Diversity and characteristics of alkalophilic proteolytic bacteria from Soda Lake Nukhe-Nur (Barguzinsky Basin, Buryatia)

Full Text

Содовые озера, гидротермальные источники и почвы, богатые карбонатами, являются разнообразными природными экосистемами с благоприятными условиями для развития алкалофильных бактерий (Gupta et al., 2014; Preiss et al., 2015). Бактерии, которые демонстрируют новые физиологические особенности и имеют потенциальное применение, были выделены из содовых озер, представляющих собой высокощелочную водную среду. Непостоянные по своей природе, они широко распространены по всему миру, в основном в засушливых или полузасушливых субтропических широтах в континентальных районах, включая территорию Африки (Восточноафриканская рифтовая система), Северной Америки (штаты Калифорния и Невада, Мексика), Южной Сибири (Кулундинская степь, территории Забайкальского края, Республик Бурятия и Тыва), Внутренней Монголии (северо-восточный Китай) и Восточной Австралии (Foti et al., 2008; Sorokin et al., 2014). Алкалофильные бактерии содовых озер участвуют в биогеохимических окислительно-восстановительных циклах углерода, серы и азота (Sorokin et al., 2015) и проявляют свойства, которые не обнаруживаются у алкалофилов из других сред (Preiss et al., 2015). Они часто являются полиэкстремофилами: их свойства, помимо алкалофильности, охватывают широкие диапазоны толерантности к солености и температуре (Sorokin et al., 2014).

Основным преимуществом алкалофильных бактерий является наличие у них разнообразных ферментов, оптимум активности которых смещен в область высоких значений рН, среди которых можно указать целлюлазы, пептидазы, кератиназы, ксиланазы, пектиназы, цикломальтодекстринглюканотрансферазы (CGTases) (Gupta et al., 2014; Preiss et al., 2015). Алкалофильные бактерии являются важным источником полезных стабильных ферментов и новых химических веществ, включая противомикробные препараты (Preiss et al., 2015). Кроме того, алкалофильные бактерии могут быть использованы для удаления токсичных соединений серы из сточных вод и газов, а также биодеградации углеводородов и других органических (например, нитроароматических) и неорганических (мышьяк и уран) загрязнителей (Sorokin et al., 2014; Preiss et al., 2015). У алкалофильных бактерий пептидазы считаются наиболее важным классом промышленных ферментов, которые составляют почти 60% от общего объема продаж ферментов в мире (Banerjee, Ray, 2017; Naveed et al., 2021). Это обусловлено их широким применением в пищевой, детергентной, кожевенной, фармацевтической, косметической отраслях, при дегуммировании шелка, извлечении серебра, в химической промышленности и процессах биоремедиации (Naveed et al., 2021). Помимо практического применения пептидазы привлекают исследователей как ключевые участники в процессах деструкции органического вещества, протекающих в естественных экосистемах содовых озер (Nguyen et al., 2019). Поэтому внимание исследователей направлено на выделение алкалофильных протеолитических прокариот из содовых озер. К настоящему времени бактерии-продуценты щелочных пептидаз известны среди родов Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Aeromonas (Masi et al., 2021), Salipaludibacillus (Ibrahim et al., 2016), Nocardiopsis (Sharma, Singh, 2016), Halomonas (Эрдынеева и соавт., 2018), Proteinivorax (Лаврентьева и соавт., 2019), Alkalicaulis, Aliidiomarina (Лаврентьева и соавт., 2021).

В настоящее время использование ферментов в промышленности будет только увеличиваться, и, таким образом, для удовлетворения спроса важен скрининг новых микробных штаммов-продуцентов (Banerjee, Ray, 2017; Naveed et al., 2021).

Данное исследование направлено на изучение алкалофильных бактерий, выделенных из щелочного озера Нухэ-Нур Баргузинской котловины. Содовое озеро Нухэ-Нур характеризуется относительно неустойчивым режимом воды, зависящим от сезонных и многолетних климатических изменений водного и теплового баланса. Кроме того, наличие морозного зимнего периода также вызывает частые и существенные нарушения солености воды (Зайцева и соавт., 2012). Таким образом, озеро Нухэ-Нур является крайне нестабильной экосистемой, поэтому бактерии должны иметь различные метаболические адаптации, чтобы справиться с колебаниями факторов окружающей среды и выдерживать конкуренцию.

