Email this article 
CryoEM Investigation of Three-Dimentional Structure of the Stx-Converting Bacteriophage ϕ24B
- Authors: Kuznetsov A.S.1, Moiseenko A.V.2, Kulikov E.E.1, Letarov A.V.1,2
-
Affiliations:
- Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences
- Lomonosov Moscow State University
- Issue: Vol 93, No 3 (2024)
- Pages: 336-339
- Section: SHORT COMMUNICATIONS
- URL: https://journals.rcsi.science/0026-3656/article/view/265065
- DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624030095
- ID: 265065
Cite item
Full Text
Abstract
A modified method for culturing, concentrating, and purifying phage ϕ24B preparations was developed. In particular, a new lysogenic phage-producing strain lacking flagella was used, induction conditions were optimized, and purification in a sucrose gradient and concentration by deposition on a Freon 113 cushion were used. Using this method, a preparation of the Stx-converting bacteriophage ϕ24B was obtained, which was suitable for direct analysis by the cryoEM method. Based on cryoEM data for this phage, the first primary three-dimensional reconstruction of its virions was performed. The structure of the phage ϕ24B tail is described. It was shown that the adsorption apparatus of this virus is represented by six thin lateral fibrils and an axial fibril located at the end of the tail. This arrangement of the tail structure is consistent with the previously proposed hypothesis based on analysis of the receptor binding proteins (RBPs) of this bacteriophage.
Keywords
Full Text
На сегодняшний день набирают актуальность работы по изучению патогенных вариантов Escherichia coli. Наравне с бактериями клинически значимой группы ESKAPE, многие штаммы E. coli также характеризуются наличием множественной лекарственной устойчивости, что послужило основанием для введения их в группу ESKAPE (Blake, Choi и соавт., 2021). Патогенность E. coli может варьировать от штамма к штамму и обычно связана как со способностью клеток к адгезии на слизистой кишечника и инфильтрации эпителия, так и с продукцией термолабильного или термостабильного энтеротоксинов, либо шигаподобного токсина (Riley, 2014). Шигатоксигенные E. coli (Shiga toxigenic E. coli, STEC) вызывают опасные токсикоинфекции у людей, являясь распространенной причиной диарей, геморрагического колита и гемолитико-уремического синдрома (Trachtman et al., 2012). Обнаружение STEC у сельскохозяйственных животных, которые могут быть бессимптомными носителями, приводит к значительным экономическим потерям в животноводстве (Callaway et al., 2009; Todd, 1989).
Бактерии группы STEC приобрели способность синтезировать шигаподобный токсин вследствие лизогенной конверсии. Умеренные бактериофаги, несущие гены токсина stxA и stxB, включены в группу Stx-конвертирующих фагов (Stx-фагов). Stx-фаги принадлежат к классу Caudoviricetes, при этом их вирионы могут быть представлены морфотипами сифовирусов, подовирусов и миовирусов (Muniesa et al., 2004). Большинство Stx-конвертирующих бактериофагов обладает лямбдоидным типом организации генома (Muniesa et al., 2004), однако сообщается и о нелямбдоидных Eru1-фагах, также кодирующих гены группы stx (Llarena et al., 2021). Для лямбдоидных Stx-фагов характерно расположение генов токсина в кластере поздних генов, что подразумевает экспрессию шигаподобного токсина в ходе литической инфекции и его высвобождении вместе с фаговым потомством при лизисе клеток (Sausset et al., 2020). Большинство Stx-фагов присутствует в виде профагов в геномах различных STEC, периодически распространяясь в виде вирусных частиц при индукции профагов из лизогенов. Индукция Stx-профагов иногда является спонтанной, но часто вызвана воздействием стрессовых факторов. В связи с этим применение антибиотиков для терапии STEC-инфекций не рекомендовано, поскольку оно вызывает сильный стресс у лизогенов, приводя к их массовому лизису и резкому повышению количества токсина Stx в кишечнике (Freedman et al., 2016; Sausset et al., 2020).
