusters with a high level of confidence (bootstrap >70%), also confirmed by the Minimum Evolution, UPGMA, Neighbor-Joining methods in the MEGA v.11 program, are marked with an asterisk.

Download (225KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Electron micrographs of the strain Krasilnikoviella sp. YrIIa5 after 48 hours (a) and 6 days (b) of incubation on Organic 79 medium at 28°C.

Download (130KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2025 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных

 

Используя сайт https://journals.rcsi.science, я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных») даю согласие на обработку персональных данных на этом сайте (текст Согласия) и на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика» (текст Согласия).