Solid-state method of production of probiotic feed additives for farm animals

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

A technology has been developed for producing a probiotic preparation by solid-state cultivation of a mixed culture of Bacillus subtilis B-8130, B. subtilis B-2984, B. subtilis B-4099 on beet pulp, which is shown in two preparations (ProStor and GerbaStor). Solid-state fermentation was carried out under conditions of limited access to oxygen at a temperature of 40 ± 5°C, pH 7.5‒8.0 and mixture humidity 45 ± 3% for 48‒50 hours. During the process, acidification of the reaction mass was observed, a significant increase in cell titer and the formation of a biofilm on phytosorbent. The cell titer depended on the factor “stage of fermentation”, but did not depend on the factor type of preparation ‒ ProStor or GerbaStor. Among the identified volatile products, by 48 hours of fermentation the content of acetic acid, 3-methylbutanoic acid, p-guaiacol and 2-n-pentylfuran increased, and aromatic substances of the phenolic series decreased. Additional metabolites were obtained that enhance the antibacterial properties and taste of the probiotic preparation. The formation of a biofilm made it possible to preserve viable cells during drying (45°C): in ProStor 1.2 × 108 CFU/g, and in GerbaStor 0.58 × 108 CFU/g. In HerbaStore with an expanded range of medicinal plants, a decrease in the titer of bacilli is associated with dehydration during drying and with the antibacterial properties of phytocomponents.

Full Text

В системе кормопроизводства широко применяются пробиотики – класс микробиологических препаратов для регуляции и улучшения состава кишечной биоты животных. Современные эффективное кормовые пробиотические препараты представляют собой композиции пре-, пробиотиков и их метаболитов (Sánchez et al., 2016; Шендеров и соавт., 2017; Ushakova et al., 2021). Разные препараты по-разному и с разной эффективностью корректируют работу желудочно-кишечного тракта организма хозяина. Это определяется как особенностью штамма-пробиотика, так и формой, в которой бактерии вводятся в организм животного. Биологическая эффективность повышается при получении пробиотиков в виде биопленки на твердом носителе. Препараты, основанные на получении биопленки пробиотиков, отличаются сохранением жизнеспособных клеток, их метаболитов, наличием сигнальных веществ бактериального происхождения, влияющих на гомеостаз многоклеточных организмов-хозяев (Горшков и соавт., 2010). Биологическая активность кормовых добавок повышается при комбинировании пробиотиков с лекарственными растениями (Правдин и соавт., 2011; Pavlov et al., 2014). Разносторонняя направленность действия пробиотической составляющей и фитокомпонентов обеспечивает продуктивность животных, увеличение перевариваемости кормов, нормализацию работы желудочно-кишечного тракта, укрепление иммунитета, возможность сохранения поголовья при отказе от использования кормовых антибиотиков.

Цель работы – изучение процесса твердофазного культивирования смешанной культуры бактерий р. Bacillus на природном сорбенте (микроизмельченном свекловичном жоме) и влияния факторов стадии ферментации, высушивания и комбинации с лекарственными растениями на жизнеспособность бацилл.

В работе использовали штаммы бактерий из коллекции ВКПМ, перспективные для получения пробиотических препаратов для замены кормовых антибиотиков согласно свойствам, описанным в их паспортах: B. subtilis ВКПМ В-8130 (кишечный симбионт с эндоглюканазной активностью); B. subtilis ВКПМ В-2984 (антагонист Staphylococcus aureus, Shigella sonnei, Esherichia coli, Proteus vulgaris); B. subtilis ВКПМ В-4099 (применяется для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы).

Применяли двустадийную технологию получения биологически активной кормовой добавки, включающую раздельное глубинное аэробное культивирование на глюкозо-пептонной среде Эйкмана (“Биотехновация”, Россия) пробиотических штаммов с получением жидкой культуры (первая стадия), и последующее твердофазное культивирование смешанной культуры (1 : 1 : 1) B. subtilis ВКПМ В-8130, титр клеток (3.5 ± 0.5) × 109 КОЕ/мл, B. subtilis ВКПМ В-2984, титр клеток (5.0 ± 1.2) × 109 КОЕ/мл, B. subtilis ВКПМ В-4099, титр клеток (6.5 ± 0.9) × 109 КОЕ/мл на свекловичном жоме при ограниченном доступе кислорода в закрытом полиэтиленовом пакете с замком Zip-Lock, полностью заполненном ферментационной массой (вторая стадия).

