The genome of  Staphylococcus epidermidis  Isolated from Caseous Tuberculoma

V. V. Sinkov; Синьков В. В.; E. A. Orlova; Орлова Е. А.; O. B. Ogarkov; Огарков О. Б.; A. E. Suzdalnitsky; Суздальницкий А. Е.; I. G. Kondratov; Кондратов И. Г.; N. L. Belkova; Белькова Н. Л.; L. V. Rychkova; Рычкова Л. В.

doi:10.31857/S0016675824100139

Геном Staphylococcus epidermidis из казеозного некроза туберкулемы

Авторы: Синьков В.В.¹, Орлова Е.А.¹, Огарков О.Б.¹, Суздальницкий А.Е.²^,3, Кондратов И.Г.¹, Белькова Н.Л.¹, Рычкова Л.В.¹
Учреждения:
1. Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека
2. Иркутская областная клиническая туберкулезная больница
3. Иркутский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 60, № 10 (2024)
Страницы: 129-134
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
URL: https://journals.rcsi.science/0016-6758/article/view/273896
DOI: https://doi.org/10.31857/S0016675824100139
EDN: https://elibrary.ru/wefylg
ID: 273896

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Ряд факультативно-анаэробных липофильных микроорганизмов, включая представителей Corynebacterium и Staphylococcaceae, обитают в некротическом содержимом туберкулем. Проведено выделение из казеума штамма Staphylococcus epidermidis, его полногеномное секвенирование и картирование генов. Выявили, что коагулазонегативный стафилококк относится к генотипу MLST 73 и устойчив к двум противотуберкулезным препаратам. Фенотипически штамм обладает уреазной, желатиназной и бета-гемолитической активностью и имеет соответствующие гены. Как и у S. epidermidis O47, его геном состоит из одной хромосомы, содержащей около 2.4 млн пар нуклеотидов, а oriC имеет такую же ориентацию. Всего было идентифицировано 2333 гена, из которых 2206 были кодирующими. В контигах изученного генома обнаружены последовательности генов репликации плазмид: rep7a, rep13, rep5b и pSK1. Филогенетический анализ указывает на близость анализируемого генома с большой группой европейских штаммов. Учитывая биохимические и микробиологические свойства выделенного штамма, мы предполагаем, что стафилококки и другие факультативно-анаэробные микроорганизмы-сателлиты туберкулезных очагов могут играть важную роль в разжижении казеозного некроза за счет собственной протеолитической активности и привлечения нейтрофилов к очагу воспаления.

Ключевые слова

туберкулема, Staphylococcus epidermidis, картирование генов вирулентности

Полный текст

Микробиота глубоких отделов легких сильно отличается от микробиоты верхних дыхательных путей гораздо более низкой биомассой и динамическим разнообразием [1]. Внутри туберкулезного очага происходит резкое снижение биоразнообразия сателлитной микробиоты [2]. Полученные нами метагеномные данные позволили разделить исследуемые сообщества микроорганизмов туберкулезных очагов на два типа: (i) – микобактериальная казеома (туберкулема), в которой 70% и более геномов соответствует микобактериям туберкулеза, и (ii) – полимикробное сообщество, в котором концентрация микобактерий туберкулеза варьирует от 0 до 10% [3]. При этом в одном из казеумов (некротический центр туберкулезного очага) было выявлено преобладание представителей семейства Staphylococcaceae [3]. Туберкулема является наиболее часто встречающейся патологической формой при туберкулезе легких и квалифицируется как объемное казеозно-некротическое образование, отграниченное от прилежащей ткани капсулой. Культивирование пяти казеозных образцов из туберкулем (отличных от использованных в настоящем исследовании) при пониженном парциальном давлении кислорода позволило нам выделить и идентифицировать по результатам полногеномного секвенирования липофильную Corynebacterium kefirresidentii [4]. Выделение из туберкулезных некротических очагов липофильных факультативно-анаэробных бактерий вместе с результатами метагеномных исследований [2–4] свидетельствует о вероятной роли нетуберкулезной сателлитной микрофлоры в процессах разжижения казеозного некроза. Это может иметь важное патофизиологическое значение и, вероятно, должно рассматриваться как неблагоприятный исход при туберкулезе легких. Мы предполагаем, что микробное сообщество туберкулезного очага формируется в результате изоляции иммунной системой пациента вместе с возбудителем туберкулеза [5] других бактерий из нижних дыхательных путей. При этом условия внутри туберкулезного очага создают возможности для развития преимущественно факультативно-анаэробной липофильной микробиоты.

Цель настоящего исследования – выделение и полногеномное секвенирование представителя Staphylococcaceae как одного из наиболее распространенных сателлитных обитателей казеозного некроза в очагах при туберкулезе легких.

