Complexation of Styryl Isoxazole Dye with Albumin

Толық мәтін

ВВЕДЕНИЕ

Производные изоксазола представляют собой соединения, обладающие перспективными фотохимическими характеристиками. Различные модификации молекул данного класса позволяют варьировать их свойства [1, 2]. Так, введение ароматических заместителей и нитрогруппы приводит к батохромному смещению поглощения и флуоресценции, а также обуславливает повышение фотоактивности [3]. Включение в структуру молекул таких лигандов, как краун-эфиры способствует образованию комплексов с ионами металлов и повышению флуоресценции [4]. Таким образом, данные соединения находят применение в качестве флуоресцентных меток и сенсоров на различные ионы металлов в клеточной среде [5, 6].

Альбумин является основным компонентом плазмы крови и способен осуществлять доставку лекарственных соединений, в частности фотовизуализаторов в клетки [7]. Определение констант связывания новых синтетических красителей с альбумином позволяет охарактеризовать их возможный путь внутриклеточного транспорта [8].

Целью настоящей работы было получение спектрально-кинетических характеристик комплексов нитроизоксазола 16-({5-[(E)-2-нафто[2, 1-b]фуран-2-илвинил]-4-нитроизоксазол-3-ил}карбонил)-1,4,7,10,13-пентаокса-16-азациклооктадекана, далее – флуорофор, с альбумином. Флуорофор был получен с использованием разработанного нами ранее метода, основанного на реакции конденсации 5-метил-4-нитроизоксазолов с ароматическими альдегидами [2]. Исходный краунсодержащий 5-метил-4-нитроизоксазол был синтезирован реакцией ацилирования 18-азакраун-6 хлорангидридом 4-нитро-5-метилизоксазол-3-карбоновой кислоты.

Флуорофор был охарактеризован методом ЯМР ¹H и ¹³C спектроскопии, его состав подтвержден масс-спектром высокого разрешения (HRMS-ESI). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 3.55–3.75 (м, 20Н, 10СН₂), 3.80–3.94 (м, 4Н, 2СН₂), 7.51–7.56 (м, 1H, CH), 7.57 (с, 1H, CH), 7.61–7.66 (м, 1H, CH), 7.68 (д, ³J = 16.0 Гц, 1H, CH=), 7.65–7.70 (м, 1H, CH), 7.73 (д, ³J = 16.0 Гц, 1H, CH=), 7.88–7.84 (м, 1H, CH), 7.92–7.97 (м, 1H, CH), 8.10–8.16 (м, 1H, CH). ¹³С NMR (100 МГц, CDCl₃): δ 46.7 (СH₂), 50.0 (СH₂), 69.35 (СH₂), 69.43 (СH₂), 70.60 (2СH₂), 70.62 (СH₂), 70.70 (СH₂), 70.74 (СH₂), 70.8 (2СH₂), 70.9 (СH₂), 109.1 (CH), 112.3 (CH), 112.9 (CH), 123.5 (СH), 124.5 (С), 125.6 (СH), 126.6 (CNO₂), 127.5 (СH), 127.6 (C), 129.2 (СH), 129.4 (СH), 129.7 (СH), 130.6 (C), 151.7 (C), 154.2 (C), 154.7 (C), 158.9 (C), 166.2 (C). HRMS-ESI (М+Na⁺): Найдено: 618.2051. Вычислено для C₃₀H₃₃N₃O₁₀Na⁺: 618.2058.

 

 

В качестве модели для изучения фотохимических свойств красителя в биологических средах рассматривается его взаимодействие с бычьим сывороточным альбумином (БСА).

Измерение спектров поглощения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV3101PC (Япония) в кварцевых кюветах 1 × 1 см. Флуоресценцию и кинетику гибели флуоресценции комплексов исследовали методом коррелированного по времени счета единичных фотонов (TCSPC) с помощью спектрофлуорометра FluoTime 300 (PicoQuant, Германия). Для регистрации флуоресценции использовался фотоумножитель HCP 14-3500 NEG (FuG Electronic GmbH, Германия). Возбуждение флуоресценции нитроизоксазола проводили светодиодом λ_возб = 430 нм. Времена жизни флуоресценции рассчитывались по мультиэкспоненциальной модели в соответствии с уравнением [9]:

$I =\sum A_{i}exp(-t/{\tau }_i)$,

где A_i – амплитуда, τ_i – время жизни i-й компоненты, n – количество компонент. Качество аппроксимации оценивали по критерию χ² (близкий к 1 для наилучшей аппроксимации).