Смешанную культуру бацилл вносили в количестве 20% от конечной массы смеси с жомом. Использовали стерилизованный автоклавированием микроизмельченный свекловичный жом, размер частиц не более 1 мм. Твердофазную ферментацию проводили при температуре 40 ± 5°С, рН 7.5‒8.0 и влажности смеси 45 ± 3% в течение 48 ч. После высушивания (45°С, влажность 8%) к полученной смеси добавляли 10% порошка лекарственных растений (смесь в равных количествах: эхинацея, расторопша в варианте ПроСтор, и эхинацея, душица, зверобой, лист подорожника, расторопша, цветы ромашки в варианте ГербаСтор). Смесь перемешивали в течение 0.5 ч и подвергали дроблению до получения порошка однородной массы, в которой определяли содержание клеток бактерий р. Bacillus.

Количество жизнеспособных клеток в жидкой культуре (КОЕ/мл) определяли стандартным методом серийных разведений; в сыром или сухом препарате КОЕ/г определяли методом серийных разведений 10% водной взвеси порошка после встряхивания 30 мин на лабораторном шейкере ПЭ-6500, “ЭКРОСХИМ”, Россия (в соответствии с ГОСТ Р 54065-2010). Число повторностей при определении КОЕ – трехкратное. Количество повторностей ферментации для ПроСтора – 7, для ГербаСтора – 4. Контроль рН осуществляли с использованием рН-метра Экотест 2000 (НПП “Эконикс”, Россия).

Анализ летучих органических соединений проводили методом твердофазной микроэкстракции (SPME) (Mottaleb, 2014). 10 г сухого продукта твердофазной ферментации до смешения с травами помещали в стеклянную емкость объемом 0.5 л, добавляли 2 мкл раствора внутреннего стандарта D8-толуола (5 мкг) в метаноле, вводили сорбционный стержень и выдерживали 1 ч при температуре 40°С. Сорбционный стержень затем вводили в хромато-масс-спектрометрическую систему, включающую газовый хроматограф Trace и масс-спектрометрический детектор ThermoFinnigan Polaris Q (“ThermoElectron”, США). Условия анализа: кварцевая капиллярная колонка 30 м × 0.25 мм с неподвижной фазой SGE BPX-5 (слой 0.25 мкм), программирование температуры от 40 до 280°С со скоростью 10°С/мин, температура инжектора 240°С, интерфейса – 240°С; ионизация электронным ударом при энергии электронов 70 эВ. Скорость газа-носителя (Не) – 0.5 мл/мин. Оценку концентрации летучих соединений проводили по методу внутреннего стандарта. Анализ делали в трех повторностях.

Сканирующую электронную микроскопию осуществляли на микроскопе Tescan Mira 3 LMH (“Tescan”, Чехия). Препараты в виде порошка наносили на поверхность двустороннего проводящего скотча для микроскопии Supplies (США), наклеенного на предметный столик. Напыление осуществляли золотом на установке Q150R ES Plus (“Quorum Technologies Ltd”, Великобритания).

Сравнение количества клеток в препаратах проводили с помощью Robust ANOVA (Wilcox, 2017), с использованием метода бутстрэп (700 случайно сгенерированных из исходной выборок), так как распределение выборок полученных данных отличалось от нормального (результаты теста Шапиро‒Уилкинсона по одной из выборок: p = 0.007, W = 0.802). При сравнении выборок использовали непараметрические методы и медиану по данным титра клеток и кислотности, применяли тест Браннера‒Манзела (Karch, 2023). Для статистического анализа данных использовали программу Jamovi 2.4.8.0.

Электронно-микроскопические исследования свекловичного жома показали, что его частицы представляют собой трубчато-складчатую структуру с большим количеством микропор (рисунок, а), что указывает на потенциально высокие сорбционные свойства фитоносителя.

 

Рисунок. Биопленка в препаратах: а – вид частиц свекловичного жома; б – развитие бацилл на поверхности носителя в препарате ПроСтор, 24 ч; в – биопленка на поверхности носителя в препарате ГербаСтор, 48 ч.

 

При твердофазном культивировании смешанной культуры бактерий на поверхности частиц носителя развивались клетки бактерий, и ко вторым суткам наблюдалось образование биопленки (рисунок, б, в). При этом отмечено закисление реакционной массы с начального значения рН 7.6 до рН 6.6 на первые сутки и до рН 5.8 на 48 ч культивирования, а также повышение общего титра клеток (таблица).

 

Таблица. Показатели титра клеток в препаратах при твердофазной ферментации на свекловичном жоме

Препарат

Титр клеток, КОЕ/г*

Продукт твердофазной ферментации, сут

Высушенный препарат

0

1

2

ПроСтор

1.50 × 108

1.60 × 108

1.45 × 108 (на сухую массу – 2.4 × 108)

1.20 × 108 (на сухую массу – 1.98 × 108)

ГербаСтор

1.05 × 108

1.75×108

6.65 × 108 (на сухую массу – 1.1 × 109)

0.58 × 108 (на сухую массу – 9.59 × 107)

*КОЕ/г сырой массы для твердофазной стадии и КОЕ/г сухого конечного препарата. Приведены значения медианы.

