New Bacteriophage Pseudomonas Phage Ka1 from a Trivia of Lake Baikal

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The bacteriophage Pseudomonas phage Ka1 was isolated from the water of a tributary of Lake Baikal, in the area of discharge of treated wastewater in the city of Slyudyanka. The bacteriophage genome is 46,092 bp in size. and 50% composition of G + C pairs (AN OP455935.1) has 91% identity with the genome of Pseudomonas phage PSA37, belonging to the Bruynoghevirus from the class Caudoviricetes, which characterizes it as a new representative of Luz24-like phages (Bruynoghevirus). The bacteriophage lyses 62% of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa and is able to increase the effectiveness of gentamicin, ciprofloxacin, imipinem and meropenem by 4–8 times against this bacterium. Integrases, transposases and recombinases are not identified in the genome, which makes Pseudomonas phage Ka1 possible for use in complex therapy of infections caused by P. aeruginosa.

Full Text

На сегодняшний день бактериальные инфекции являются одной из острых проблем в сфере здравоохранения (Mielko et al., 2019). Эволюционное давление, создаваемое активным использованием антибактериальных препаратов, приводит к кумулятивному приобретению устойчивости к антибиотикам у патогенов, способствуя появлению штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Pseudomonas aeruginosa вызывает тяжелые инфекции благодаря различным факторам вирулентности, а также способности формировать биопленки (Linlin et al., 2023). Перспективным решением данной проблемы является использование бактериофагов как отдельно, так и в сочетании с антимикробными препаратами, что позволит снизить общее количество используемых антибиотиков в клинической практике (Guo et al., 2020). Особенностью бактериофагов является их специфичность к бактериям-мишеням, что значительно снижает негативное влияние антимикробных препаратов на основе бактериофагов на нормальную микрофлору человека. Кроме того, бактериофаги показали многообещающие результаты при лечении устойчивых к антибиотикам инфекций P. aeruginosa (Rosa et al., 2021). Доказано, что применение литических бактериофагов является эффективным подходом против антибиотикорезистентных бактерий, так как специфичность бактериофагов не зависит от устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам (Kortright et al., 2019). Помимо клинической практики, бактериофагов предложено использовать для устранения бактериальных загрязнений с поверхностей пищевых продуктов (Endersen et al., 2020).

В данной работе приводится характеристика нового бактериофага Pseudomonas phage Ka1, выделенного из воды притока озера Байкал, около места сброса очищенных сточных вод г. Слюдянка, а также повышение эффективности ципрофлоксацина, имипинема и меропинема при их совместном применении с бактериофагом в отношении P. aeruginosa.

Используемые штаммы. В работе использовали типовые штаммы бактерий Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, P. aeruginosa РАО1 и P. aeruginosa 190158. Клинические изоляты P. aeruginosa, полученные от пациентов с низкой эффективностью противомикробной терапии, были предоставлены Казанским научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии.

Бактериофаг Pseudomonas phage Ka1 был выделен в районе поступления очищенных сточных вод в приток озера Байкал.

Питательные среды и условия культивирования бактерий. Использовали питательную среду LB (Sambrook et al., 1989) (%): триптон – 1.0; дрожжевой экстракт – 0.5; NaCl – 1.5; pH 8.0 (агаризованная среда LB содержала дополнительно 1.5% агара) и полужидкую агаризованную среду (Ames, 1971) (г/л): агар – 6; NaCl – 6. Антимикробные препараты – гентамицин, амикацин, ципрофлоксацин, норфлоксацин, цефтриаксон, стрептомицин, эритромицин, азитромицин, ванкомицин, имипенем, меропенем и колистин – были приобретены в компании Sigma (США).

Получение фаголизата. В стерильную пробирку из зоны лизиса собирали слой верхнего полужидкого агара и ресуспендировали в 15 мл раствора 0.9% NaCl. Полученный раствор центрифугировали при 10 тыс. об./мин и супернатант фильтровали через шприцевой мембранный фильтр с диаметром пор 0.22 мкм. Полученный фаголизат хранили при 4°С.