Цель работы – выделение, изучение эколого-физиологических свойств алкалофильных бактерий и определение физико-химических свойств их внеклеточных пептидаз.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования послужили вода и донные отложения слабоминерализованного щелочного озера Нухэ-Нур, располагающегося в надпойменном понижении на степном участке Баргузинской долины, по правому берегу реки Баргузин (53°38′781″ с.ш., 109°56′807″ в.д., высота 479 м над уровнем моря). Площадь озера составляет около 4 км², глубина достигает 2‒3 м (Солоноватые и соленые озера…, 2009).

Отбор проб и определение физико-химических параметров воды проводили в летний период. Температура воды в момент отбора проб составляла 21.6°С, рН – 9.6, минерализация – 9.8 г/дм³. Окислительно-восстановительный потенциал был в пределах –0.75 мВ, что объясняется образованием восстановленных соединений за счет продуктов анаэробного распада органического вещества и низкими значениями растворенного кислорода. По содержанию главных ионов вода озера Нухэ-Нур относится к гидрокарбонатно-натриевому типу. Доминирующим катионом являлся Na⁺ (2941 мг/дм³), концентрации ионов Mg²⁺ и Ca²⁺ в воде были незначительны и составляли 42.6 и 12.0 мг/дм³ соответственно. Щелочность воды озера обусловлена высокими концентрациями ионов HCO^3– и CO₃^2–, содержание которых достигало 5186 и 780 мг/дм³ соответственно. Концентрация хлоридов и сульфатов составляли 613 и 157 мг/дм³ соответственно.

Отбор проб и условия культивирования. Пробы воды и донных осадков озера Нухэ-Нур для микробиологических исследований отбирали в стерильную посуду. До проведения анализов пробы хранили в холодильнике. Посев осуществляли методом предельных разведений (1: 10) на модифицированной среде Пфеннига следующего состава (г/л): NH₄Cl – 0.5; KH₂PO₄ – 0.5; MgCl₂ – 0.5; СаСl₂ – 0.05; NaCl – 25; дрожжевой экстракт – 0.5. В качестве субстрата вносили пептон – 2%. Культивирование проводили при температуре 30°С в течение 3‒7 сут. Полученные накопительные культуры с целью выделения изолятов высевали на агаризованную среду Пфеннига. Чистоту культур контролировали визуально по однородности колоний и микроскопированием.

Микроскопические исследования. Морфологию, размеры, подвижность клеток изучали с помощью светового микроскопа AxioStar Plus (“Carl Zeiss”, Германия) в фазовом контрасте и на окрашенных препаратах при рабочем увеличении в 1000 раз. Окрашивание проводили по Граму.

Изучение эколого-физиологических свойств бактерий. Для выявления оптимальных параметров и границ роста изоляты культивировали при различных значениях рН среды (от 6.0 до 12.0, с интервалом в 0.5) и концентрации NaCl (0 до 30 г/дм³, с интервалом в 5 г/дм³). Диапазон рН устанавливали добавлением 0.5 М NaOH и 25% раствора HCl. Температурные интервалы роста бактерий определяли с использованием градиентного термостата от 5 до 60°С. Способность к росту на среде с разными источниками белка проверяли на модифицированной среде Пфеннига, в которую вносили компоненты (пептон, триптон, казеин, желатин) до конечной концентрации 2% от объема среды. Рост бактерий определяли по изменению оптической плотности культуральной жидкости при длине волны 560 нм.

Таксономический и филогенетический анализ. Извлечение целевой ДНК проводили с помощью приготовления лизата из образца методом механической гомогенизации. Секвенирование проводили на платформе MiSeq (“Illumina”, США) в ЦКП “Персистенция микроорганизмов” Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук (ИКВС УрО РАН).

