Distinction of Fusarium temperatum and F. subglutinans in the F. fujikuroi species complex

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Разнообразие и свойства представителей комплекса видов Fusarium fujikuroi (FFSC) широко изучается с использованием различных методов (Nirenberg, O’Donnell, 1998; O’Donnell et al., 2000; Qiu et al., 2020; Yilmaz et al., 2021; Crous et al., 2021). Виды FFSC характеризуют как относительно слабые патогены или эндофиты растений, которые обитают практически повсеместно, но преимущественно в сухом теплом климате. Большинство грибов Fusarium являются полифагами, но среди FFSC некоторые виды имеют трофическую ассоциацию — они способны заражать один род или вид растений (Leslie, Summerell, 2006; Britz et al., 2002; Lima et al., 2012; Costa et al., 2021; Dewing et al., 2022).

Процесс бесполого и полового размножения аскомицетов изучены не полностью (Glenn et al., 2004; Zheng et al., 2012). Морфология конидиогенных клеток и разнообразие конидий относительно мало изучены, но считаются ценными диагностическими характеристиками при идентификации видов FFSC (Vermeulen et al., 2021). Между тем изменчивость этих грибов и зависимость анализируемых характеристик от условий культивирования особенно затрудняет разграничение близкородственных, морфологически сходных видов (O’Donnell et al., 1998, 2000; Vermeulen et al., 2021).

Анализ филогенетических связей грибов, принадлежащих к FFSC, привел к тому, что в последние годы наблюдается всплеск научных публикаций, в том числе с описанием новых видов (Qiu et al., 2020; Crous et al., 2021; Vermeulen et al., 2021; Yilmaz et al., 2021). Грибы этой группы продуцируют микотоксины из трех основных групп, а именно фумонизины (ФУМ), боверицин (БОВ) и энниатины, монилиформин (МОН); однако образование этих токсичных метаболитов видоспецифично (Leslie, Summerell, 2006).

Входящий в комплекс FFSC вид Fusarium subglutinans (Wollenw. et Reinking) P.E. Nelson, Toussoun et Marasas описан в 1983 г. (Nelson et al., 1983). Fusarium subglutinans — глобально распространенный патоген, в основном вызывающий гниль стеблей и початков кукурузы (Fumero et al., 2015; Stępień et al., 2019). Помимо кукурузы, F. subglutinans также встречается на других растениях (Cosic et al., 2007; Okello, Mathew, 2019; Wang et al., 2022), вредителях (Demirözer, 2019) и человеке (Campos-Macías et al., 2013). Выявленная внутривидовая изменчивость F. subglutinans по молекулярно-генетическими признакам и способности продуцировать токсины позволила выделить две группы: F. subglutinans группа 1 и F. subglutinans группа 2 (Steenkamp et al., 2002; Moretti et al., 2008). Затем на основании данных филогенетического анализа F. subglutinans группу 1 описали как новый вид — F. temperatum Scaufl. et Munaut (Scauflaire et al., 2011). Обычно F. temperatum выделяют из кукурузы (Shin et al., 2014; Czembor et al., 2015; Fumero et al., 2015; Lanza et al., 2016; Zhang et al., 2016; Boutigny et al., 2017; Stępień et al., 2019; Fallahi et al., 2019; Pfordt et al., 2020; Xu et al., 2022), однако единичные находки этого вида отмечены на Sorghum bicolor L. Moench в Сербии (Levic et al., 2019) и на Capsicum pubescens Ruiz et Pav. в Мексике (Perez-Vazquez et al., 2022). Кроме того, сообщалось о микозах человека, вызванных грибом F. temperatum (Al-Hatmi et al., 2016; Yilmaz et al., 2021).

В коллекции лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР (MFG) при проведении молекулярно-генетических исследований различных грибов FFSC, предварительно идентифицированные по морфологическим признакам, были выявлены два штамма, относящиеся к виду F. temperatum, выделенные из рапса и пшеницы в 2011–2019 гг.