Подсчет БОЕ бактериофагов. Подсчет БОЕ бактериофага проводили по методу Грациа (Gratia, 1936) с модификациями (Mazzocco et al., 2009). Для этого в лунки стерильного 96-луночного планшета вносили по 90 мкл 0.9% NaCl. В первую лунку добавляли 10 мкл фаголизата и в последующих лунках готовили серийные 10-кратные разведения фаголизата в стерильном физиологическом растворе. После чего из каждой лунки по 15 мкл суспензии вносили к 1 мл полужидкого агара, содержащего P. aeruginosa (107 КОЕ/мл), и заливали на поверхность плотной питательной среды в 35-мм чашки Петри. БОЕ подсчитывали из чашек, содержащих минимум 5 бляшек, умножая на коэффициент разведения.

Оценка чувствительности бактерий к бактериофагу. Способность фага лизировать клинические изоляты тестировали с помощью спот-теста, как описано в работе (Fong et al., 2009), с объемом капли 5 мкл. Для этого на чашки с питательной средой LA наносили 3 мл полужидкого LA, содержащего 30 мкл ночной культуры P. aeruginosa (107 КОЕ/мл). После застывания среды наносили капли фагового лизата объемом 5 мкл с концентрацией 108 БОЕ/мл, просушивали 15 мин и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Затем проводили оценку чувствительности по шкале: полная активность (++) ‒ полностью прозрачное (не мутное) пятно, внутри которого не наблюдается роста бактерий; частичная активность (+) ‒ мутное пятно, которое легко видно невооруженным глазом, или прозрачное пятно, содержащее изолированные колонии бактерий; отсутствие активности (‒) ‒ отсутствие легко различимого пятна невооруженным глазом. Все анализы бляшек проводили в трех биологических повторах.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Определение чувствительности изолятов P. aeruginosa к антибиотикам проводили на среде Мюллер-Хинтон (“Sigma”, США), согласно рекомендациям EUCAST (Leclercq et al., 2013), методом микроразведений при сочетании препаратов с бактериофагом или диско-диффузионным методом с использованием стандартных дисков с антибактериальными препаратами (Научно-исследовательский центр фармакотерапии (НИЦФ), г. Санкт-Петербург) при оценке спектра чувствительности изолята к антибиотикам.

Секвенирование и анализ генома. Shortgun-секвенирование с двуконцевыми прочтениями проводили на платформе Illumina MySeq. Качество прочтений после секвенирования ДНК бактериофага оценивали с помощью программы FastQC (Andrews, 2010), кольцевой геном был собран с помощью SnapGen DNA. Геном был аннотирован с помощью сервера Prokka (Seemann, 2014), распределение генов по функциональным категориям было проведено с помощью сервера RAST (Aziz et al., 2008). Идентифицированные рамки считывания белков бактериофага были верифицированы вручную с использованием алгоритма BLAST, сравнивая с базой данных NCBI GenPept.

Характеристика бактериофага Pseudomonas phage Ка1. Из притока озера Байкал в зоне сброса сточных вод вблизи г. Слюдянка был выделен изолят Ка1, способный лизировать клетки P. aeruginosa ATCC 27853. ДНК изолята была выделена с помощью коммерческого набора Viral RNA/DNA Mini Kit (“Invitrogen”) и проведено shortgun-секвенирование с двуконцевыми прочтениями на платформе Illumina MySeq. После удаления прочтений, относящихся к геному P. aeruginosa ATCC 27853, выход секвенирования составил 14.952 Мб. На основе оставшихся прочтений был собран кольцевой геном размером 46092 п.о. с уровнем ошибки 0.0028 и покрытием 316×, с 50%-ым содержанием Г + Ц пар. Сравнение генома с помощью алгоритма BLAST с базой данных GenBank выявило максимальную идентичность в 95.14% при покрытии 79% с геномом Pseudomonas phage PSA37 (AN MZ089740.1) рода Bruynoghevirus из класса Caudoviricetes. Выравнивание геномов бактериофагов Ка1 и PSA37 алгоритмом ClustalO показало 91% идентичности геномов, что позволяет утверждать, что выделен новый представитель Luz24-подобных фагов (Bruynoghevirus).