Первичный анализ сходства полученных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК выполняли с использованием инструментов веб-сервиса Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с помощью алгоритма blastn. Соответствующие последовательности близкородственных видов были извлечены из базы данных GenBank. Множественное выравнивание сделано в программе CLUSTAL W. Филогенетические деревья построены методом присоединения соседей (“neighbor-joining”) в программе MEGA 7.0. Статистическую достоверность филогенетических реконструкций оценивали с помощью бутстреп-анализа путем построения 1000 альтернативных деревьев.

Определение протеолитической активности. Культуры инкубировали при оптимальных условиях (температура культивирования 30°С, рН 8.0, минерализация 5 г/дм³, источник белка – триптон) на среде Пфеннига в течение 7 сут, затем клетки осаждали центрифугированием (12 000 об./мин; 15 мин). Внеклеточную протеолитическую активность полученного супернатанта определяли согласно методу Эрлангера.

В работе использованы следующие п-нитроанилидные субстраты, специфичные для эндопептидаз определенного типа или класса: GlpAALpNA (пироглутамил-аланил-аланил-лейцин-n-нитроанилид) – для субтилизин-подобных пептидаз; BzRpNA (N-бензоил-L-аргинил-n-нитроанилид) – для трипсин-подобных пептидаз; GlpFpNA (пироглутамил-фенилаланил-n-нитроанилид) – для химотрипсин-подобных пептидаз; GlpFApNA (пироглютамил-фенилаланил-аланил-n-нитроанилид) – для цистеиновых пептидаз. Субстраты для аминопептидаз: LpNA (L-лейцил-п-нитроанилид); FpNA (L-фенилаланил-п-нитроанилид).

Для измерения активности пептидаз в ячейку микропланшета вносили 160 мкл 0.1 М фосфатного буфера (рН 8.0), добавляли 10 мкл культуральной жидкости, 10 мкл соответствующего субстрата и измеряли оптическое поглощение раствора в нулевой момент. Затем смесь инкубировали при 37°С, определяя изменение поглощения через различные промежутки времени. Количество образовавшегося продукта (n-нитроанилина) определяли спектрофотометрически при 405 нм на микропланшетном фотометре StatFax 2100 (“Awareness Technology Inc.”, США) в 96-луночных планшетах, используя дифференциальный фильтр 492 нм (Лаврентьева и соавт., 2021).

Изучение секреции внеклеточных пептидаз проводили в следующих условиях: в зависимости от источника белка (пептон, яичный альбумин), при различных значениях рН (9.0 и 10.0), минерализации (10 и 25 г/дм³), при различных температурах культивирования (5 и 30°С) и времени культивирования (3, 5 и 7 сут).

Определение оптимума pH активности и pH стабильности фермента. При определении оптимума pH действия секретируемой пептидазы по отношению к синтетическим субстратам был использован универсальный буфер в диапазоне рН 5.8–11.0 с шагом 1.0. В состав буфера входили 0.02 М H₃PO₄, 0.02 M CH₃COOH, 0.02 M H₃BO₃; необходимое значение рН получали, добавляя к смеси кислот 0.02 М NaOH. Для определения рН стабильности ферментный препарат инкубировали при 37°С в течение 4 ч в универсальном буферном растворе (рН 5.8–11.0). Затем образцы доводили до рН 8 с помощью 0.1 М фосфатного буфера (pH 7.0) в щелочном диапазоне от рН 8.0, либо 0.1 М NaOH в кислом диапазоне до рН 8.0. Пептидазную активность ферментов определяли по методу, описанному выше.

Определение температурного оптимума и температурной стабильности фермента. Температурный оптимум фермента определяли при температурах от 5 до 60°С. Для изучения температурной стабильности раствор фермента инкубировали при тех же температурах в течение 4 ч, затем доводили до комнатной температуры и определяли активность, как указано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологические и экофизиологические характеристики чистых культур протеолитических алкалофильных бактерий. Из проб воды и донных осадков озера Нухэ-Нур было изолировано семь чистых культур. Выделенные штаммы на модифицированной среде Пфеннига образовывали различные колонии бежевого, желтого и оранжевого цветов с преимущественно гладким краем и выпуклым профилем. Штамм Н–Н6 формировал слизистые колонии желтого цвета с неровными краями. При микроскопировании клетки бактерий были представлены грамположительными и грамотрицательными подвижными и неподвижными палочками и грамположительными неподвижными кокками (таблица).