Бактериофаг ϕ24B, длина генома которого составляет 57677 п. н. (Smith et al., 2012) (GenBank: HM208303.1), и его близкие родственники представляют наиболее часто встречающиеся Stx-профаги. Частицы фага ϕ24B имеют морфологические особенности, характерные для подовирусов, поскольку имеют короткий хвост (Allison et al., 2003). Показано, что этот фаг in vitro инфицирует широкий спектр лишенных полноценного О-антигена (т. н. rough) штаммов E. сoli, поскольку распознает в качестве конечного рецептора консервативный и жизненно важный белок внешней мембраны BamA (Rollauer et al., 2015; Smith et al., 2007). Также для ряда исследованных О-серотипов E. coli продемонстрировано, что наличие О-антигена, напротив, подавляет адсорбцию данного бактериофага на поверхности клетки, препятствуя лизогенизации и литической инфекции (Golomidova et al., 2021). Это может быть объяснено тем, что исследованные варианты О-антигена экранируют доступ фаговых рецептор-распознающих белков к конечному рецептору фага в составе внешней мембраны (Kulikov et al., 2019).
Несмотря на множество исследований в области биологии STEC, механизмы адсорбции Stx-конвертирующих бактериофагов, являющейся первопричиной формирования шигатоксигенного фенотипа E. coli, остаются пока не выясненными. Установление механизма адсорбции бактериофага ϕ24B на поверхности чувствительных к фагу клеток хозяев, в частности, механизма распознавания консервативного белка E. coli BamA, представляет собой важную задачу фундаментального значения. Эти знания, в совокупности с получением вирулентных мутантов данного вируса или рекомбинацией с другими вирулентными фагами, использующими идентифицированные первичные рецепторы, откроет возможности для инженерии терапевтических колифагов широкого спектра.
Одним из наиболее прогрессивных методов анализа структуры высокомолекулярных комплексов, в частности, вирусных частиц, сегодня оказывается трехмерная реконструкция на основе криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) (de Oliveira, Silva, 2021). Одним из серьезных ограничений метода оказывается то, что препараты вирусов, используемые в крио-ЭМ, должны содержать морфологически интактные и однородные фаги в высоких концентрациях, свободные от других субмикроскопических объектов.
Для бактериофага ϕ24B данный метод долгое время не мог быть использован в связи с трудностями получения высококонцентрированного и при этом достаточно чистого препарата частиц данного вируса, пригодного для крио-ЭМ. Благодаря оптимизации способов получения фаговых лизатов и введению новых стадий в процесс их концентрирования и очистки, мы преодолели технические затруднения. Ранние попытки получения нами препарата фага показали, что очистка данного бактериофага путем ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия приводит к понижению биологического титра в препарате на несколько порядков и нежелательным морфологическим изменениям вирионов (данные не приведены). В дальнейшем вместо градиента хлористого цезия мы применили очистку в градиенте сахарозы, которая является более биосовместимой. Также для ϕ24B было показано, что вирусные частицы из лизатов обычно соочищаются с бактериальными жгутиками, поэтому в рамках новой методики фаговые лизаты мы получали индукцией профагов из лизогенного штамма E. coli 4sR:24B, подготовленного нами на основе лабораторного штамма фага ϕ24B:Cat, полученного от H. E. Allison, и лишенного жгутиков бактериального штамма E. coli 4sR из нашей коллекции.
Индукцию профагов производили с использованием митомицина С и при низкой аэрации среды, что позволило не только увеличить выход фага, но и уменьшить содержание в образце мембранных везикул, мешавших сбору данных крио-ЭМ. Далее фаговые лизаты осветляли путем центрифугирования при 15000 g в течение 20 мин. Все последующие стадии ультрацентрифугирования проводили при 75000 g, максимальных параметрах ускорения при разгоне и остановке центрифуги и температуре 20°C в течение часа. Осветленные лизаты сначала концентрировали ультрацентрифугированием в угловом роторе Beckman 45Ti. Далее сконцентрированные образцы ресуспендировали в SM-буфере (8 мМ MgSO4, 100 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HСl pH 7.5) и наслаивали на ступенчатый градиент плотности-вязкости сахарозы (20‒30‒40‒50‒60%) в буфере (50 мМ Tris-HCl, pH 7.2, 50 мМ NaCl), после чего подвергали ультрацентрифугированию в бакетном роторе Beckman SW50.1. После центрифугирования отбирали очищенный фаг на границе слоев, соответствующих 40 и 50% сахарозы, предварительно удаляя все верхние слои, содержащие примеси и поврежденные вирионы. После очистки в градиенте сахарозы биологический титр фага составлял порядка 5 × 1011 БОЕ/мл. Далее препарат подвергался диализу против SM-буфера и дополнительной стадии концентрирования на фреоне: очищенный препарат разводили в SM-буфере и наносили на слой фреона CFC-113 (плотность 1.56 г/см3), после чего центрифугировали при тех же параметрах в бакетном роторе Beckman SW50.1. Значения биологического титра фага в сконцентрированном таким образом препарате достигали 6.5 × 1012 БОЕ/мл. Фреон, практически не растворимый в воде и обладающий высокой плотностью, служил амортизирующей подушкой, предотвращающей агрегацию и поломку вирионов в центрифужном поле.