Цель нашего исследования заключалась в установлении различий между генетически охарактеризованными штаммами F. temperatum и F. subglutinans по морфологическим, физиологическим и биохимическим свойствам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы грибов. Для проведения сравнительного анализа признаков вида F. temperatum в исследование были взяты два штамма филогенетически наиболее близкого вида F. subglutinans, выделенные из образцов кукурузы в 1993–1997 гг.

Секвенирование ДНК и филогенетический анализ. Анализируемые штаммы F. temperatum и F. subglutinans выращивали на картофельно-сахарозной агаризованной среде (КСА) при 24^օC в течение семи сут. Выделение ДНК из 10–50 мг мицелия, собранного с поверхности колонии гриба, проводили с помощью набора Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Литва) согласно инструкции производителя.

Амплификацию фрагментов генов фактора элонгации трансляции 1-α (TEF), β-тубулина (tub) и гена, кодирующего вторую большую субъединицу РНК полимеразы II (RPB2), проводили с использованием праймеров и протоколов авторов (O’Donnell, Cigelnik, 1997; O’Donnell et al., 1998; Liu et al., 1999; Jewell, Hsiang, 2013). Нуклеотидную последовательность фрагментов определяли на секвенаторе ABIPrism 3500 (Applied Biosystems, Hitachi, Япония) с использованием набора реактивов BigDye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Процедуры ручного редактирования хроматограмм и получение консенсусных нуклеотидных последовательностей проводили в программе Vector NTI Advance 10. Нуклеотидные последовательности с помощью инструмента BLAST были проверены на сходство с депонированными в международной информационной базе данных NCBI GenBank (табл. 1). Выравнивание нуклеотидных последовательностей анализируемых и репрезентативных штаммов, а также их филогенетический анализ производили методами максимального правдоподобия (maximum likelihood, ML) и максимальной экономии (maximum parsimony; MP) с использованием программы MEGA X 10.1 (Kumar et al., 2018). Нуклеотидные последовательности анализируемых штаммов были размещены в базе данных NCBI GenBank. Лучшая модель замены нуклеотидов, используемая для построения деревьев ML (K2 + G), также была определена в MEGA X 10.1. Дополнительно рассчитывали байесовскую вероятность (Bayesian probability, BP) с помощью MrBayes v. 3.2.1 на платформе Armadillo 1.1 (Lord et al., 2012). Достоверность топологии филогенетических деревьев определяли посредством бутстреп-анализа (1000 повторностей).

Таблица 1. Информация о штаммах Fusarium, включенных в исследование

Примечание. *Акронимы коллекций: CBS — Коллекция культур Centraalbureau voor Schimmelcultures, Центр биоразнообразия грибов, Утрехт, Нидерланды; ITEM — Коллекция микроскопических грибов Agro-Food, Бари, Италия; MFG — коллекция культур лаборатории микологии и фитопатологии Всероссийского института защиты растений (ВИЗР), Санкт-Петербург, Россия; MUCL — Коллекция агропродовольственных и экологических грибов, Лувен-ла-Нев, Бельгия; NRRL — коллекция культур Службы сельскохозяйственных исследований, Пеория, Иллинойс, США; RC — Коллекция культур кафедры микробиологии и иммунологии Национального университета Рио-Куарто, Рио-Куарто, Аргентина. Полужирным выделены штаммы из коллекции MFG. **Т — типовой штамм.

Определение типа спаривания. Определение МАТl-1 или МАТl-2 идиоморфы локуса МАТ, ответственного за тип спаривания, проводили с помощью ПЦР со специфичными праймерами, разработанными для определения типа спаривания грибов комплекса видов FFSC (Steenkamp et al., 2000).

Морфологическая характеристика штаммов. Для диагностики фенотипа колонии и оценки скорости роста штаммы F. temperatum и F. subglutinans выращивали при 25^օC на картофельно-декстрозном агаре (КДА) и агаре Чапека (Cz) в течение 5–14 сут при трех режимах освещения: полная темнота, 12 ч ближний ультрафиолет (УФ)/12 ч темнота.