Полный кольцевой геном размером 46092 п.о. задепонирован в Генбанке, AN OP455935.1. В результате аннотации генома идентифицирована 71 кодирующая последовательность (табл. S1). Из них 34 кодируют гипотетические полипептиды с неизвестной функцией. Выявлено 6 генов метаболизма аминокислот, 4 гена кодируют белки с нуклеазной активностью, 11 генов участвуют в обмене нуклеиновых кислот, 20 генов кодируют структурные белки капсида и хвоста, 3 гена отвечают за синтез тРНК. При этом в геноме отсутствуют гены интегразы, транспозазы и рекомбиназы – потенциальных белков, связанных с переходом к лизогенному жизненному циклу. Также не идентифицируются гены литических ферментов, возможно, они входят в состав 34 белков с неизвестной функцией (рис. S1, табл. S1).

Оценка штаммоспецифичности бактериофага Pseudomonas phage Ка1. Следующим этапом была проведена оценка чувствительности различных типовых штаммов и клинических изолятов P. aeruginosa к бактериофагу Ка1 с помощью спот-теста с объемом капли 5 мкл (табл. 1). Все типовые штаммы оказались чувствительными к бактериофагу, при этом среди клинических изолятов только 62% штаммов (8 из 13) поддавались лизису (полная или частичная активность). Это говорит об узкой специфичности бактериофага к штаммам синегнойной палочки. При этом штаммы с множественной устойчивостью (изоляты 1475, 305, 410, 443, 293, 4086, 4241, 3101) также подвергаются лизису, хоть и с частичной активностью (табл. 1).

 

Таблица 1. Чувствительность к бактериофагу Ка1 и профиль устойчивости к антибиотикам у клинических изолятов P. aeruginosa. Данные приведены из трех биологических повторов

Штамм/изолят P. aeruginosa

Резистентность к антимикробным препаратам

Чувствительность к бактериофагу (“++” ‒ выраженный лизис, “+” ‒ слабый лизис, “‒” лизис не наблюдается)

1475

Л-R, Ц-R, Цаз-R, Г-R

‒

293

Азл-R, Аз-R, Л-R, П-R, Цаз-R, Г-R

+

305

Аз-R, Азл-R, Л-R, Г-R, П-R, Т-R, Цаз-R

‒

449

Азл-R, Аз-R, П-R, Цаз-R

++

458

Г-R, Азл-R, Аз-R, П-R, Цаз-, Т-R

+

278

Аз-R, Азл-R, Г-R, П-R, Цаз-R

+

288

Азл-R, Аз-R, П-R, Цаз-R, Г-R

‒

410

Аз-R, Л-R, П-R, Цаз-R, Г-R

++

443

Азл-R, Аз-R, Л-R, П-R, Цаз-R, Г-R, Т-R

‒

250

Азл-R, Аз-R, Л-R, П-R, Цаз-R, Г-R

‒

4086

Азл-R, Аз-R, Л-R, П-R, Цаз-R, Г-R

+

4241

Азл-R, Аз-R, Л-R, П-R, Цаз-R, Г-R

+

3101

Азл-R, Аз-R, Л-R, П-R, Цаз-R, Г-R

+

Условные обозначения: Азлоциллин ‒ Азл, Азтреонам ‒ Аз, Гентамицин ‒ Г, Левофлоксацин ‒ Л, Меропенем ‒ М, Пиперацилин ‒ П, Тобрамицин ‒ Т, Цефтазидим ‒ Цаз.

 

Следующим этапом с помощью метода серийных разведений исследовали синергетический эффект бактериофага Ка1 с 13 антимикробными препаратами: гентамицин, амикацин, ципрофлоксацин, норфлоксацин, цефтриаксон, цефтазидим, стрептомицин, эритромицин, азитромицин, ванкомицин, имипенем, меропенем и колистин. При сочетании с бактериофагом МПК гентамицина, ципрофлоксацина, имипенема и меропенема снижались в 4‒8 раз по сравнению с МПК чистого антибиотика, что свидетельствует о синергизме бактериофага с данными противомикробными препаратами (табл. 2).

