Effect of O-Polysaccharide Modifications on Successful Plant Colonization by Bacteria

Full Text

Грамотрицательные бактерии на поверхности наружной мембраны содержат липополисахаридные молекулы (ЛПС), занимающие большую часть поверхности клеточной стенки (Lerouge, Vanderleyden, 2002). В состав ЛПС входит липид А, связующий олигосахарид (кор) и высоко вариабельный О-полисахарид (ОПС). ОПС представляет собой полимер повторяющихся олигосахаридных звеньев, различающихся по моносахаридному составу, гликозидным связям и физико-химическим свойствам. При этом за счет своей экспонированности на поверхности клетки ОПС вовлечен во взаимодействия бактерий с клетками животных и растений (Alexander, Rietschel, 2001).

Почвенные и ризосферные бактерии почти всегда содержат в своем геноме большое количество профагов и других генов, имеющих вирусное происхождение (Roy et al., 2020; Sigida et al., 2020). Активность генов фагов в бактериальных клетках может приводить к модификации ОПС через их нестехиометрическое метилирование, ацетилирование, глюкозилирование или другие реакции (Lerouge, Vanderleyden, 2002; Sigida et al., 2020; Teh et al., 2020). Подобные изменения поверхностных полисахаридов защищают бактериальные клетки от новых бактериофагов, для которых молекулами узнавания являются немодифицированные ОПС. В свою очередь, введение метильных или ацильных групп в ОПС приводит к повышению гидрофобности бактериальной поверхности и, соответственно, изменению физико-химических свойств клеток. Отражением активности вирусных механизмов модификации бактериальных ОПС может служить преобладание “R-формы” колоний у почвенных грамотрицательных бактерий. Ранее у ризосферного штамма Azospirillum brasilense Sp7 была продемонстрирована R‒S-диссоциация без характерной для этого процесса у энтеробактерий утраты ОПС (Матора и соавт., 2003). Анализ структуры повторяющихся звеньев ОПС штамма Sp7 показал присутствие нестехиометрического метилирования одного из остатков рамнозы (Sigida et al., 2013). Таким образом, повышение степени метилирования ОПС приводит к гидрофобному фенотипу “R-форма”, а снижение — к гидрофильному фенотипу “S-форма”.

Целью данной работы было изучить связь между гидрофобностью бактериальных клеток и их адсорбцией на поверхности корней картофеля, а также рассмотреть возможность участия генов профагов нестехиметрического ацетилирования ОПС в повышении активности колонизации ризосферными бактериями растения-партнера.

В работе были использованы микрорастения картофеля сорта Невский. Штаммы ризобактерий родов Azospirillum, Enterobacter, Ensifer, Ochrobactrum и Pseudomonas были получены из коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН. Бактериальные культуры выращивали на малатно-солевой среде (Tkachenko et al., 2015) в течение 18 ч при 35C. Клетки дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (PBS; рН 7.2). Для определения гидрофобности бактериальных клеток использовали тест сродства к н-гексадекану (Krepsky et al., 2003).

Адсорбцию на корнях растений оценивали для бактериальных суспензий с оптической плотностью А₆₀₀ = 0.1 при 600 нм. Десятисуточные микрорастения картофеля (Solanum tuberosum L. сорт Невский) из культуры in vitro на 30 мин погружали в суспензию бактерий, после чего дважды по 10 мин при встряхивании 120 об./мин отмывали в стерильном PBS. Для каждого варианта для анализа отбирали 10 см корней, из которых получали гомогенат в 1 мл стерильного PBS. Готовили серию десятикратных разведений с последующим высевом на агаризованную малатно-солевую среду. Чашки Петри инкубировали в течение 3 сут при 35C, после чего подсчитывали количество сформированных колоний для различных разведений.

Результаты соотнесения гидрофобности бактериальных клеток с уровнем их адсорбции на корнях микрорастений картофеля приведены на рис. 1.

 

Рис. 1. Зависимость адгезивной активности ризосферных штаммов на корнях картофеля от индекса гидрофобности бактериальных клеток. 1 — Ensifer adherens T1Ks14; 2 — Pseudomonas chlororaphis K3; 3 — Enterobacter ludwigii K7; 4 — Ochrobactrum cytisi IPA7.2; 5 — Azospirillum lipoferum SR65; 6 — Ochrobactrum quorumnocens T1Kr02; 7 — Azospirillum brasilense Sp7; 8 — Azospirillum lipoferum SR66; 9 — Azospirillum brasilense Jm6B2.