Константа связывания красителя с бычьим сывороточным альбумином (БСА) определялась методами разгорания флуоресценции и изменения оптической плотности поглощения. Флуоресценция регистрировалась в растворе БСА в фосфатном буфере (pH 7.4) при возбуждении на 430 нм. Спектры поглощения регистрировались в области 350−600 нм, спектры флуоресценции регистрировались в диапазоне 450−830 нм. Полученные данные были обработаны в соответствии с уравнением:

$P-P_0=P_{max}\times \left[БСА\right]/\left(K_d+\left[БСА\right]\right)$,

где P₀ – поглощение при 450 нм или интенсивность флуоресценции красителя (1×10^-6 M) при 550 нм (фотовозбуждение при 430 нм) в отсутствии БСА, P – поглощение или интенсивность флуоресценции в присутствии БСА (0 – 2×10^-4 M), P_max – поглощение или интенсивность флуоресценции пробы с максимальным количеством БСА, [БСА] – концентрация альбумина, K_d – константа диссоциации комплекса краситель-альбумин (K_b − константа связывания, K_b = 1/K_d).

При добавлении БСА в раствор красителя в водной среде наблюдается последовательное увеличение интенсивности основной полосы поглощения красителя при 450 нм, а также уменьшение полосы поглощения при 380 нм, соответствующей поглощению димера красителя, образующегося в водной среде. Спектры флуоресценции, зарегистрированные для аналогичных проб, характеризуются значительным ростом интенсивности флуоресценции красителя при 550 нм.

Константы связывания, рассчитанные по спектрам поглощения и флуоресценции, близки по значению и составили K_b = (1.7 ± 0.1) × 10⁴ M^-1, что свидетельствует о достаточно сильном взаимодействии флуорофора с молекулой альбумина. Увеличение флуоресценции при комплексообразовании указывает на повышение жесткости структуры молекулы красителя в комплексе с альбумином, что уменьшает вклад колебательной релаксации в механизм гибели синглетновозбужденной молекулы флуорофора в комплексе. Кинетика гибели флуоресценции комплекса при 550 нм флуорофора (1 × 10^-6 M) и БСА (2×10^-4 M) в растворе характеризуется двумя временами жизни τ₁ = 3.2 нс и τ₂ = 1.2 нс (рис. 1), что указывает на образование двух флуоресцирующих комплексов, образованных между флуорофором и двумя различными сайтами связывания в молекуле альбумина. Спектрально-кинетический расчет времяразрешенной флуоресцентной спектроскопии (TRES), выполненный в программе EasyTau 2 (PicoQuant), указывает на примерно равный вклад этих двух сайтов в комплексообразование флуорофора с альбумином.

 

Рис. Кинетика гибели флуоресценции комплекса при 550 нм (возбуждение 450 нм) флуорофора (1 × 10^-6 M) и БСА (1 × 10^-4 M) в фосфатном буфере. На врезке спектры флуоресценции двух комплексов краситель-БСА (1 и 2 соответственно), которым соответствуют времена жизни флуоресценции τ₁ = 3.2 нс и τ₂ = 1.2 нс

 

Таким образом показано, что увеличение флуоресценции флуорофора обусловлено образованием двух комплексов с молекулой альбумина. Флуорофоры на основе исследованного стирилового красителя могут быть использованы для флуоресцентного анализа биомакромолекул.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Синтез флуорофора был выполнен при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 22-73-00058. Спектральные измерения выполнены на базе коллективного научного центра ИБХФ РАН “Новые материалы и технологии” государственная программа РФ №122041400114-2.

Авторлар туралы

I. Burtsev

N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics of the Russian Academy of Sciences

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: burtsevid@gmail.com
Ресей, Moscow

D. Vasilenko

Lomonosov Moscow State University

Email: burtsevid@gmail.com
Ресей, Moscow

N. Astakhova

Lomonosov Moscow State University

Email: burtsevid@gmail.com
Ресей, Moscow

E. Averina

Lomonosov Moscow State University

Email: burtsevid@gmail.com
Ресей, Moscow

A. Trofimov

N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics of the Russian Academy of Sciences; Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University)

Email: burtsevid@gmail.com
Ресей, Moscow; Dolgoprudny

V. Kuzmin

N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics of the Russian Academy of Sciences; MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute) National Nuclear Research University

Email: burtsevid@gmail.com
Ресей, Moscow; Moscow

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар