Temperature influence on the stability of the precursor cluster of the thermolysin crystal

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

We used the molecular dynamics method to assess the stability of the precursor-cluster (hexamer) of thermolysin crystal over a wide range of temperatures (10–90°C). The simulation results showed that as the temperature increases, the stability of the hexamer, in general, decreases, however, the hexamer does not dissociate at any of the considered temperatures. At a temperature of 60°C, an increase in the stability of the hexamer was observed. This value is close to the temperature of maximum enzymatic activity of thermolysin (70°C). Based on the analysis of the results, it was assumed that the crystallization of thermolysin could be carried out at 60°C.

Full Text

Введение

Функционирование белков в значительной степени зависит от их пространственной структуры, чаще всего определяемой с помощью рентгеноструктурного анализа. Для использования этого метода необходимо сначала вырастить кристалл исследуемого белка. Однако поиск оптимальных условий кристаллизации белков остается сложным и времяемким этапом, который до сих пор проводится эмпирически: путем перебора большого количества условий. Тем не менее в [1] установлено, что кристаллизации белков предшествует образование кластеров-прекурсоров, а именно: трехмерных фрагментов кристаллической структуры. Было показано, что условия кристаллизации (температура, концентрации белка и осадителя) определяют образование кластеров и их концентрацию. Изучение взаимодействия белков в кластерах-прекурсорах может быть полезно и для исследования функционирования белков, например ферментов. Как известно, в основе функционирования белков лежат конформационные ансамбли [2], свойства которых в значительной степени зависят от температуры.

В [3] обнаружено, что кластеры-прекурсоры (димеры) кристалла протеиназы К, температурный оптимум активности которой равен 60°C, ведут себя аномально, резко и немонотонно изменяя стабильность при повышении температуры выше 60°C. Также предполагалось, что протеиназа К может кристаллизоваться при относительно высоких для белков температурах около 50°C. В [2] дифракционный набор от кристаллов протеиназы К был собран в диапазоне температур от 40 до 90°C.

В данной работе с использованием метода молекулярной динамики (МД) изучена стабильность кластера-прекурсора кристалла другой термофильной протеиназы, термолизина, при различных температурах от 10 до 90°C, включая температуру максимальной активности фермента, которая составляет 70°C.

Недавние исследования с использованием метода малоуглового рассеяния рентгеновских лучей подтвердили, что кластеры-прекурсоры, образующиеся в процессе кристаллизации термолизина, представляют собой гексамеры [4]. Кроме того, с помощью метода МД установлен наиболее стабильный тип гексамера, являющийся кластером-прекурсором [5].

Термолизин представляет собой металлопротеиназу, вырабатываемую бактерией Bacillus thermoproteolyticus. Этот белок катализирует гидролиз пептидных связей в белках и широко используется для картирования пептидов и производства пептидных фрагментов для структурных и функциональных исследований. Термолизин известен своей стабильностью и активностью при высоких температурах [6]. Каталитическая активность термолизина максимальна в диапазоне pH 7.0–9.0 при температуре 70°C [7]. Пространственная структура содержит два домена с активным центром между ними. В активный центр термолизина (PDB ID: 3DNZ) входят остатки: GLU-142, HIS-143, HIS-146 и GLU-166, координирующие ион цинка [8].

Материалы и методы

Модели гексамеров подготовлены в соответствии с методикой, описанной в [3]. С использованием кристаллической структуры гексагональных кристаллов термолизина (PDB ID: 3DNZ, пр. гр. P6122) создана молекулярная модель потенциальных единиц роста этих кристаллов. С помощью программы PyMOL (версия 1.8 [9]) с использованием операторов симметрии пр. гр. P6122 воссоздан фрагмент кристаллической структуры термолизина, из которого выделен гексамер. Ионы осадителя, связанные с кристаллом термолизина, сохранены в структуре гексамера (четыре иона кальция и один цинка на одну молекулу белка), в то время как молекулы воды были удалены из структурного файла.