 

Установлена прямая зависимость количества прикрепляемых за 30 мин бактерий от индекса гидрофобности. Так, клетки штаммов с гидрофильной поверхностью (Ensifer adhaerens T1Ks14 и Pseudomonas chlororaphis K3) адсорбировались на корнях в незначительном количестве (менее 10³ КОЕ на 1 см корня). Для штаммов со слабогидрофобной поверхностью клеток (Enterobacter ludwigii K7, Ochrobactrum cytisi IPA7.2, Azospirillum lipoferum SR65 и Ochrobactrum quorumnocens T1Kr02) выявлено до 10⁴ КОЕ/см корня. Адсорбция среднегидрофильных штаммов (Azospirillum brasilense Sp7 и Azospirillum lipoferum SR66) на корнях картофеля была еще выше и составила 1.3 × 10⁴ и 2.2 × 10⁴ КОЕ/см. И максимальное количество КОЕ на корнях было выявлено для штамма с сильногидрофобными клетками (Azospirillum brasilense Jm6B2) — 8 × 10⁴ КОЕ/см. Следует отметить, что штаммы Azospirillum brasilense Sp7, A. lipoferum SR66 и A. brasilense Jm6B2 в составе повторяющихся звеньев О-полисахаридов (дополнительные материалы, табл. S1) содержат нестехиометрическое метилирование (Sp7 и Jm6B2) или ацетилирование (SR66) остатков L-рамнозы (Fedonenko et al., 2015), что увеличивает гидрофобность поверхности клеток этих штаммов и повышает адсорбцию на корнях растений.

В литературе описано, что ацетилирование О-полисахарида грамотрицательных ризосферных бактерий снижает активность запуска иммунных реакций растительного партнера при формировании растительно-микробного взаимодействия (Vanacore et al., 2022). Это может приводить к большей выживаемости адсорбированных на поверхности корней бактерий и, как следствие, к более успешной колонизации растений. В связи с тем, что степень метилирования или ацетилирования О-полисахаридов штаммов IPA7.2, Sp7, Jm6B2 и SR66 составляет от 40 до 65% (Fedonenko et al., 2015; Sigida et al., 2020), мы предполагаем, что в оптимальных условиях культивирования бактерий активность модификации гликанов ниже скорости биосинтеза новых О-полисахаридов. Причинами для этого могут быть как недостаток восстановительных субстратов для модификаций, так и сниженная активность генов профагов. Однако при снижении скорости роста бактериальной культуры из-за неоптимальных или стрессовых условиях биосинтез О-полисахарида должен замедляться или останавливаться, что даже при сохранении активности профаговых генов модификации поверхностных гликанов должно приводить к повышению процента модифицированных повторяющихся звеньев. Тем более что абиотический стресс может быть активатором генов профагов (Choi et al., 2010). Таким образом, бактерии в оптимальных условиях имеют более гидрофильный О-полисахарид, что снижает адсорбцию микробных клеток на корнях растений, а при контакте с растительными клетками активизирует запуск фитоиммунных реакций, приводящих к подавлению бактериальной колонизации поверхности корней. В стрессовых же для бактерий условиях модификации О-полисахаридов приводят к повышению гидрофобности поверхности клеток, что способствует адсорбции бактерий на корнях и снижает уровень фитоиммунных реакций. В итоге бактериальная колонизация растений проходит более успешно. Информация о генетике и физико-химических свойствах клеток ризосферных штаммов должна учитываться при внедрении ризобактерий в качестве биоудобрений в тех вариантах, когда предполагается прикрепление вегетативных бактериальных клеток к растениям.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность О.В. Ткаченко за предоставление растительного материала микроклонов картофеля из in vitro-коллекции кафедры “Растениеводство, селекция и генетика” Агрономического факультета Саратовского государственного университета генетики, биотехнологии и инженерии им. Н.И. Вавилова.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 22-26-00293).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

 

Таблица S1. Структуры повторяющихся олигосахаридных звеньев О-полисахаридов использованных в работе штаммов.