Полученный таким образом препарат фага ϕ24B обладал всеми необходимыми характеристиками для успешного применения в крио-ЭМ. Перед непосредственным анализом фаговых частиц методом крио-ЭМ нами были получены при помощи просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) изображения вирионов с высоким разрешением (рис. 1a).
Рис. 1. Структурные особенности бактериофага ϕ24B: a – изображение вирионов, полученное при помощи ПЭМ; б – трехмерная реконструкция целого вириона; в – трехмерная реконструкция хвоста (градиент цвета от красного к синему отражает расстояние от центральной оси хвоста)
Препарат был нанесен на сеточки с пористой углеродной подложкой Quantifoil R1.2/1.3 и витрифицирован в жидком этане на установке Vitrobot IV (“ThermoScientific”, Нидерланды). Наборы крио-ЭМ данных были получены с использованием просвечивающего криоэлектронного микроскопа Titan Krios (“ThermoScientific”, Нидерланды), оснащенного детектором K3 (“Gatan”, США). Обработка данных производилась методом анализа единичных частиц в программном обеспечении cryoSPARC. На основе результатов крио-ЭМ получены предварительные реконструкции капсида и адсорбционного аппарата с разрешением 4.0‒6.0 Å (рис. 1б, 1в).
Полученная трехмерная реконструкция вирионов ϕ24B демонстрирует особенности морфологии фаговых частиц в целом (рис. 1б) и его хвостовой структуры в частности (рис. 1в). Фаговый капсид обладает икосаэдрической симметрией и образован белками гексамеров (в областях граней) и белками пентамеров (в областях вершин). Также заметно наличие пока не идентифицированных в геноме фага декорирующих белков.
В геноме бактериофага ϕ24B аннотированы гены потенциальных рецептор-распознающих белков 56 и 61. Мы полагаем, что белок gp61 образует хвостовые шипы, ответственные за распознавание пока не установленного первичного рецептора. Это предположение подтверждается наличием значительной гомологии (идентичность 81.55%, в основном в областях С-концевых рецептор-распознающих участков; покрытие 93%) между последовательностями аминокислотных остатков белков gp61 фага ϕ24B и боковых фибрилл бактериофага λ_2B8 (Mathieu et al., 2020) (GenBank: LR595859.1). Дополнительным свидетельством в пользу нашей гипотезы является то, что адсорбция фага λ_2B8, любезно предоставленного M. A. Petit, не зависела от наличия на поверхности клеток-хозяев белка BamA исходного “дикого” типа конечного рецептора фага ϕ24B (данные не приведены).
По распределению электронной плотности в области адсорбционного аппарата можно говорить о наличии шести хвостовых шипов и осевой фибрилле, по своей форме напоминающей предсказанную при помощи алгоритма AlphaFold2 структуру тримера gp56. Это может указывать на возможное участие белка gp56 в необратимой адсорбции фага ϕ24B. Структура осевой фибриллы фага ϕ24B также напоминает хвостовую иглу цианофага Pam1 (Zhang et al., 2022) (GenBank: ON014753.1), чей адаптерный белок gp8 является отдаленным гомологом адаптерного белка gp57 фага ϕ24B. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения об участии белка gp56 в необратимой адсорбции фага ϕ24B.
СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ
Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
About the authors
A. S. Kuznetsov
Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences
Author for correspondence.
Email: alexbluesking@gmail.com
Russian Federation, Moscow
A. V. Moiseenko
Lomonosov Moscow State University
Email: alexbluesking@gmail.com
Russian Federation, Moscow
E. E. Kulikov
Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences
Email: alexbluesking@gmail.com
Russian Federation, Moscow
A. V. Letarov
Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University
Email: alexbluesking@gmail.com
Russian Federation, Moscow; Moscow
References
- Allison H. E., Sergeant M. J., James C. E., Saunders J. R., Smith D. L., Sharp R. J., Marks T. S., McCarthy A. J. Immunity profiles of wild-type and recombinant shiga-like toxin-encoding bacteriophages and characterization of novel double lysogens // Infect. Immun. 2003. V. 71. P. 3409‒3418.
- Blake K. S., Choi J., Dantas G. Approaches for characterizing and tracking hospital-associated multidrug-resistant bacteria // Cell. Mol. Life Sci. 2021. V. 78. P. 2585‒2606.