 

Таблица 2. Изменение минимальной подавляющей концентрации антибактериальных препаратов при сочетанном действии с бактериофагом Ка1. Приведены медианные значения из трех биологических повторов

Антибиотик

МПК, мкг/мл

‒ Ка1

+ Ка1

Уменьшение МПК

Гентамицин

2

0.5

4

Амикацин

2

1

2

Ципрофлоксацин

32

4

8

Норфлоксацин

>64

32

2

Цефтриаксон

>64

64

1

Цефтазидим

1

0.5

2

Азитромицин

>64

>64

1

Стрептомицин

>64

>64

1

Эритромицин

>64

>64

1

Ванкомицин

>64

>64

1

Имипенем

>64

16

4

Меропенем

>64

8

8

Колистин

8

4

2

 

В совокупности эти данные позволяют предположить, что бактериофаг Ка1 может быть предложен в качестве инструмента для повышения противомикробной активности имеющихся антибиотиков против P. aeruginosa, обладающих различным паттерном резистентности.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения задания в сфере научной деятельности, Проект № FZSM2022-0017 (Е.Ю. Тризна), и госбюджетного проекта № 0279-2021-0015 (В.В. Дрюккер).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Ф.М.С., Г.А.Э., И.В.Н., Я.Л.Л. – экспериментальные процедуры, К.А.Р., Т.Е.Ю., Д.В.В., Г.А.С. – руководство работой; все авторы участвовали в написании и утверждении рукописи.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

 

Рис. S1. Круговая диаграмма кодирующих последовательностей генома Pseudomonas

 

Таблица S1. Распределение генов бактериофага по функциональным категориям с помощью сервера RAST

Количество генов

Описание

2

Терминальный повтор

34

Гипотетический белок с неизвестной функцией

1

Аминокислотная лигаза

1

Гамма-глутамилциклотрансфераза

1

Гамма-глутамилциклотрансфераза

1

Амидолигаза

1

Нуклеофил-аминогидролаза

1

СOOH-NH2 лигаза

1

Хеликаза/ДНК праймаза

2

ДНК-полимераза 1

1

N-H-N эндонуклеаза Cas9-подобный белок

6

Гипотетический мембранный белок

1

H-N-H эндонуклеаза самонаведения

1

Холин

1

Белок, связывающий одноцепочечную ДНК

1

Лоскутная (flap) эндонуклеаза

1

Нуклеотидилтрансфераза трнк/полиадениловая полимераза

1

Эндодезоксирибонуклеаза I

1

Металлофосфоэстераза

2

Rho-независимый терминатор

1

Фосфоноацетатгидролаза

1

Двусторонний Rho-независимый терминатор

20

Cтруктурные белки капсида и хвоста

2

N-ацетилтрансфераза

1

Крупная субъединица терминазы

1

Малая субъединица терминазы

1

Пролин-тРНК,

1

Тирозин-тРНК

1

Аспартат-тРНК

×

About the authors

M. S. Fedorova

Kazan (Volga Region) Federal University

Author for correspondence.
Email: MaSFedorova97@mail.ru
Russian Federation, 420008, Kazan

A. E. Gatina

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: MaSFedorova97@mail.ru
Russian Federation, 420008, Kazan

V. N. Ilyina

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: MaSFedorova97@mail.ru
Russian Federation, 420008, Kazan

L. L. Yadykova

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: MaSFedorova97@mail.ru
Russian Federation, 420008, Kazan

V. V. Dryukker

Limnological Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: MaSFedorova97@mail.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

A. S. Gorshkova

Limnological Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: MaSFedorova97@mail.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

A. R. Kayumov

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: MaSFedorova97@mail.ru
Russian Federation, 420008, Kazan

E. Y. Trizna

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: MaSFedorova97@mail.ru
Russian Federation, 420008, Kazan