 

Таблица. Основные характеристики выделенных чистых культур

Штамм	Источник выделения	Морфология клеток	Экофизиологические характеристики
			рН, ед. пределы/опт.	NaCl, г/дм3 пределы/опт.	Т, °С пределы/опт.
Н–Н2	Вода	Гр–, неподвижные палочки (1.5 × 2.0 мкм)	8.0–11.0/ 9.0–9.5	5–30/ 10–15	10–50/ 30–35
Н–Н3	Вода	Гр–, подвижные, палочки (0.5 × 0.9 мкм)	7.5–11.0/ 9.0–9.5	0–30/ 5-10	10–50/ 30–35
Н–Н1	Вода	Гр–, подвижные палочки (1.5 × 0.6 мкм)	8.0–11.0/ 9.0–9.5	0–30/ 5-10	10–50/ 35–40
Н–Н4	Вода	Гр+, неподвижные кокки (0.8–1.0 мкм)	7.5–11.0/ 8.5–9.0	5–30/ 10–15	5–50/ 30–35
Н–Н6	Донные осадки	Гр+, неподвижные палочки (1.1 × 1.5 мкм)	7.5–10.5/ 8.0–9.0	0–25/ 10	5–40/ 20–30
Н–Н7	Донные осадки	Гр+, неподвижные кокки (0.5–0.8 мкм)	7.0–10.0/ 7.5–8.5	0–20/ 0–5	10–45/ 25–30
Н–Н5	Донные осадки	Гр+, неподвижные кокки (0.8–2.0 мкм)	7.0–10.0/ 7.5–8.0	0–20/ 0–5	5–45/ 25–30

 

Для выделенных чистых культур бактерий были определены диапазоны и оптимумы роста при различных значениях рН среды, концентрации NaCl и температуры (таблица). Выделенные бактерии росли в диапазоне рН от 7.0 до 11.0, с оптимумом рН 9.0–9.5, проявляя свойства облигатных алкалофилов. Исключение составляли культуры Н–Н6 и Н–Н7, рост которых наблюдался при рН 7.0–10.5 с оптимум около 8.0. По отношению к концентрации NaCl выделенные бактерии в основном являлись галотолерантными, с диапазоном роста 0–30 г/дм³ и оптимумом около 10 г/дм³. Оптимальные для роста значения температуры варьировали в пределах 30-35°С, что позволило отнести выделенные культуры к группе мезофилов. В целом рост наблюдался в диапазоне от 5 до 50°С.

Изученные алкалофильные бактерии в аэробных условиях были способны к росту на различных белках и белковоподобных соединениях. Характерной особенностью являлся активный рост всех штаммов на легкогидролизуемых пептидных субстратах, таких как триптон и пептон. Полипептидные субстраты казеин и желатин активно утилизировали штаммы, выделенные из воды озера Нухэ-Нур. Тогда как штаммы бактерий Н–Н5, Н–Н6 и Н–Н7, изолированные из донных отложений, обнаружили слабый рост на желатине и казеине.

Таксономическое положение выделенных культур алкалофильных бактерий. Для анализа филогенетического родства выделенных изолятов и их ближайших родственных видов было построено филогенетическое дерево с использованием метода присоединения соседей (рис. 1).

 

Рис. 1. Филогенетическое положение выделенных штаммов на дереве, построенном с использованием метода присоединения соседей. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (>50 %), определенная с помощью “bootstrap”-анализа.