- Callaway T. R., Carr M. A., Edrington T. S., Anderson R. C., Nisbet D. J. Diet, Escherichia coli O157:H7, and cattle: a review after 10 years // Curr. Iss. Mol. Biol. 2009. V. 11. P. 67‒79.
- de Oliveira G. A., Silva J. L. Cryo-EM to visualize the structural organization of viruses // Curr. Opin. Virol. 2021. V. 49. P. 86‒91.
- Freedman S. B., Xie J., Neufeld M. S., Hamilton W. L., Hartling L., Tarr P. I., Alberta Provincial Pediatric Enteric Infection T., Nettel-Aguirre A., Chuck A., Lee B., Johnson D., Currie G., Talbot J., Jiang J., Dickinson J., Kellner J., MacDonald J., Svenson L., Chui L., Louie M., Lavoie M., Eltorki M., Vanderkooi O., Tellier R., Ali S., Drews S., Graham T., Pang X. L. Shiga toxin-producing Escherichia coli infection, antibiotics, and risk of developing hemolytic uremic syndrome: a meta-analysis // Clin. Infect. Dis. 2016. V. 62. P. 1251‒1258.
- Golomidova A. K., Efimov A. D., Kulikov E. E., Kuznetsov A. S., Belalov I. S., Letarov A. V. O antigen restricts lysogenization of non-O157 Escherichia coli strains by Stx-converting bacteriophage phi24B // Sci Rep. 2021. V. 11. Art. 3035.
- Kulikov E. E., Golomidova A. K., Prokhorov N. S., Ivanov P. A., Letarov A. V. High-throughput LPS profiling as a tool for revealing of bacteriophage infection strategies // Sci. Rep. 2019. V. 9. Art. 2958.
- Llarena A. K., Aspholm M., O’Sullivan K., Wegrzyn G., Lindback T. Replication region analysis reveals non-lambdoid Shiga toxin converting bacteriophages // Front. Microbiol. 2021. V. 12. Art. 640945.
- Mathieu A., Dion M., Deng L., Tremblay D., Moncaut E., Shah S. A., Stokholm J., Krogfelt K. A., Schjorring S., Bisgaard H., Nielsen D. S., Moineau S., Petit M. A. Virulent coliphages in 1-year-old children fecal samples are fewer, but more infectious than temperate coliphages // Nat. Commun. 2020. V. 11. Art. 378.
- Muniesa M., Serra-Moreno R., Jofre J. Free Shiga toxin bacteriophages isolated from sewage showed diversity although the stx genes appeared conserved // Environ. Microbiol. 2004. V. 6. P. 716‒725.
- Riley L. W. Pandemic lineages of extraintestinal pathogenic Escherichia coli // Clin. Microbiol. Infect. 2014. V. 20. P. 380‒390.
- Rollauer S. E., Sooreshjani M. A., Noinaj N., Buchanan S. K. Outer membrane protein biogenesis in Gram-negative bacteria // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2015. V. 370. Art. 1679.
- Sausset R., Petit M. A., Gaboriau-Routhiau V., De Paepe M. New insights into intestinal phages // Mucosal Immunol. 2020. V. 13. P. 205‒215.
- Smith D. L., James C. E., Sergeant M. J., Yaxian Y., Saunders J. R., McCarthy A.J., Allison H. E. Short-tailed stx phages exploit the conserved YaeT protein to disseminate Shiga toxin genes among enterobacteria // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 7223‒7233.
- Smith D. L., Rooks D. J., Fogg P. C., Darby A. C., Thomson N. R., McCarthy A.J., Allison H. E. Comparative genomics of Shiga toxin encoding bacteriophages // BMC Genomics. 2012. V. 13. Art. 311.
- Todd E. C.D. Preliminary estimates of costs of foodborne disease in Canada and costs to reduce salmonellosis // J. Food Prot. 1989. V. 52. P. 586‒594.
- Trachtman H., Austin C., Lewinski M., Stahl R. A. Renal and neurological involvement in typical Shiga toxin-associated HUS // Nat. Rev. Nephrol. 2012. V. 8. P. 658‒669.
- Zhang J. T., Yang F., Du K., Li W. F., Chen Y., Jiang Y. L., Li Q., Zhou C. Z. Structure and assembly pattern of a freshwater short-tailed cyanophage Pam1 // Structure. 2022. V. 30. P. 240‒251. e244.
Supplementary files