В центр чашки Петри на агаризованную среду помещали диск культуры гриба (4 мм), предварительно выращенной на КСА. Диаметр колонии, растущей на агаризованной среде, измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях на пятые и седьмые сут роста. Скорость роста колонии рассчитывали, как радиус колонии (без учета диска исходного инокулюма), отнесенный к суткам роста в момент учета. Эксперименты проводили в двух повторностях.

Сравнение формы и размеров конидий, числа перегородок, расположения конидий проводили при выращивании культур Fusarium на агаризованной среде Ниренберг (SNA) в условиях УФ в течение 7 сут. По возможности выполняли 20–50 измерений каждой структуры. Морфологические признаки штаммов сравнивали с характеристиками F. subglutinans и F. temperatum, описанными ранее (Scauflaire et al., 2011). В визуализацию способа образования конидий проводили с помощью кусочка прозрачной ленты шириной 2 см (Scotch), которую клейкой стороной сначала прижимали к поверхности культуры, а затем приклеивали к предметному стеклу и рассматривали под микроскопом.

Изучение микроструктур проводили с помощью микроскопов BX53 и SZX16 (Olympus Corporation, Япония), фотосъемку осуществляли подключенной к микроскопу камерой Jenoptik Gryphax PROKYON (Jenoptik AG, Германия). Редактирование изображений проводили в программе Adobe Photoshop CC2018 (Adobe System, США).

Скрещивание штаммов Fusarium противоположных типов спаривания проводили на морковной агаризованной среде, как описано Leslie и Summerell (2006). Кроме того, штаммы культивировали на КДА, куда помещали 1–3-сантиметровые свежие отрезки стеблей и колосков пырея (Elytrigia sp.) после их стерилизации 70%-м этиловым спиртом. После скрещивания культуры выдерживали при 20–25^օC и режиме освещения 12 ч освещение/12 ч темнота в течение нескольких недель. Скрещивания проводили в трехкратной повторности и не менее чем в двух опытах. Для проверки репродуктивного барьера скрещивания проводили со штаммами Fusarium противоположного типа спаривания. Фертильность перитециев контролировали путем микроскопического наблюдения образования аскоспор в асках.

Определение токсинопродуцирующей способности штаммов. В колбах объемом 100 мл смешивали 20 г рисовых зерен и 12 мл воды, затем автоклавировали при 121^օC в течение 40 мин. Автоклавированный рис инокулировали двумя дисками диаметром 5 мм, вырезанными из предварительно выращенных на КСА чистых культур штаммов F. temperatum и F. subglutinans. Неинокулированный рис использовали в качестве контроля. Колбы с инокулированным рисом инкубировали в течение двух недель при 22^օC в темноте и ежедневно встряхивали. После этого образцы риса высушивали при 55^օC в течение 24 ч, измельчали на лабораторной мельнице Tube Mill Control (IKA, Германия) и хранили при – 20^օC.

Профиль вторичных токсичных метаболитов, продуцируемых анализируемыми грибами, определяли методом ВЭЖХ–МС/МС (Malachová et al., 2014). К 5 г рисовой муки образцов добавляли 20 мл экстракционного растворителя (ацетонитрил/вода/уксусная кислота, 79 : 20 : 1). Обнаружение и количественное определение ФУМ, БОВ и МОН выполняли на системе AB SCIEX Triple Quad™ 5500 MS/MS (Applied Biosystems, США), оснащенной источником ионизации электрораспылением TurboV (SCIEX, США) и системой микроволнового анализа Agilent Infinity серии 1290 (Agilent, США). Хроматографическое разделение проводили при 25^օC на колонке Gemini® C18, 150 × 4.6 мм (Phenomenex, США).

Микотоксины количественно определяли путем сравнения площадей пиков с калибровочными кривыми, полученными для стандартных растворов (Romer Labs Diagnostic GmbH, Австрия). Проценты извлечения микотоксинов колебались от 80 до 132%.