 

Анализ данных с использованием Robust ANOVA показал, что титр клеток зависел от фактора “стадия ферментации”, но не зависел от фактора тип препарата – ПроСтор или ГербаСтор (p < 0.001 и p = 0.086 соответственно). Пост-хок сравнение уровней фактора “стадия ферментации” выявило, что титр клеток через 48 ч после начала ферментации был достоверно выше, чем до начала твердофазной стадии культивирования (psi-hat = –0.661, p < 0.001). Численность клеток в сырых препаратах 45% влажности по завершении ферментации составила для ПроСтор 1.45 × 108 КОЭ/г и ГербаСтор 6.65 × 108 КОЭ/г. Содержание клеток после высушивания до 8% влажности в конечном препарате с фитокомпонентами по значениям медианы: 1.2 × 108 КОЕ/г для ПроСтор (рН 6.2) и 0.58 × 108 КОЕ/г для ГербаСтор (рН 5.9). При расчете на абсолютно сухой вес (АСВ) титров клеток препаратов по завершении ферментации этот показатель в сыром ГербаСтор был достоверно выше, чем в препарате ПроСтор – тест Манна‒Уитни: статистика теста (U) = 4.5, p = 0.014. Достоверных различий в количестве клеток в конечных препаратах 8% влажности между ПроСтор и ГербаСтор не было (тест Манна–Уитни: статистика теста (U) = 12, p = 0.345). Титр клеток по АСВ в этих конечных препаратах также достоверно не различался (тест Манна–Уитни: статистика теста (U) = 12, p = 0.345). При сравнении расчетных показателей по АСВ титра клеток сырых продуктов ферментации 45% влажности с учетом 10% добавления фитокомпонентов и титра клеток в конечном препарате выявлено, что для ГербаСтор получение конечного продукта сопровождалось падением показателя с 11.9 × 108 КОЕ/г до 0.6 × 108 КОЕ/г, т.е. в 18 раз. Это может объясняться не только высушиванием, но также ингибирующим действием лекарственных растений с антимикробными свойствами – душицы, зверобоя, лопуха, ромашки (Корсун, Корсун, 2010). В варианте ПроСтор с расторопшей для поддержания печени и иммуностимулирующей эхинацеей сохранение высокого титра клеток в сухом препарате свидетельствовало о защитном эффекте биопленки при обезвоживании и отсутствии значимого отрицательного действия этих фитокомпонентов на жизнеспособность микробных клеток: снижение числа клеток (с 2.4 × 108 КОЕ/г до 1.6 × 108 КОЕ/г) составило 1.5 раза.

В ходе твердофазного культивирования на свекловичном жоме смешанной культуры бактерий B. subtilis ВКПМ В-8130, B. subtilis ВКПМ В-2984, B. subtilis ВКПМ В-4099 на примере ПроСтора показано, что к 48 ч увеличивается содержание идентифицированных летучих соединений: уксусной кислоты с 0.010 ± 0.002 до 0.025 ± 0.0004 мкг/г, 3-метилбутановой кислоты с 0.002 ± 0.0003 до 0.0034 ± 0.0004 мкг/г, а также п-гваякола с 0.005 ± 0.0005 до 015 ± 0.002 мкг/г и 2-н-пентил-фурана 0.006 ± 0.0009 до 0.0015 ± 0.0002 мкг/г. Эти данные соответствуют снижению рН реакционной смеси. В то же время наблюдалось снижение количества выявленных ароматических веществ фенольного ряда (фенол, ацетилфенол, крезол, ацетофенон), а также диметилпиразина, 2-н-пентилфурана, 3-изопропоксибензальдегида и салицилового альдегида, что нивелирует антипитательные свойства свекловичного жома и подтверждает способность смешанной культуры бактерий р. Bacillus повышать качество пищи, расщепляя в организме токсические вещества. Выделение уксусной кислоты подтверждает наличие бактериальной ферментации. Увеличение содержания 3-метилбутановой кислоты свидетельствует о протекании элементов брожения в заданных условиях твердофазного культивирования. Гваякол – простой фенол с биологической активностью, антиоксидант, используется при диареях, действуя дезинфицирующе и противогнилостно (DrugBank, https://www.drugbank.ca/drugs/DB11359). 2-пентилфуран – ароматическое вещество, которое могут синтезировать бациллы, например, B. megaterium XTBG34 (Zou et al., 2010), – является безопасной пищевой добавкой, усилителем вкуса (Cha et al., 2021).