 

В результате анализа последовательностей фрагментов гена 16S рРНК выявлены представители филумов Pseudomonadota, Actinomycetota и Bacillota. Полученные культуры демонстрировали 98.49–100% сходства с ранее описанными типовыми штаммами. Согласно полученным данным, штаммы Н–Н1 и Н–Н2, выделенные из проб воды озера Нухэ-Нур, принадлежали к роду Nitrincola, семейству Oceanospirillaceae, порядку Oceanospirillales класса Gammaproteobacteria. Большинство представителей рода Nitrincola являются алкалофильными галотолерантными бактериями, типовые штаммы которых выделены преимущественно из содовых, соленых или щелочных озер в аридных и семиаридных районах по всему миру (Phurbu et al., 2019). Штамм Н–Н1 демонстрировал достаточно высокий уровень сходства с Nitrincola schmidtii DSM 100788^T (99.14%), с которым объединялся на филогенетическом дереве с высокой достоверностью (99%), что позволяет предполагать их филогенетическую близость. Штамм Н–Н2 был близок к виду Nitrincola alkalisediminis JCM 19317^T (98.49%), однако на филогенетическом дереве формировал отдельную ветвь, близкую к Nitrincola alkalisediminis JCM 19317^T и Nitrincola tibetensis CICC 24457^T.

Штамм Н–Н3, согласно анализу последовательности гена 16S рРНК, принадлежал к невалидированному роду “Polymorphum” недавно выделенного семейства Paracoccaceae (Goker, 2022), порядка Rhodobacterales (Alphaproteobacteria). Изолят демонстрировал наибольшее сходство с единственным видом данного рода “Polymorphum gilvum” CGMCC 1.9160 (99.55%), который был выделен из засоленной почвы на нефтяном месторождении Шэнли в Китае (Cai et al., 2011), однако кластеризовался с ним с низкой вероятностью. На филогенетическим дереве штамм занимал положение внутри клады Pannonibacter–Labrenzia–Roseibium–Stappia, представители которой на данный момент отнесены к семейству Stappiaceae порядка Hyphomicrobiales (Hordt et al., 2020). Основная часть типовых штаммов данной клады связаны с морскими экосистемами и выделены из воды, прибрежных и донных отложений, гидробионтов (красные водоросли, губки, прибрежные галофиты).

Последовательность гена 16S рРНК штамма Н–Н4 обнаруживала высокий уровень сходства с невалидированным видом “Planococcus dechangensis” CGMCC 1.12151 (99.78%) семейства Caryophanaceae, порядка Caryophanales, класса Bacilli (Bacillota). Достоверность объединения данных нуклеотидных последовательностей в один кластер составляла 77%, что свидетельствовало о возможной принадлежности штамма к этому виду. Род Planococcus на момент написания статьи содержал 36 видов (https://lpsn.dsmz.de/genus/planococcus), выделенных из различных мест обитания, в первую очередь, из морских экосистем (вода, донные и прибрежные отложения, гидробионты и морепродукты). Достаточно большое количество штаммов обнаружено в экстремальных условиях, включая холодные местообитания (лед и цианобактериальные маты на территории Арктики и Антарктиды), засоленные и/или щелочные, а также загрязненные почвы (Yang et al., 2020; Uniacke-Lowe et al., 2024). Ранее было отмечено, что ферменты бактерий рода Planococcus проявляют устойчивость к низким температурам и высокому содержанию солей. Они также широко изучались на предмет их потенциального применения в биоремедиации, так как представители рода продемонстрировали способность разлагать и обезвреживать различные загрязняющие вещества, такие как фенол и тяжелые металлы (Yang et al., 2020).

Таксономическое положение штамма Н–Н5, выделенного из образцов донных отложений озера Нухэ-Нур, было неоднозначно. Последовательность гена 16S рРНК имела 100% сходство с пятью видами, относящимися к роду Trichococcus, семейству Carnobacteriaceae, порядку Lactobacillales, классу Bacilli филума Bacillota, с которыми штамм Н–Н5 образовывал единый кластер на филогенетическом дереве. Ранее было выявлено, что виды Trichococcus обладают высокой идентичностью последовательностей гена 16S рРНК, и для таксономической идентификации более эффективно использовать значение ДНК–ДНК-гибридизации in silico (dDDH) и величину средней идентичности нуклеотидов (ANI), рассчитанные по полным геномным последовательностям (Dai et al., 2018; Parshina et al., 2019). Поэтому для уточнения видовой принадлежности данного штамма необходимо провести в будущем более детальное исследование. Особенностью представителей рода Trichococcus является способность расти в широком диапазоне температур (от 0 до 45°C), что может найти потенциальное применение для очистки сточных вод в условиях низких температур (Dai et al., 2018; Parshina et al., 2019). Кроме того, отмечена высокая метаболическая гибкость Trichococcus, например, их устойчивость к кислороду и металлам, а также способность адаптироваться к среде с высокой соленостью.