Статистический анализ. Средние значения величин и стандартное отклонение рассчитывали в программе Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Молекулярно-генетическая идентификация штаммов

Молекулярно-филогенетический анализ, включал последовательности трех полиморфных локусов: TEF — 420 п. н., tub — 210 п. н., и RPB2 – 805 п. н., количество информативных сайтов в которых составило 69 п. н. (16.4%), 20 п. н. (9.5%) и 66 п. н. (8.2%) соответственно. Исследуемые штаммы MFG 60369 и MFG 60370 вошли в компактную кладу, включающую все референсные штаммы F. subglutinans, с бутстрэп-поддержкой ML/MP/BP 96/99/1.0 (рис. 1). Два штамма MFG 60846 и MFG 70587 формировали общую кладу с референсными штаммами F. temperatum с высокой бутстреп-поддержкой ML/MP/BP 100/100/1.0. Топология филогенетических деревьев, построенных разными методами, была сходной и соответствовала реконструированной ранее (Scauflaire et al., 2011; Yilmaz et al., 2021).

Рис. 1. Дендрограмма филогенетического сходства видов комплекса Fusarium fujikuroi, построенная на основе комбинированных нуклеотидных последовательностей TEF, tub, и RPB2 фрагментов генома методом максимального правдоподобия. В узлах приведены значения бутстреп-поддержки (> 70%) при анализе методами максимального правдоподобия и максимальной экономии, а также значения Байесовской апостериорной вероятности (> 0.95). Штамм F. oxysporum NRRL 22902 был использован в качестве внешней группы.

Амплификация ДНК штаммов с МАТl-1 специфичными праймерами приводила к образованию специфического продукта весом 200 п. н. у обоих штаммов F. subglutinans и F. temperatum MFG 70587, тогда как амплификация ДНК с МАТl-2 специфичными праймерами привела к формированию продукта весом 800 п. н. только у одного штамма — F. temperatum MFG 60846.

Морфологическая характеристика штаммов

Штаммы предварительно идентифицированные на основании морфологических признаков как F. subglutinans s. l. в результате филогенетического анализа были реидентифицированы как F. temperatum и F. subglutinans s.str. Для выявления морфологических особенностей двух видов штаммы были детально исследованы при выращивании на трех питательных средах при разных режимах освещения (рис. 2).

Рис. 2. Морфология культур штаммов Fusarium temperatum и F. subglutinans на седьмые сут на средах Cz и КДА при 25^օC и разных режимах освещения. На каждой фотографии слева — поверхность культуры, справа — реверс.

При культивировании на КДА с освещением и в темноте скорость роста колоний F. temperatum составляла в среднем 6.0–6.7 мм/сут, тогда как скорость роста колоний F. subglutinans в этих же условиях была ниже ‒ в среднем 5.8 мм/сут. При культивировании на КДА с УФ освещением скорость роста анализируемых штаммов достоверно снижалась до 5.5 мм/сут для F. temperatum и 4.1 мм/сут для F. subglutinans.

Поверхность колоний штаммов обоих видов, выращенных на КДА с освещением и в темноте, была скудной до хлопьевидной, цвет воздушного мицелия варьировал от беловатого до бледно-серого. Реверс культур имел пурпурную или темно-фиолетовую окраску, более интенсивную в центре. При культивировании с освещением исследуемые штаммы F. temperatum образовывали более обильный воздушный мицелий и менее интенсивную пигментацию реверса, чем F. subglutinans. При УФ-освещении культуры обоих видов образовывали пигменты пурпурного или темно-фиолетового цвета, распределенные неравномерно — пятнами, секторами.

На среде Cz с освещением и в темноте средняя скорость роста штаммов F. temperatum составляла 5.6–5.8 мм/сут, что значительно превышало 4.8–5.0 мм/сут, выявленные для F. subglutinans. Все штаммы образовывали хлопьевидный мицелий серовато-оранжевого цвета. Окраска реверса культур варьировала от светло-желтой до бледно-оранжевой.