Штамм	Структура повторяющихся звеньев О-полисахарида	Примечание
Ensifer adhaerens T1Ks14	Нет данных
Pseudomonas chlororaphis K3	$\to$4)-α-D-GalpNac-(1$\to$3)-β-D-QuipNAc-(1$\to$6)-α-D-GlcpNac-(1$\to$                       | β-D-GlcpNac-(1$\to$3)	Предварительные неопубликованные данные
Enterobacter ludwigii K7	$\to$8)-β-Psep5Ac7Ac-(2$\to$2)-β-L-Rhap-(1$\to$4)-α-L-Rhap-(1$\to$3)-α-D-Galp-(1$\to$	Filatov et al., 2021
Ochrobactrum cytisi IPA7.2	~50% 6OAc                                                                                           | $\to$6)-α-D-Glcp-(1$\to$4)-β-D-ManpNacA-(1$\to$4)-β-D-GlcpNac-(1$\to$                                                                                           |                                                                                        3OAc	Sigida et al., 2020
Azospirillum lipoferum SR65	$\to$2)-α-L-Rhap-(1$\to$3)-α-L-Rhap-(1$\to$3)-α-L-Rhap-(1$\to$                       | β-D-Glcp-(1-3)	Fedonenko et al., 2008
Ochrobactrum quorumnocens T1Kr02	$\to$2)-β-D-Fucf-(1$\to$3)-β-D-Fucp-(1$\to$2)-β-D-Fucf(1$\to$3)-β-D-Fucp-(1$\to$                                                                               $$\begin{gathered} 3 \\ | \\ OAc \end{gathered}$$	Предварительные неопубликованные данные
Azospirillum brasilense Sp7	$\to$3)-α-L-Rhap-(1$\to$3)-β-D-Galp-(1$\to$3)-β-D-GlcpNAc-(1$\to$  α-D-Rhap                   2                                                        4                               1                   |                                                         $\uparrow$                              $\downarrow$                  OMe $~40\%$                                       1                               3                                                                      -α-L-Fucp        $\to 4)-\alpha -L-Fucp-(1\to 4)-\beta -D-Xylp-(1\to$	Sigida et al., 2013
Azospirillum lipoferum SR66	β-D-Glcp          1                                                                                        OAc$~60-65\%$          $\downarrow$                                                                                          |          3                                                                                           2 $\to 2)-\alpha -L-Rhap-(1\to 3)-\alpha -L-Rhap-(1\to 3)-\alpha -L-Rhap-(1\to$	Федоненко с соавт., 2011
Azospirillum brasilense Jm6B2	α-D-Rhap3OMe ~50%             1             $\downarrow$             3 $\to 4)-\alpha -L-Fucp-(1\to 4)-\beta -D-Xylp-(1\to$	Boyko et al., 2012

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Федоненко Ю.П., Бойко А.С., Здоровенко Э.Л., Коннова С.А., Шашков А.С., Игнатов В.В., Книрель Ю.А. Структурные особенности О-специфических полисахаридов бактерий Azospirillum серогруппы III // Биохимия. 2011. Т. 76. № 7. С. 976–982.

Fedonenko Y.P., Boiko A.S., Zdorovenko E.L., Konnova S.A., Shashkov A.S., Ignatov V.V., Knirel Y.A. Structural peculiarities of the O-specific polysaccharides of Azospirillum bacteria of serogroup III // Biochemistry (Moscow). 2011. V. 76. P. 797–802.

Boyko A.S., Dmitrenok A.S., Fedonenko Y.P., Zdorovenko E.L., Konnova S.A., Knirel Y.A., Ignatov V.V. Structural analysis of the O-polysaccharide of the lipopolysaccharide from Azospirillum brasilense Jm6B2 containing 3-O-methyl-D-rhamnose (D-acofriose) // Carbohydr. Res. 2012. V. 355. P. 92–95.

Fedonenko Y.P., Zdorovenko E.L., Konnova S.A., Kachala V.V., Ignatov V.V. Structural analysis of the O-antigen of the lipopolysaccharide from Azospirillum lipoferum SR65 // Carbohydr. Res. 2008. V. 343. P. 2841–2844.

Filatov A.V., Perepelov A.V., Shashkov A.S., Burygin G.L., Gogoleva N.E., Khlopko Y.A., Grinev V.S. Structure and genetics of the O-antigen of Enterobacter cloacae K7 containing di-N-acetylpseudaminic acid // Carbohydr. Res. 2021. V. 508. Art. 108392.

Sigida E.N., Fedonenko Y.P., Shashkov A.S., Zdorovenko E.L., Konnova S.A., Ignatov V.V., Knirel Y.A. Structural studies of the O-specific polysaccharide(s) from the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense type strain Sp7 // Carbohydr. Res. 2013. V. 380. P. 76–80.

Sigida E.N., Kargapolova K.Y., Shashkov A.S., Zdorovenko E.L., Ponomaryova T.S., Meshcheryakova A.A., Tkachenko O.V., Burygin G.L., Knirel Y.A. Structure, gene cluster of the O antigen and biological activity of the lipopolysaccharide from the rhizospheric bacterium Ochrobactrum cytisi IPA7.2 // Int. J. Biol. Macromol. 2020. V. 154. P. 1375–1381.

About the authors

G. L. Burygin

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences; Saratov State University; Saratov State University of Genetics, Biotechnology, and Engineering named after N.I. Vavilov

Author for correspondence.
Email: burygingl@gmail.com
Russian Federation, Saratov, 410049; Saratov, 410012; Saratov, 410012

A. A. Khanina

Saratov State University of Genetics, Biotechnology, and Engineering named after N.I. Vavilov

Email: burygingl@gmail.com
Russian Federation, Saratov, 410012

M. V. Filippova

Saratov State University of Genetics, Biotechnology, and Engineering named after N.I. Vavilov

Email: burygingl@gmail.com
Russian Federation, Saratov, 410012

References

Supplementary files