Из образцов донных отложений также было выделено два штамма, являющихся представителями филума Actinomycetota класса Actinomycetia порядка Micrococcales семейства Micrococcaceae. Штамм Н–Н6 имел высокий уровень сходства с Arthrobacter ruber CGMCC 1.9772^T (99.56%), однако на филогенетическом дереве образовывал отдельную ветвь в пределах рода Arthrobacter. Род Arthrobacter, который за последние несколько лет подвергся нескольким таксономическим пересмотрам, в настоящее время фигурирует как парафилетический таксон, что также было подтверждено недавними филогеномными исследованиями (Nouioui et al., 2018). Представители этого рода распространены повсеместно и часто составляют численно значимую часть микробиоты различных почв, что объясняется их чрезвычайной устойчивостью к высыханию и нехватке питательных веществ (Jones, Keddie, 2006). Представители рода Arthrobacter также были выделены из осадков сточных вод, морских отложений и цианобактериальных матов на территории Антарктиды, карстовых и базальтовых водоносных горизонтов, образцов животных и растений. Сообщалось, что психрофильные штаммы этого рода являются наиболее распространенными и активными бактериями в илах подземных пещер (Jones, Keddie, 2006; Busse, Wieser, 2014; Flegler et al., 2020). Представители рода Arthrobacter используют широкий спектр органических соединений, ксенобиотиков и других токсичных веществ, и, следовательно, играют важную роль в их биодеградации в природной среде. Некоторые штаммы артробактерий способны переносить высокие концентрации тяжелых металлов, таких как кадмий и медь, или даже проводить детоксикацию, накапливая их в клетках (Busse, Wieser, 2014).

Штамм Н–Н7 демонстрировал 100% сходство последовательности гена 16S рРНК с Micrococcus yunnanensis CCTCC AA 208060^T. Но на филогенетическом дереве объединялся в один кластер с ближайшими гомологами, что не позволяет сделать однозначный вывод о видовой принадлежности данной культуры. Большинство представителей рода Micrococcus, в том числе и выделенный штамм Н–Н7, образуют желтые колонии и способны расти при высоких значениях pH (до 10). Они широко распространены в природе и были выделены из различных местообитаний, включая образцы почвы, воздуха, активного ила, органов и тканей животных и растений, молочных отходов, некоторые штаммы были описаны как условно-патогенные микроорганизмы человека (Prakash et al., 2014; Lee et al., 2022).

Определение протеолитической активности. Изученные алкалофильные бактерии в аэробных условиях были способны к росту на различных белках и белковоподобных соединениях. Характерной особенностью являлся активный рост всех штаммов на легкогидролизуемых пептидных субстратах, таких как триптон и пептон. Штаммы, выделенные из воды озера Нухэ-Нур, активно утилизировали полипептидные субстраты казеин и желатин, тогда как штаммы бактерий Н–Н5, Н–Н6 и Н–Н7, изолированные из донных отложений, обнаружили слабый рост на желатине и казеине.

Для четырех штаммов (Н–Н1, Н–Н2, Н–Н3 и Н–Н4), выделенных из образцов воды озера Нухэ-Нур, было проведено определение протеолитической активности.