Формирование микроконидий начиналось быстро в воздушном мицелии на всех средах (рис. 3, 4). Штаммы F. subglutinans и F. temperatum обильно образовывали микроконидии в ложных головках на моно- и полифиалидных клетках.

Рис. 3. Микроморфология Fusarium temperatum: A — фальшивые головки в воздушном мицелии над спородохием, расположенном на поверхности агара; Б–И — конидиеносцы, фиалидные и бластические конидиогенные клетки; К — фальшивая головка; Л, М — микроконидии на фиалидных отверстиях на поверхности гифы; Н, О — разветвленные спородохиальные конидиеносцы; П — мезоконидии; Р — серповидные макроконидии. Фотографии И–М сделаны с использованием прозрачной липкой ленты (scotch). Масштаб: A — 200 мкм; B–P — 20 мкм.

Рис. 4. Микроморфология Fusarium subglutinans: А — cпородохий на поверхности стебля пырея; Б — спородохии на поверхности SNA; В, Г — воздушный мицелий, конидиеносцы и фальшивые головки; Д–K — конидиеносцы, фиалидные и бластические конидиогенные клетки; Л — воздушный мицелий и конидиеносцы; М — мезоконидии; Н — серповидные макроконидии. Фотографии Д–Л сделаны с использованием прозрачной липкой ленты (scotch). Масштаб: A — 500 мкм; Б — 50 мкм; В, Г — 100 мкм; Д–Н — 20 мкм.

Конидиеносцы F. temperatum, прямые, обычно симподиально разветвленные, пролиферирующие, длиной до 200 мкм. Конидиогенные клетки монофиалидные и полифиалидными, от шиловидных до цилиндрических, с периклинальным утолщением и воротничком, часто незаметным или отсутствующим, длиной до 30 мкм и шириной 2–4 мкм.

Помимо латеральных фиалид, для F. temperatum и реже для F. subglutinans характерно образование микроконидий на фиалидных отверстиях, формирующихся на поверхности гиф. Таким образом, ложные головки выглядят как расположенные непосредственно на гифах. Микроконидии у обоих видов гиалиновые, обратнояйцевидные до эллипсоидных, слегка изогнутых, в основном без или с одной перегородкой.

Спородохии F. temperatum и F. subglutinans от кремового до бледно-оранжевого цвета, часто незаметные, обильно образуются на поверхности агара при освещении. Спородохиальные конидиеносцы плотно агрегированы, неправильно и мутовчато разветвлены. Конидиогенные клетки монофиалидные, от шиловидных до цилиндрических, 10–25 × 2.5–3.0 мкм, с периклинальным утолщением и воротничком, незаметным или отсутствующим.

У штаммов обоих видов макроконидии гиалиновые, преимущественно с тремя перегородками (от 2 до 5). Макроконидии серповидными, с тонкими стенками, почти прямыми или слегка изогнутыми; апикальные клетки — удлиненные с выступающим сосочком; базальные клетки — от заметной ножки до небольшой выемки.

Мезоконидии у штаммов обоих видов прямые, веретеновидные, относительно толстостенные, бесцветные, преимущественно 3(1–5)-септированые, наиболее широкие в средней части, сужающиеся к концам; апикальные и базальные клетки одинаковые, клиновидные, иногда с заметным утолщенным рубцом, обильно образующие на моно- и полибластических конидиогенных клетках. С возрастом поверхность воздушного мицелия культуры грибов приобретает порошистость. В среднем длина одноклеточных микроконидий, а также длина и ширина конидий с одной перегородкой, макроконидий и мезоконидий с тремя перегородками у штаммов F. temperatum оказались достоверно больше, чем у штаммов F. subglutinans (табл. 2). Хламидоспоры отсутствовали в культурах штаммов обоих видов, что характерно для всех представителей FFSC.