Твердофазная стадия культивирования использованных в работе бактерий р. Bacillus на органическом носителе позволила получить защищающую клетки биопленку и сохранить высокий титр жизнеспособных клеток после сушки, а также получить дополнительные метаболиты, усиливающие антибактериальные свойства и вкусовые качества пробиотического препарата.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа была выполнена с использованием оборудования ЦКП “Инструментальные методы в экологии” при ИПЭЭ РАН. Работа выполнена за счет бюджетного финансирования, тема № 51 (0109-2019-0008).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Aвторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

N. A. Ushakova

A.N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution RAS

Author for correspondence.
Email: naushakova@gmail.com
Russian Federation, 119071, Moscow

V. G. Pravdin

Scientific and Technical Center BIO LLC

Email: naushakova@gmail.com
Russian Federation, 309292, Belgorod region, Shebekino

I. V. Pravdin

Scientific and Technical Center BIO LLC

Email: naushakova@gmail.com
Russian Federation, 309292, Belgorod region, Shebekino

L. Z. Kravtsova

Scientific and Technical Center BIO LLC

Email: naushakova@gmail.com
Russian Federation, 309292, Belgorod region, Shebekino

E. S. Brodsky

A.N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution RAS

Email: naushakova@gmail.com
Russian Federation, 119071, Moscow

A. V. Ambaryan

A.N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution RAS

Email: naushakova@gmail.com
Russian Federation, 119071, Moscow

References

  1. Горшков В. Ю., Петрова О. Е., Даминова А. Г., Гоголев Ю. В. Система межклеточной коммуникации энтеробактерии Erwinia carotovora при формировании адаптивного ответа к условиям неблагоприятным для роста // Доклады АН. 2010. Т. 430. С. 268–272.
  2. Корсун Е. В., Корсун В. Ф. Фитотерапия. Традиции российского травничества. М.: Центрполиграф, 2010. 882 c.
  3. Правдин В. Г., Кравцова Л. З., Ушакова Н. А. Способ получения комплексной биологически активной кормовой добавки для животных, птицы и рыбы с пробиотиками и лекарственными травами / Патент РФ № 2477614 от 11.06.2011. Опубл. 20.01.2013. Бюл. № 2.
  4. Шендеров Б. А., Синица А. В., Захарченко М. М. Метабиотики: вчера, сегодня, завтра. СПб.: Крафт, 2017. 80 с.
  5. Cha D. H., Roh G. H., Hesler S. P., Wallingford A., Stockton D. G., Park S. K., Loeb G. M. 2-Pentylfuran: a novel repellent of Drosophila suzukii // Pest. Manag. Sci. 2021. V. 77. Р. 1757–1764.
  6. Karch J. D. Bmtest: A jamovi module for Brunner–Munzel’s test–a robust alternative to Wilcoxon–Mann–Whitney’s test // Psych. 2023. V. 5. P. 386–395.
  7. Mottaleb M. A. Solid-phase microextraction (SPME) and its application to natural products // Handbook of chemicals and biological plant analytical methods. Ch. 5. / Ed. K. Hostettmann. Wiley, 2014. Р. 105–127.
  8. Pavlov D. S., Ushakova N. A., Pravdin V. G., Кravtsova L. Z., Liman C. A., Ponomarev S. V. The ProStor and Ferm KM complex probiotic additives: biotechnological innovation for enhancing the quality of domestic fish mixed feed // News in chemistry, biochemistry and biotechnology: state of the art and prospects of development. Nova Science Publishers. New York. 2014. V. 20. Р. 239–244.
  9. Sánchez B., Delgado S., Blanco-Míguez A., Lourenço A., Gueimonde M., Margolles A. Probiotics, gut microbiota, and their influence on host health and disease // Mol. Nutrit. Food Res. 2016. V. 61. Art. 1600240. https://doi.org/10.1002/mnfr.201600240
  10. Ushakova N. A., Pravdin V. G., Kravtsova L. Z., Ponomarev S. V., Gridina T. S., Ponomareva E. N., Rudoy D. V., Chikindas M. L. Complex bioactive supplements for aquaculture – evolutionary development of probiotic concepts // Probiotics Antimicrob. Proteins. 2021. V. 13. P. 1696‒1708. https://doi.org/10.1007/s12602-021-09835-y
  11. Wilcox R. R. Introduction to robust estimation and hypothesis testing. 4th edn. Academic Press, 2017. 810 p.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure. Biofilm in preparations: a – type of beet pulp particles; b – development of bacilli on the carrier surface in the ProStor preparation, 24 h; c – biofilm on the carrier surface in the GerbaStor preparation, 48 h.

Download (81KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».