Скорость выработки микробных ферментов в значительной степени зависит от различных параметров культивирования, в первую очередь от температуры, рН, источников углерода и азота, продолжительности культивирования. Оптимизация этих факторов важна для улучшения качества продукта и экономической эффективности. Поэтому далее сравнительное изучение секреции внеклеточных пептидаз проводили в зависимости от источника белка (пептон, яичный альбумин), при различных значениях рН – 9.0 и 10.0, минерализации – 10 и 25 г/дм³, температуры – 5 и 30°С и времени культивирования (3, 5 и 7 сут). На рис. 2 представлены графики, отражающие субстраты, на которых наблюдалась наибольшая активность исследуемых штаммов в зависимости от условий культивирования.

Изучение спектра пептидаз, секретируемых различными штаммами, выявило, что штаммы бактерий Н–Н1 и Н–Н4 активно продуцировали пептидазы, гидролизующие синтетические субстраты, специфичные для субтилизинподобных пептидаз GlpAALpNa и аминопептидаз – LpNA (рис. 2а, 2г). Следует отметить, что штамм Н–Н1 показал наиболее высокую активность на 7 сут культивирования. Наибольшая активность в отношении субстрата, специфичного для субтилизинподобных пептидаз и аминопептидаз (LpNa) у штамма Н–Н1 обнаружена при минерализации 10 г/дм³ и достигала 0.49 и 0.55 ед./мл соответственно. Штамм Н–Н4 был наиболее активен на 3 и 7 сут культивирования при повышенных значениях рН. Максимальные активности для аминопептидаз обнаружены на 3 сут (LpNa) при рН 10.0 (0.41 ед./мл), для субтилизинподобных пептидаз на 7 сут при рН 10.0 (0.53 ед./мл).

Для штамма Н–Н2 были характерны высокие активности по отношению к аминопептидазам (LpNa и FpNa). Максимальные активности зафиксированы на 3 сут культивирования при рН 10.0 и составили 0.66 ед./мл по FpNa и 0.87 ед./мл по LpNa (рис. 2б).

Штамм Н–Н3 активно продуцировал пептидазы, специфичные для трипсинподобных пептидаз, высокая активность которых обнаружена на 5 и 7 сут при рН среды 9.0 (1.54 и 1.62 ед./мл соответственно). Кроме того, штамм Н–Н3 продуцировал пептидазы, гидролизующие синтетические субстраты, специфичные для аминопептидаз (LpNA), наибольшая активность которых обнаружена на 7 сут культивирования при минерализации среды 10 и 25 г/дм³ и составила 1.12 и 1.28 ед./мл соответственно (рис. 2в).

 

Рис. 2. Субстратная специфичность выделенных штаммов Н–Н1 (а), Н–Н2 (б), Н–Н3 (в), Н–Н4 (г) на синтетических субстратах при оптимальных условиях (1) и различных значениях рН 9 (2) и 10 (3), минерализации 10 (4) и 24 (5) г/дм³, источниках белка – пептон (6), яичный альбумин (7) и температуре культивирования 5°С (8) в зависимости от времени культивирования (3, 5 и 7 сут).

 

Одним из важных факторов, определяющих активность внеклеточных ферментов, является наличие в питательной среде оптимального субстрата. Показано, что наибольшая активность пептидаз обнаружена на среде с триптоном, присутствие в среде пептона или яичного альбумина не приводило к индукции ферментов. Исследованные нами культуры не гидролизовали субстраты, специфичные для химотрипсиноподобных пептидаз (GlpFpNA) независимо от времени культивирования, источников белка, температуры, рН и минерализации в среде.

Необходимо отметить, что увеличение значений рН среды, а также минерализации в большинстве случаев приводило к увеличению активности ферментов исследуемых штаммов, что, вероятно, отражает адаптационные механизмы культур, выделенных из воды содового озера Нухэ-Нур. Полученные данные свидетельствуют о том, что изученные алкалофильные бактерии имеют широкий спектр секретируемых пептидаз, что, возможно, в природных местообитаниях позволяет им успешно использовать природные белковые субстраты.

Определение оптимума и стабильности ферментов при разных значениях температуры и рН. Среди изученных параметров температура и pH считаются наиболее важными для работы ферментов. Было изучено влияние температуры и рН на активность и стабильность у наиболее представленных внеклеточных пептидаз, гидролизующих GlpAALpNa у штаммов Н–Н1 и Н–Н4, LpNa у штамма Н–Н2 и BzRpNA у штамма Н–Н3.