Таблица 2. Размеры конидий штаммов Fusarium, культивируемых на SNA (25^օC, УФ-освещение, 7 сут)

Скрещивание штаммов F. temperatum приводило к образованию фертильных перитециев (рис. 5). На морковной агаризованной среде образование перитециев происходило менее обильно, чем на КДА с кусочками растений. Перитеции располагались как на поверхности агара, так и на плотном сплетении гиф, покрывающих растительную ткань. Перитеции F. temperatum при созревании становились грушевидной и колбовидной формы, размерами 250–350 × 150–330 мкм. Наружная оболочка перитециев ангулярной текстуры, темно-фиолетовой окраски, краснеющая в 90%-м р-ре молочной кислоты. Аски имеют вершину с заметным преломляющим кольцом и содержат восемь аскоспор размером 60–100 × 6–15 мкм. Аскоспоры гиалиновые, с одной перегородкой, от эллипсоидной до овальной формы, в перегородке слегка сдавлены, иногда с клетками разной формы, длиной 11.9–16.8 мм и шириной 3.5–6.0 мм (в среднем 14.5 × 4.4 мкм). Скрещивание штаммов F. temperatum и F. subglutinans, относящихся к разным МАТ типам, не приводило к образованию перитециев.

Рис. 5. Телеоморфа Fusarium temperatum: А, Б — формирование перитециев при скрещивании штаммов на КДА с фрагментами пырея; В, Г — фертильный перитеций; Д, Е — перитеций с измененной окраской под воздействием 90%-й молочной кислоты; Ж — высвобожденные из перитеция аски и аскоспоры; З — аскоспоры. Масштаб: Б — 1 мм; В–Е — 100 мкм; Ж, З — 20 мкм.

Токсинопродуцирующая способность штаммов

Штамм F. subglutinans MFG 60370 не продуцировал анализированные токсины при культивировании на автоклавированном рисе (табл. 3). В зерне, инокулированном штаммом F. subglutinans MFG 60369, среди пяти проанализированных микотоксинов выявлен только БОВ в количестве, близком к пределу обнаружения. В то же время оба штамма F. temperatum продуцировали БОВ в высоких количествах. Также штамм F. temperatum MFG 60846, выделенный из стебля пшеницы, синтезировал МОН. Изученные штаммы обоих видов не продуцировали фумонизины.

Таблица 3. Микотоксины, продуцируемые штаммами Fusarium temperatum и F. subglutinans (автоклавированный рис, 22^օC, 14 сут в темноте)

Примечание: *нв — не выявлен; **LOD — диапазон пределов количественного обнаружения; ***LOQ — предел детекции.

ОБСУЖДЕНИЕ

Грибы FFSC особенно часто представляют собой таксономические загадки, поскольку демонстрируют недостаточно четкие морфологические признаки, по которым можно было бы точно диагностировать виды. Внедрение филогенетических исследований привело к значительным изменениям в понимании видового разнообразия грибов и повысило точность идентификации (O’Donnell et al., 2000; Crous et al., 2021). Вследствие этого определение границ конкретных видов Fusarium и установление диапазона их свойств остаются открытыми и требуют актуализации и детализации.

В данном исследовании с помощью филогенетического анализа два штамма гриба, выделенные из стебля пшеницы и корня рапса, были ре-идентифицированы как F. temperatum. Это первое обнаружение F. temperatum на территории России и первое обнаружение этого вида в микобиоте пшеницы и рапса.

В нашем исследовании штаммы F. temperatum характеризовались более высокой скоростью роста и образовывали более обильный мицелий, чем штаммы F. subglutinans. В процессе роста они формировали три типа конидий: микроконидии, макроконидии и мезоконидии. При описании F. temperatum показано, что этот вид продуцирует в основном макроконидии с четырьмя перегородками, в то время как у F. subglutinans макроконидии обычно с тремя перегородками (Scauflaire et al., 2011; Shin et al., 2014). Позднее выявлено преобладание макроконидий с четырьмя перегородками у большинства штаммов F. temperatum и F. subglutinans при их культивировании на агаре с листьями гвоздики при 20^օC и 12 ч освещении холодным флуоресцентным светом или ближним ультрафиолетом (Levic и др., 2019). В то же время штаммы F. temperatum, выделенные из кукурузы в Китае, в основном образовывали макроконидии с тремя перегородками (Xu et al., 2022). В наших экспериментах при культивировании на SNA и освещении при 25^օC и УФ-освещении как у штаммов F. temperatum, так и у штаммов F. subglutinans подавляющее большинство макроконидий были с тремя перегородками.