Для определения состояний протонирования аминокислотных остатков при рН 6.0 (согласно рН кристаллизационного буфера для кристалла с PDB ID: 3DNZ) использовали сервер PROPKA (версия 3.4.1 [10]). Все вычисления проводили с помощью пакета GROMACS версии 2021 [11]. Для МД-моделирования применяли силовое поле Amber ff99SB-ILDN [12], в котором улучшены торсионные потенциалы для некоторых атомных групп.

Каждый гексамер помещался в центр кубической ячейки моделирования с периодическими граничными условиями. Минимальное расстояние от грани ячейки до атома белка составляло 1 нм. Ячейки заполнялись 4-сайтовой моделью воды TIP4P-Ew, разработанной для применения методов суммирования по Эвальду [13]. Концентрация осадителя сульфата аммония в растворе составляла 0.75 М, как в условиях кристаллизации. Трехмерная структура иона NH4+ получена из PDBeChem (код: NH4, [14]), а иона SO42– – с помощью модуля PLMD (Peptide Ligand Molecular Dynamics) из пакета MDAnalysis [15, 16]. Топологии ионов сгенерированы с помощью программы Antechamber [17]. Для нейтрализации суммарного заряда ячейки в раствор добавлялось 36 ионов Cl–, так как это необходимо для применения алгоритма PME при расчете дальнодействующих электростатических взаимодействий [18].

Перед проведением вычислений продуктивной МД моделируемые системы подвергали минимизации энергии методом наискорейшего спуска (50000 шагов) до тех пор, пока максимальная сила, приходящаяся на один атом, становилась меньше 1000 кДж/(М∙нм). После этого ячейки уравновешивались в течение 100 пс с использованием модифицированного термостата Берендсена (V-rescale) [19] в ансамбле NVT и уравновешивались в течение 100 пс с использованием баростата Парринелло–Рамана [20] в ансамбле NPT. Расчеты продуктивной МД осуществляли в ансамбле NPT с термостатом “V-rescale” и баростатом Парринелло–Рамана. Интегрирование уравнений движения проводили по стандартному алгоритму “leap-frog” [21] с шагом 2 фс. Нековалентные взаимодействия учитывали в сфере действия 1 нм. Дальнодействующие электростатические взаимодействия рассчитывали методом “частица–сетка” Эвальда (PME, [17]) с кубической интерполяцией и шагом сетки в обратном пространстве 0.16 нм. Длины связей гексамеров фиксировали алгоритмом LINCS [21].

Продолжительность каждой рассчитанной траектории составила 100 нс. Молекулярную динамику гексамеров моделировали при 10 температурах: от 10 до 90°C с шагом 10°C, а также при 15°C. Для каждой температуры в диапазоне 10–40°C и 90°C провели по три независимых моделирования. Для температур от 50 до 80°C количество независимых моделирований было увеличено до пяти.

Для структурного выравнивания по начальному положению атомов термолизина использовали команду gmx trjconv. Значения RMSF (среднеквадратичные флуктуации) вычисляли только для атомов Cα с помощью команды gmx rmsf. Значения RMSF сначала усредняли (с вычислением погрешности на основании несмещенной оценки дисперсии) для каждой температуры по независимым моделированиям (трем или пяти в зависимости от температуры); затем значения RMSF и погрешности (стандартные отклонения) дополнительно усредняли по всем атомам Cα.

Результаты и их обсуждение

Значения RMSF атомов Cα характеризуют гибкость полипептидной цепи, так как они показывают, насколько каждый из данных атомов отклоняется от своего среднего (за время моделирования) положения. Высокие значения RMSF и большой разброс этих значений говорят о неустойчивости гексамера. По данным моделирования построили графики RMSF атомов Cα для всех исследуемых гексамеров термолизина, находящихся при температурах от 10 до 90°C.

На рис. 1 цветными кривыми представлены графики RMSF атомов Cα для всех моделирований в одном масштабе, а черными кривыми – RMSF, усредненным по всем независимым моделированиям (трем для 10–40°C и 90°C; или пяти для 50–80°C) для каждой конкретной температуры. Из рис. 1 следует, что в среднем мономеры A и F наиболее нестабильны, а мономеры C и D, наоборот, самые устойчивые. Это объясняется тем, что, как видно из рис. 2, мономеры A и F имеют наименьшую площадь контактов с остальными мономерами, а мономеры C и D, наоборот, находятся “в глубине” гексамера.