Температурный оптимум ферментов штаммов Н–Н1, Н–Н2 и Н–Н4 составлял 30°С, у штамма Н–Н3 ферменты проявляли максимум активности при 40°С. Пептидазы сохраняли более 50 % активности при температуре до 50°С (рис. 3).

 

Рис. 3. Температурный оптимум (1) и термостабильность (2) внеклеточных пептидаз выделенных бактерий: а – Н–Н1; б – Н–Н2; в – Н–Н3; г – Н–Н4.

 

Рис. 4. Оптимум рН (1) и рН-стабильность (2) внеклеточных пептидаз выделенных бактерий: а – Н–Н1; б – Н–Н2; в – Н–Н3; г – Н–Н4.

 

Исследование влияния рН на пептидазы, секретируемые штаммами Н–Н1, Н–Н2 и Н–Н4, показало, что пептидазы были стабильны при рН от 7.0 до 10.0 и имели оптимум активности при рН 9.0. Пептидазы штамма Н–Н3 были стабильны при рН 5.8–10.0 с оптимум активности при рН 8.0 (рис. 4). Учитывая, что пептидазы были активны в диапазоне значений рН от 8.0 до 10.0 и показали высокую стабильность – до рН 10.0, их следует отнести к классу щелочных пептидаз.

Таким образом, определение физико-химических свойств ферментов исследуемых штаммов показало, что исследуемые пептидазы имели высокую активность и стабильность в широком диапазоне pH (5.8–10.0) и температуры (5–50°С), что в целом соответствует условиям среды, в которых функционируют бактерии в естественных местообитаниях.

Алкалофильные протеолитические бактерии, представители родов Nitrincola и “Polymorphum” филума Pseudomonadota, родов Trichococcus и Planococcus филума Bacillota, родов Arthrobacter и Micrococcus филума Actinomycetota были выделены из образцов воды и донных осадков содового озера Нухэ–Нур. В основном их ближайшие гомологи выделены из экстремальных сред, такие как соленые (морские) щелочные среды. Исследование экофизиологии культур показало, что все штаммы развиваются в области высоких значений рН и являются облигатными алкалофилами и умеренными алкалофилами. По отношению к солености выделенные бактерии в основном являлись галотолерантными. Анализ пептидазной активности выделенных штаммов показал высокую стабильность исследуемых ферментов в щелочной области, которая, в целом, типична для протеолитических ферментов алкалофильных бактерий. Активная секреция внеклеточных ферментов совпадает с замедлением роста культур в период пост-экспоненциальной фазы. Данные анализа субстратной специфичности наиболее активных внеклеточных пептидаз указывают на их принадлежность к классу сериновых протеаз субтилизин-подобного и трипсин-подобного типа, а также аминопептидаз. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что изученные алкалофильные бактерии имеют широкий спектр секретируемых пептидаз, что, возможно, в природных местообитаниях позволяет им успешно использовать природные белковые субстраты.

 

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-24-20050, https://rscf.ru/project/24-24-20050/).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований, в которых в качестве объектов использовались люди или животные.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

E. V. Lavrentyeva

Institute of General and Experimental Biology of the SB RAS; Dorzhi Banzarov Buryat State University

Author for correspondence.
Email: lena_l@mail.ru
Russian Federation, Ulan-Ude, 660047; Ulan-Ude, 670000

E. P. Nikitina

Dorzhi Banzarov Buryat State University; Baikal Institute of Nature Management of the SB RAS

Email: lena_l@mail.ru
Russian Federation, Ulan-Ude, 670000; Ulan-Ude, 660047

T. G. Banzaraktsaeva

Institute of General and Experimental Biology of the SB RAS

Email: lena_l@mail.ru
Russian Federation, Ulan-Ude, 660047

V. B. Dambaev

Institute of General and Experimental Biology of the SB RAS

Email: lena_l@mail.ru
Russian Federation, Ulan-Ude, 660047

References

Supplementary files