Размеры макроконидий с тремя перегородками у анализированных нами штаммов F. temperatum совпадали с указанными ранее для этого вида диапазонами (Scauflaire et al., 2011; Shin et al., 2014). Длина микроконидий F. temperatum оказалась больше, чем в предыдущих исследованиях (Scauflaire et al., 2011), и в среднем больше, чем длина микроконидий у двух изученных штаммов F. subglutinans. Однако эти показатели трудно использовать при идентификации, поскольку выявленные различия в размерах микроструктур могут быть связаны с варьированием состава питательных сред и условий культивирования.

Дополнительное образование веретенообразных мезоконидий у F. temperatum и F. subglutinans в результате голобластического конидиогенеза кажется характерным признаком как для F. temperatum, так и для F. subglutinans и отличает данные виды от других распространенных видов FFSC. Мезоконидии, быстро и обильно формирующиеся на бластических конидиогенных клетках, легко разлетаются по воздуху, что позволяет грибам быстро распространиться в окружающем пространстве. Следует отметить, что на всех средах макроконидии F. temperatum и F. subglutinans в спородохиях образуются особенно обильно при росте на свету, в то время как мезоконидии чаще формируются при культивировании штаммов в темноте.

Известно, что F. temperatum и F. subglutinans являются гетероталличными. Исследованные штаммы F. temperatum имели разные идиоморфы МАТ локуса. Ранее штаммы F. temperatum обоих типов спаривания были обнаружены в Бельгии и Аргентине, причем соотношение штаммов F. temperatum с разными идиоморфами МАТ-локуса оказалось примерно равным (Scauflaire et al., 2011; Fumero et al., 2015). В наших экспериментах при скрещивании двух штаммов F. temperatum образовывались зрелые перитеции с аскоспорами, что свидетельствует о наличии полового процесса у этого гриба в природе. При скрещивании F. temperatum и F. subglutinans мы не получили каких-либо фертильных перитециев, что предполагает наличие репродуктивного барьера между двумя филогенетически различными, но морфологически сходными видами. Однако способность нескольких видов Fusarium из комплекса FFSC к гибридизации позволяет предположить, что все они произошли от недавнего общего предка (Steenkamp et al., 2002).