Настоящее исследование одобрено Этическим комитетом ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ. Все образцы операционного материала были получены во время операций по иссечению туберкулем.

Образцы помещались в 50-милилитровую стерильную пластиковую пробирку в условиях операционной и затем хранились при температуре –80 °C до момента исследования. После медленного оттаивания при 4 °C максимально доступное количество некротического материала из туберкулезного очага помещали в стерильные пробирки с 5-ю мл LB (Luria-BertaniMedium, BD Difco) под вазелиновым маслом. Через две недели 100 мкл осадка засевали газоном на чашку Петри с LB-агаром (BD Difco). Инкубацию проводили при 37 °C в течение трех дней в инкубационном контейнере BD GasPak EZ с AnaeroGasPac (Россия) до образования видимых колоний бактерий. Один штамм из образца 2206 дал стабильный и воспроизводимый рост на чашках Петри.

Штамм 2206-2 был первично идентифицирован с помощью секвенирования по Сэнгеру генов 16S рРНК и rpoB. Для амплификации и секвенирования по Сэнгеру гена rpoB рода Staphylococcus были использованы праймеры 1418st F: 5’-ATCTCAATTYATGGACCAAGC, 3241st R: 5’-GCTACGTGTTCCATACCTGT [6], а также универсальные бактериальные праймеры для гена 16S рРНК EUB27 L: 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG и EUB518 R: 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG [7]. Идентичность по генам rpoB и 16S рРНК с видами S. epidermidis образца 2206-2 и составила 100% (GenBank accession numbers: 2206-2 16S rRNA OP893659, rpoB OP893660).

Полногеномное секвенирование осуществлено на NGS-секвенаторе DNBSeq-G400 компанией “Геномед”. Первичные последовательности генома размещены в NCBI, проект PRJNA1074084. Сборку геномных прочтений в скаффолды проводили с помощью программы Spades v. 3.11.1. Аннотация контигов осуществлялась при помощи пакета программ PGAP. Идентификация генов, кодирующих 16S рРНК и 23S рРНК исследуемых штаммов в сборке, проводилась с помощью программного пакета SqueezeMeta. Гены факторов вирулентности определяли программой Vfanalyzer. Предсказание oriC в исследуемом геноме осуществлялось с использованием программы Ori-Finder 2. Для определения нуклеотидных последовательностей плазмидных генов репликации использовали программу PlasmidFinder.

Биоинформационный поиск потенциальной множественной устойчивости к антибиотикам осуществляли программами ResFinder 4.1 и CARD 3.2.9 (https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi). Филогенетическое древо построено программой IQ-TREE с 1000 итераций. Биохимические свойства штамма изучали с использованием биохимических тест-систем «STAPHY test 16» (Erba Lachema s. r. o., Чехия). Липазную активность определяли посевом на сердечно-мозговой агар (HIMEDIA, Индия) с добавлением 1%-ного Tween-80 и 10 мМ CaCl₂, как описано ранее [4]. Фенотипическая устойчивость к антибиотикам против микобактерий определялась с помощью тест-систем TREK DiagnosticSystems, Thermo Fisher Scientific (США) RAPMYCO для быстрорастущих и SLOWMYCO для медленнорастущих микобактерий по протоколам производителя.

Таблица 1. Сводная таблица биохимических и микробиологических свойств выделенного штамма

Параметры	2206-2	Параметр	2206-2
STAPHYtest 16 (ErbaLachema)		Sensititre RAPMYCO
VPT Acetoin	yes	Trimethoprim	Res
H Urease URE	yes	Ciprofloxacin	Sus
G Arginine ARG	no	Moxifloxacin	Sus
F Ornithine ORN	no	Cefoxitin	Sus
E β-GalactosidasebGA	no	Amikacin	Sus
D β-Glucuronidase GLR	no	Doxycycline	Sus
C Esculin ESL	no	Tigecycline	Sus
B Nitrate NIT	no	Clarithromycin	Res
A Phosphatase PHS	no	Linezolid	Sus
H Galactose GAL	yes	Imipenem	Sus
G Sacharose SUC	yes	Cefepime	Sus
F Trehalose TRE	no	Amoxicillin	Sus
E Mannitol MAN	no	Ceftriaxone	Sus
D Xylose XYL	no	Minocycline	Sus
C Maltose MLT	yes	Tobramycin	Sus
B Mannose MNS	yes	Sensititre SLOWMYCO
A Lactose LAC	yes	Rifabutin	Sus
Микробиологические тесты		Ethambutol	Res
Gelatinase	yes	Isoniazid	Res
Coagulase	no	Rifampin	Sus
Hemolysis	yes (β-type)	Streptomycin	Sus
Lipase	no	Ethionamide	Sus

Примечание. Sus – susceptibility (чувствительность), Res – resistance (устойчивость).