References

  1. Ames B. N. The detection of chemical mutagens with enteric bacteria // Chemical mutagens: principles and methods for their detection. V. 1. Boston, MA: Springer US, 1971. P. 267–282.
  2. Andrews S., Krueger F., Segonds-Pichon A., Biggins L., Krueger C., Wingett S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. 2010.
  3. Aziz R., Bartels D., Best A., DeJongh M., Disz T., Edwards R., Formsma K., Gerdes S., Glass E., Kubal M., Meyer F., Olsen G., Olson R., Osterman A., Overbeek R., McNeil L., Paarmann D., Paczian T., Parrello B., Pusch1 G., Reich C., Stevens R., Vassieva O., Vonstein V., Wilke A., Zagnitko O. The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology // BMC Genomics. 2008. V. 9. Art. 75. P. 1–15.
  4. Endersen L., Coffey A. The use of bacteriophages for food safety // Curr. Opin. Food Sci. 2020. V. 36. P. 1–8.
  5. Ferry T., Kolenda C., Laurent F., Leboucher G., Merabischvilli M., Djebara S., Gustave C.-A., Perpoint T., Barrey C., Pirnay J.-P., Resch G. Personalized bacteriophage therapy to treat pandrug-resistant spinal Pseudomonas aeruginosa infection // Nature Commun. 2022. V. 13. Art. 4239.
  6. Fister S., Mester P., Witte A. K., Sommer J., Schoder D., Rossmanith P. Part of the problem or the solution? Indiscriminate use of bacteriophages in the food industry can reduce their potential and impair growth-based detection methods // Trends Food Sci. Technol. 2019. V. 90. P. 170–174.
  7. Fong P., Boss D., Yap T., Tutt A., Wu P., Mergui-Roelvink M., Mortimer P., Swaisland H., Lau A., O’Connor M., Ashworth A., Carmichael J., Kaye S., Schellens J., de Bono J. Inhibition of poly (ADP-ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers // New England J. Med. 2009. V. 361. P. 123–134.
  8. Gratia A. Des relations numériques entre bactéries lysogènes et particules de bactériophages // Annales de l’Institut Pasteur. Masson Publishing, France, 1936. Т. 57.
  9. Guo Z., Lin H., Ji X., Yan G., Lei L., Han W., Gu J., Huang J. Therapeutic applications of lytic phages in human medicine // Microb. Pathogen. 2020. V. 142. Art. 104048.
  10. Kayumov A., Khakimullina E., Sharafutdinov I., Trizna E., Latypova L., Lien H., Margulis A., Bogachev M., Kurbangalieva A. Inhibition of biofilm formation in Bacillus subtilis by new halogenated furanones // J. Antibiot. 2015. V. 68. P. 297–301.
  11. Kortright K., Chan B., Koff J., Turner P. Phage therapy: a renewed approach to combat antibiotic-resistant bacteria // Cell Host & Microbe. 2019. V. 25. P. 219–232.
  12. Leclercq R., Canton R., Brown D., Giske C., Heisig P., MacGowan A., Mouton J., Nordmann P., Rodloff A., Rossolini G., Soussy C.-J., Steinbakk M., Winstanley T., Kahlmeter G. EUCAST expert rules in antimicrobial susceptibility testing // Clin. Microbiol. Infect. 2013. V. 19. P. 141–160.
  13. Li L., Zhong Q., Zhao Y., Bao J., Liu B., Zhong Z., Wang J., Yang L., Zhang T., Cheng M., Wu N., Zhu T., Le S. First‐in‐human application of double‐stranded RNA bacteriophage in the treatment of pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection // Microb. Biotechnol. 2023. V. 16. P. 862–867.
  14. Mazzocco A., Waddell T., Lingohr E., Johnson R. Enumeration of bacteriophages using the small drop plaque assay system // Bacteriophages: methods and protocols. V. 1: Isolation, characterization, and interactions. 2009. P. 81–85.
  15. Mielko K., Jabłoński S., Milczewska J., Sands D., Łukaszewicz M., Młynarz P. Metabolomic studies of Pseudomonas aeruginosa // World J. Microbiol. Biotechnol. 2019. V. 35. P. 1–11.
  16. La Rosa R., Rossi E., Feist A., Johansen H., Molin S. Compensatory evolution of Pseudomonas aeruginosa’s slow growth phenotype suggests mechanisms of adaptation in cystic fibrosis // Nature Commun. 2021. V. 12. Art. 3186.
  17. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 2nd edn.
  18. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation // Bioinformatics. 2014. V. 30. P. 2068–2069.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure S1. Pie chart of coding sequences of the Pseudomonas genome

Download (496KB)
Indexing metadata
3. Supplement
Download (92KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».