Изученные штаммы F. temperatum и F. subglutinans не продуцировали фумонизины, но различались по способности продуцировать БОВ и МОН. Долгое время не было единого мнения о способности F. temperatum и F. subglutinans продуцировать ФУМ (Scauflaire et al., 2012; Wang et al., 2014; Zhang et al., 2016; Stępień et al., 2019). В настоящее время установлено, что штаммы этих близкородственных видов не обладают генами биосинтеза ФУМ и не способны продуцировать эти микотоксины (Fumero et al., 2020; Pfordt et al., 2020). Например, штаммы F. temperatum, выделенные из початков кукурузы в Германии, продуцировали только БОВ, МОН, фузариевую кислоту (ФК) и фузапролиферин (ФУЗА), тогда как все штаммы F. subglutinans образовывали ФК, МОН и ФУЗА, но не БОВ (Pfordt et al., 2020). Штаммы F. subglutinans, выделенные из кукурузы в Аргентине, не образовывали БОВ, хотя 75% проанализированных штаммов F. temperatum продуцировали этот микотоксин (Fumero et al., 2020). Авторы предположили, что ген Bea1 нефункционален у F. subglutinans из-за инсерции и множественных мутаций в кодирующей области гена, в отличие от F. temperatum (Fumero et al., 2020). В недавнем исследовании все штаммы F. temperatum, выделенные из стеблей кукурузы, собранные в китайской провинции Юньнань, продуцировали БОВ (Xi et al., 2021). Выявлено, что развитие фузариозной гнили кукурузы, выращенной в Польше, в значительной степени коррелирует с содержанием в инфицированной растительной ткани БОВ, продуцируемого F. temperatum (Wit et al., 2022). Все ранее полученные результаты подтверждают предположение о том, что F. temperatum представляет бóльшую токсикологическую опасность, чем F. subglutinans, особенно в отношении БОВ, что еще раз подчеркивает важность точной идентификации этих близкородственных грибов Fusarium.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам филогенетического исследования на основе частичных последовательностей трех полиморфных локусов (TEF, tub и RPB2), выделенные из кукурузы два штамма были идентифицированы как F. subglutinans s.str., а два других штамма, выделенные из стебля пшеницы и корня рапса, были идентифицированы как F. temperatum. Это первое обнаружение F. temperatum на территории России и первое обнаружение этого вида в микобиоте этих растений в мире. Детальный анализ морфологических характеристик штаммов F. temperatum и F. subglutinans не позволил выявить признаки, позволяющие достоверно дифференцировать эти два близкородственных вида. Однако F. temperatum и F. subglutinans различались по способности продуцировать микотоксины БОВ и МОН. Таким образом, однозначно идентифицировать морфологически сходные виды F. temperatum и F. subglutinans возможно только при привлечении молекулярно-генетических и хемотаксономических методов анализа.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (проект № 19–76–30005).

About the authors

T. Yu. Gagkaeva

Author for correspondence.
Email: t.gagkaeva@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg

O. P. Gavrilova

Email: olgavrilova1@yandex.ru
Russian Federation, St. Petersburg

A. S. Orina

Email: orina-alex@yandex.ru
Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. A dendrogram of the phylogenetic similarity of species of the Fusarium fujikuroi complex, constructed on the basis of combined nucleotide sequences of TEF, tub, and RPB2 fragments of the genome by the maximum likelihood method. The nodes contain bootstrap support values (> 70%) for maximum likelihood and maximum economy analysis, as well as Bayesian a posteriori probability values (> 0.95). The F. oxysporum NRRL 22902 strain was used as an external group.

Download (762KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Morphology of cultures of Fusarium temperatum and F. subglutinans strains on the seventh day on Cz and KDA media at 25 ° C and different lighting modes. In each photo, there is a culture surface on the left, and a reverse on the right.

Download (837KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Micromorphology of Fusarium temperatum: A — false heads in the aerial mycelium above the sporodochium located on the surface of the agar; B –I — conidiophores, phialid and blastic conidiogenic cells; K — false head; L, M — microconidia on phialid holes on the surface of the hyphae; H, O — branched sporodochial conidiophores; P — mesoconidia; P — sickle-shaped macroconidia. The photos of I–M were taken using transparent adhesive tape (scotch). Scale: A — 200 microns; B–P — 20 microns.

Download (1MB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Micromorphology of Fusarium subglutinans: A — sporodochium on the surface of the wheatgrass stem; B — sporodochia on the surface of SNA; C, G — aerial mycelium, conidiophores and false heads; D–K — conidiophores, phialid and blastic conidiogenic cells; L — aerial mycelium and conidiophores; M — mesoconidia; H — sickle-shaped macroconidia. The photos of the D–L were taken using transparent adhesive tape (scotch). Scale: A — 500 microns; B — 50 microns; C, D — 100 microns; D–H — 20 microns.

Download (2MB)

Indexing metadata

6. Fig. 5. Teleomorph of Fusarium temperatum: A, B — formation of perithecia when crossing strains on KDA with fragments of wheatgrass; C, D — fertile perithecium; E, E — perithecium with altered color under the influence of 90% lactic acid; G — asci and ascospores released from perithecium; Z — ascospores. Scale: B — 1 mm; C–E — 100 microns; W, W — 20 microns.

Download (1MB)

Indexing metadata