 

Рис. 1. Значения RMSF кластера-прекурсора (гексамера) кристалла термолизина в кристаллизационном растворе при температурах в диапазоне от 10–90°C. Каждая цветная кривая соответствует одному моделированию, черная – значениям RMSF, усредненным по всем независимым моделированиям (трем или пяти) при определенной температуре.

 

Рис. 2. Кластер-прекурсор (гексамер) кристалла термолизина в двух проекциях. Буквами A–F обозначены мономеры, составляющие гексамер. Зелеными сферами показаны ионы кальция, серыми – цинка.

 

Черными маркерами на рис. 1 показаны усредненные (по моделированиям) RMSF атомов Cα, входящих в активный центр термолизина. Согласно рис. 1, атомы активного центра наиболее стабильны относительно ближайших к ним атомов, так как RMSF активного центра принимает наименьшие значения в его окрестности. Это позволяет предположить, что термолизин может выполнять свою каталитическую функцию даже в составе кластера-прекурсора как при низких, так и относительно высоких температурах (по крайней мере, до 90°C).

Результаты дополнительного усреднения RMSF и погрешностей (стандартных отклонений) по всем атомам Cα представлены на рис. 3. Из рис. 1 и 3 видно, что с увеличением температуры стабильность гексамера в среднем снижается. Однако даже при значительной подвижности кластера-прекурсора при высоких температурах анализ всех смоделированных траекторий показал, что гексамер всегда остается целым: в ходе динамики любой мономер остается связанным с остальным гексамером. Согласно рис. 1 наибольшие трансформации структуры гексамера наблюдаются в одном из моделирований при 50°C (соответствует зеленой кривой на рис. 1). Следующий по нестабильности гексамер был смоделирован при 70°C (соответствует красной кривой на рис. 1). Последние фреймы траекторий движения данных гексамеров (структуры после 100 нс динамики) приведены на рис. 4, из которого следует, что ни одна молекула не успела отделиться от гексамера за 100 нс. Вероятно, при 50°C мономер А, обладающий самыми высокими показателями RMSF на рис. 1, потеряет оставшиеся межмолекулярные связи в ближайшее время. Тем не менее это единственный из 38 моделирований случай, в котором наблюдается тенденция к отрыву хотя бы одного мономера. Из рис. 4 видно, что уже у второго по нестабильности гексамера (при 70°C) все мономеры имеют достаточно большую площадь межмолекулярных контактов. Кроме того, в реальном кристаллизационном растворе небольшая часть гексамеров скорее всего тоже распадается.

 

Рис. 3. Значения RMSF, усредненные по всем атомам Cα кластера-прекурсора кристалла термолизина в кристаллизационном растворе при различных температурах (от 10 до 90°C). Указанные погрешности составляют одно стандартное отклонение при усреднении RMSF по независимым моделированиям.

 

Рис. 4. Наименее стабильные гексамеры в конце моделирования (100 нс) в двух проекциях при 50 (слева) и 70°C (справа). Молекулы термолизина не отрываются от гексамера даже в ходе МД самых неустойчивых структур.

 

Целостность кластера-прекурсора кристалла термолизина в диапазоне 10–90°C позволяет сделать предположение о том, что его кристаллизация может быть проведена при высоких температурах (до 90°C).