Штамм относится к коагулазонегативным стафилококкам (табл. 1). Обращает на себя внимание фенотипическая устойчивость к двум противотуберкулезным препаратам, а также уреазная, желатиназная и гемолитическая активности. По результатам секвенирования по Сэнгеру и полногеномного секвенирования, штамм относится к MLST 73 [8] – достаточно широко распространенный в мире генотип у людей, но не встречавшийся ранее в России. Так же как и у S. epidermidis O47 [9], его геном состоит из одной хромосомы, содержащей около 2.4 млн п. н., а oriC имеет ту же направленность. В общей сложности были идентифицированы 2333 гена, из которых 2206 являлись кодирующими. В контигах исследуемого генома обнаружены последовательности плазмидных репликационных генов: rep7a, rep13, rep5b и pSK1. Визуально при электрофорезе тотальной ДНК наблюдались три дискретные (отличные от геномной) полосы, которые могут быть плазмидами (данные не приводятся). Биоинформационный анализ, выполненный программами ResFinder 4.1 и CARD 3.2.9, предполагает множественную лекарственную устойчивость исследуемого штамма к широкому кругу антибиотиков, включая макролиды, за счет наличия генов fosB, msr(A), mph(C) иtet(K), с большой вероятностью кодируемых плазмидами.

Рис. 1. Maximum Parsimony (MP) – филогенетическое древо с бутстреп-анализом. Фоном выделен геном исследуемого штамма и кластер геномов S. epidermidis из Европы (BioProject PRJEB31403), к которому принадлежит выделенный в настоящем исследовании штамм.

На рис. 1 приведено MP филогенетическое древо 180 геномов S. epidermidis из NCBI и генома выделенного штамма. Затемнением выделен кластер геномов S. epidermidis из Европы (BioProject PRJEB31403). Таким образом, выделенный штамм S. epidermidis обладал весьма умеренной токсичностью и вирулентностью (табл. 2), продуцировал биофильм при культивировании на жидкой среде, был крайне устойчив к различным химическим воздействиям (данные не приводятся) и обладал множественной лекарственной устойчивостью, включая устойчивость к этамбутолу и изониазиду.

Таблица 2. Обнаруженные гены факторов вирулентности

Группа факторов вирулентности	Фактор вирулентности	Соответствующий ген [9]	2206-2 рамка считывания
Adherence	Autolysin	atl	orf01481
	Cell wall associated fibronectin binding protein	ebh	orf00155
	Elastinbindingprotein	ebp	orf00118
	Ser-Asp rich fibrinogenbinding proteins	sdrF	orf01195
		sdrG	orf00844
		sdrH	orf01386
Enzyme	Cysteineprotease	sspB	orf01711
	Lipase	geh	orf01204
	Lipase	lip	orf02238
	Serine V8 protease	sspA	orf02100
	Thermonuclease	nuc	orf00275
Toxin	Betahemolysin	hlb	orf01227

Мы предполагаем, что микробное сообщество легких в силу своего непостоянства и транзиторного характера попадает внутрь туберкулезного очага в известной мере случайно. Однако попадание липофильных факультативно-анаэробных бактерий может драматическим образом изменять организацию некротического содержимого туберкулезного очага. По всей видимости, благоприятное течение связано со “стерильной” кальцификацией некроза, в рамках которой никакая посторонняя микробиота внутри казеоза не размножается. Микобактерии туберкулеза в анаэробных условиях казеума остаются жизнеспособными, но теряют способность к размножению, при этом они демонстрируют чрезвычайную толерантность к противотуберкулезным препаратам [10].

Можно также предполагать, что в некротическом содержимом способна развиваться “патологическая сукцессия”, когда к бактериям с высокой активностью липаз [4] присоединяются другие бактерии, имеющие в том числе коллагеназную (желатиназа) активность, например стафилококки. Разрушение коллагеновой стромы легкого является необратимым процессом, ведущим в конечном итоге к образованию каверн. Мы ожидаем, что выделенные нами из казеума туберкулем липофильные факультативно-анаэробные микроорганизмы в дальнейшем могут послужить источником биологически активных веществ с адьювантными и/или иммуномодулирующими свойствами, пригодными для создания специфических иммунологических препаратов, в том числе для усиления эффекта субъединичных вакцин, разрабатываемых для профилактики туберкулеза. В пользу этой возможности говорит многолетняя и успешная история исследования грамположительной анаэробной палочки Corynebacterium parvum, которая принадлежит к нормальной микробиоте кожи [11].

Настоящая работа выполнена при участии группы геномных исследований и биоинформационного анализа ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ с использованием оборудования ЦКП “Центр разработки прогрессивных персонализированных технологий здоровья” ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РНФ 23-15-00280.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта людей и животных.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.