Интересно отметить, что при температуре 60°C, близкой к температуре пика активности термолизина (70°C [7]), разброс значений RMSF вокруг среднего минимален в диапазоне температур от 50 до 90°C (рис. 3). Диапазон значений RMSF при 60°C почти в 2 раза уже, чем для температур 50, 70, 80 и 90°C. Узкий разброс значений RMSF при 60°C указывает на то, что степень стабильности белка при данной температуре сохраняется немного лучше (для пяти независимых моделирований), чем при остальных температурах в диапазоне 50–90°C. Это может свидетельствовать о повышенной воспроизводимости моделирования при температуре, близкой к максимуму ферментативной активности термолизина, т. е. о лучшей предсказуемости поведения белка при этой температуре. Кроме того, согласно [3] для другой протеазы, протеиназы К, не только абсолютное значение RMSF оставалось относительно низким, но и диапазон его значений был достаточно узким именно при температуре максимальной ферментативной активности протеиназы К. Это указывает на возможное общее свойство протеаз, заключающееся в относительной стабильности кластеров-прекурсоров их кристаллов при температурах, близких к пику их активности.

Заключение

Методом МД исследовано влияние температуры (от 10 до 90°C) на стабильность кластера-прекурсора кристалла термолизина. Установлено, что с увеличением температуры стабильность гексамера в среднем снижается, однако его целостность сохраняется. Замечено, что при температуре 60°C, близкой к температуре пика активности термолизина (70°C), разброс значений RMSF вокруг среднего минимален в диапазоне от 50 до 90°C. Это позволяет предположить, что кристаллизация термолизина может быть проведена при 60°C, так как при этой температуре кластеры-прекурсоры достаточно стабильны.

Работа проведена в рамках выполнения государственного задания НИЦ “Курчатовский институт” и при поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по гранту № 075-15-2021-1363 (продолжение).

Работа была выполнена с использованием оборудования центра коллективного пользования “Комплекс моделирования и обработки данных исследовательских установок мега-класса” НИЦ “Курчатовский институт”, http://ckp.nrcki.ru/.

×

About the authors

Y. V. Kordonskaya

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Author for correspondence.
Email: yukord@mail.ru
Russian Federation, Moscow

V. I. Timofeev

NRC “Kurchatov Institute”

Email: yukord@mail.ru

Shubnikov Institute of Crystallography of Kurchatov Complex of Crystallography and Photonics

Russian Federation, Moscow

M. А. Marchenkova

NRC “Kurchatov Institute”; Southern Federal University

Email: yukord@mail.ru

Shubnikov Institute of Crystallography of Kurchatov Complex of Crystallography and Photonics; The Smart Materials Research Institute

Russian Federation, Moscow; Rostov-on-Don

Y. V. Pisarevsky

NRC “Kurchatov Institute”

Email: yukord@mail.ru

Shubnikov Institute of Crystallography of Kurchatov Complex of Crystallography and Photonics

Russian Federation, Moscow

S. Y. Silvestrova

The Loginov Moscow Clinical Scientific Center Moscow Health Department

Email: yukord@mail.ru
Russian Federation, Moscow

Y. A. Dyakova

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: yukord@mail.ru
Russian Federation, Moscow

M. V. Kovalchuk

National Research Centre “Kurchatov Institute”; NRC “Kurchatov Institute”

Email: yukord@mail.ru

Shubnikov Institute of Crystallography of Kurchatov Complex of Crystallography and Photonics

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

  1. Marchenkova M.A., Boikova A.S., Ilina K.B. et al. // Acta Naturae. 2023. V. 15. № 1. P. 58. https://doi.org/10.32607/ACTANATURAE.11815
  2. Du S., Wankowicz S.A., Yabukarski F. et al. // bioRxiv. 2023. https://doi.org/10.1101/2023.05.05.539620
  3. Kordonskaya Y.V., Timofeev V.I., Dyakova Y.A. et al. // Crystals. 2022. V. 12. № 11. P. 1645. https://doi.org/10.3390/CRYST12111645
  4. Kovalchuk M.V., Boikova A.S., Dyakova Y.A. et al. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2019. V. 37. № 12. P. 3058. https://doi.org/10.1080/07391102.2018.1507839
  5. Kordonskaya Y.V., Timofeev V.I., Dyakova Y.A. et al. // Mend. Commun. 2023. V. 33. № 2. P. 225. https://doi.org/10.1016/J.MENCOM.2023.02.024
  6. van den Burg B., Eijsink V. // Handbook of Proteolytic Enzymes. 2013. V. 1. P. 540. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-382219-2.00111-3
  7. Lam M.P.Y., Lau E., Liu X. et al. // Comprehensive Sampling and Sample Preparation: Analytical Techniques for Scientists. 2012. P. 307. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-381373-2.00085-5
  8. Adekoya O.A., Sylte I. // Chem. Biol. Drug. Des. 2009. V. 73. № 1. P. 7. https://doi.org/10.1111/J.1747-0285.2008.00757.X
  9. DeLano W.L. // The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8; Schrödinger, LLC: New York, NY, USA, 2015.
  10. Jurrus E., Engel D., Star K. et al. // Protein Sci. 2018. V. 27. № 1. P. 112. https://doi.org/10.1002/PRO.3280
  11. Van Der Spoel D., Lindahl E., Hess B. et al. // J. Comput. Chem. 2005. V. 26. № 16. P. 1701. https://doi.org/10.1002/jcc.20291
  12. Lindorff-Larsen K., Piana S., Palmo K. et al. // Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 2010. V. 78. № 8. P. 1950. https://doi.org/10.1002/prot.22711
  13. Horn H.W., Swope W.C., Pitera J.W. et al. // J. Chem. Phys. 2004. V. 120. № 20. P. 9665. https://doi.org/10.1063/1.1683075
  14. Dimitropoulos D., Ionides J., Henrick K. // Curr. Protoc. Bioinf. 2006. P. 14.3.1–14.3.3.
  15. Michaud-Agrawal N., Denning E.J., Woolf T.B., Beckstein O. // J. Comput. Chem. 2011. V. 32. № 10. P. 2319. https://doi.org/10.1002/JCC.21787
  16. Gowers R.J., Linke M., Barnoud J. et al. // 15th Python in Science Conference, Los Alamos, NM (United States), Sep 11. 2016. P. 98. https://doi.org/10.25080/Majora629e541a-00e
  17. Sousa Da Silva A.W., Vranken W.F. // BMC Res Notes. 2012. V. 5. № 1. P. 1. https://doi.org/10.1186/1756-0500-5-367/FIGURES/3
  18. Essmann U., Perera L., Berkowitz M.L. et al. // J. Chem. Phys. 1995. V. 103. P. 8577. https://doi.org/10.1063/1.470117
  19. Berendsen H.J.C., Postma J.P.M., Van Gunsteren W.F. et al. // J. Chem. Phys. 1984. V. 81. № 8. P. 3684. https://doi.org/10.1063/1.448118
  20. Parrinello M., Rahman A. // J. Chem. Phys. 1982. V. 76. № 5. P. 2662. https://doi.org/10.1063/1.443248
  21. Van Gunsteren W.F., Berendsen H.J.C. // Mol. Simul. 1988. V. 1. № 3. P. 173. https://doi.org/10.1080/08927028808080941
  22. Hess B., Bekker H., Berendsen H.J.C., Fraaije J.G.E.M. // J. Comput Chem. 1997. V. 18. P. 1463. https://doi.org/10.1002/(SICI)1096-987X(199709)18:12<1463:: AID-JCC4>3.0.CO;2-H

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. RMSF values ​​of the precursor cluster (hexamer) of the thermolysin crystal in the crystallization solution at temperatures in the range from 10–90°C. Each colored curve corresponds to one simulation, the black one to the RMSF values ​​averaged over all independent simulations (three or five) at a certain temperature.

Download (746KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Precursor cluster (hexamer) of thermolysin crystal in two projections. Letters A–F denote the monomers that make up the hexamer. Green spheres show calcium ions, gray spheres – zinc ions.

Download (480KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. RMSF values ​​averaged over all Cα atoms of the thermolysin crystal precursor cluster in the crystallization solution at different temperatures (from 10 to 90°C). The indicated errors are one standard deviation when averaging RMSF over independent simulations.

Download (73KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. The least stable hexamers at the end of the simulation (100 ns) in two projections at 50 (left) and 70°C (right). Thermolysin molecules do not detach from the hexamer even during MD of the most unstable structures.

Download (201KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».