Email this article 
Особенности экспрессии eGFP гена у транспластомных растений табака Nicotiana tabacum L. CV. Petit havana
- Authors: Сидорчук Ю.В.1, Белавин П.А.1, Загорская А.А.1, Маренкова Т.В.1, Кузнецов В.В.1, Хайрулина Е.С.1, Дейнеко Е.В.1
-
Affiliations:
- Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
- Issue: Vol 71, No 5 (2024): Генетическая инженерия растений – достижения и перспективы
- Pages: 620-631
- Section: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
- URL: https://journals.rcsi.science/0015-3303/article/view/269482
- DOI: https://doi.org/10.31857/S0015330324050105
- EDN: https://elibrary.ru/MMAIBU
- ID: 269482
Cite item
Open Access
Access granted
Abstract
Методом биобаллистики получены транспластомные растения табака, экспрессирующие репортерный ген egfp и ген селективного маркера aadA в составе бицистронного оперона. Исследованы особенности экспрессии гена egfp в двух группах транспластомных растений: семенного потомства, полученного от самоопыления, и растений, полученных в результате двух последовательных циклов регенерации из листьев исходных трансформантов. Проведен сравнительный флуориметрический анализ накопления рекомбинантного белка в группах транспластомных растений и ядерных трансформантов. Установлено, что количество рекомбинантного белка eGFP, накапливаемого в листьях транспластомных растений, оказалось неожиданно низким и не превышало уровня установленного для ядерных трансформантов. Результаты ПЦР в реальном времени показали, что низкий уровень накопления рекомбинантного eGFP не связан c низким уровнем экспрессии трансгена или с присутствием в хлоропластах нетрансгенных копий пластидного генома. Вероятнее всего, это связано с ограничениями, налагаемыми на уровне трансляции рекомбинантных белков в хлоропластах.
Full Text
About the authors
Ю. В. Сидорчук
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
Author for correspondence.
Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Новосибирск
П. А. Белавин
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Новосибирск
А. А. Загорская
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Новосибирск
Т. В. Маренкова
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Новосибирск
В. В. Кузнецов
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Новосибирск
Е. С. Хайрулина
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Новосибирск
Е. В. Дейнеко
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Новосибирск
References
- Meyers B., Zaltsman A., Lacroix B., Kozlovsky S.V., Krichevsky A. Nuclear and plastid genetic engineering of plants: comparison of opportunities and challenges // Biotechnol. Adv. 2010. V. 28. P. 28747. https:doi: 10.1016/j.biotechadv.2010.05.022
- Rozov S.M., Sidorchuk Yu.V., Deineko E.V. Transplastomic plants: problems of production and their solution. // Russ. J. Plant Physiol. 2022. V. 69. P. 132. https:doi.org/10.1134/S1021443722020157
- Oey M., Lohse M., Kreikemeyer B., Bock R. Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic // Plant J. 2009. V. 57. P. 436. https:doi.org/10.1111/j.1365-313X.2008.03702.x
- Scotti N., Cardi T. Transgene-induced pleiotropic effects in transplastomic plants // Biotechnol Lett. 2014. V. 36. P. 229. https:doi: 10.1007/s10529-013-1356-6
- Fuentes P., Armarego-Marriott T., Bock R. Plastid transformation and its application in metabolic engineering // Curr. Opin. Biotechnol. 2018. V. 49. P. 10. https:doi.org/10.1016/j.copbio.2017.07.004
- Jensen P.E., Scharff L.B. Engineering of plastids to optimize the production of high-value metabolites and proteins // Curr. Opin. Biotechnol. 2019. V. 59. P. 8. https:doi.org/10.1016/j.copbio.2019.01.009
- Bock R. Transplastomic approaches for metabolic engineering // Curr. Opin. Plant Biol. 2022. V. 66. Р. 102185. https:doi.org/10.1016/j.pbi.2022.102185
- Daniell H., Lin Ch.-S., Yu M., Chang W.-J. Chloroplast genomes: diversity, evolution, and applications in genetic engineering // Genome Biol. 2016. V. 17. Р. 134. https:doi.org/10.1186/s13059-016-1004-2
- Yu Y., Yu P.-C., Chang W.-J., Yu K., Lin C.-S. Plastid transformation: how does it work? Can it be applied to crops? What can it offer? // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. Р. 4854. https:doi.org/10.3390/ijms21144854
- Bock R. Engineering plastid genomes: methods, tools, and applications in basic research and biotechnology // Ann. Rev. Plant Biol. 2015. V. 66. P. 211. https:doi.org/10.1146/annurev-arplant-050213-040212
- Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473. https:doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x
- Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G., Sanders P.R., Lloyd A., Hoffmann N. Inheritance of functional foreign genes in plants // Sci. 1984. V. 223. P. 496. https:doi: 10.1126/science.223.4635.496
- Allen G., Flores-Vergara M., Krasynanski S., Kumar S., Thompson W.F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide // Nat. Protoc. 2006. V. 1. P. 2320. https:doi.org/10.1038/nprot.2006.384
- Drescher A., Ruf S., Calsa T.Jr., Carrer H., Bock R. The two largest chloroplast genome-encoded open reading frames of higher plants are essential genes. // Plant J. 2000. V. 22. P. 97. https:doi.org/10.1046/j.1365-313x.2000.00722.x
- Shen H., Qian B., L Yang., Liang W., Chen W., Liu Z., Zhang D. Estimation of the homoplasmy degree for transplastomic tobacco using quantitative real-time PCR // Eur. Food Res. Technol. 2010. V. 231. P. 143. https:doi: 10.1007/s00217-010-1265-z
- Yu Q., LaManna L.M., Kelly M.E., Lutz K.A., Maliga P. New tools for engineering the arabidopsis plastid genome // Plant Physiol. 2019. V. 181. P. 394. https:doi.org/10.1104/pp.19.00761
- Yu Q., Tungsuchat-Huang T., Verma K., Radler M.R., Maliga P. Independent translation of ORFs in dicistronic operons, synthetic building blocks for polycistronic chloroplast gene expression // Plant J. 2020. V. 103. P. 2318. https:doi.org/10.1111/tpj.14864
- Herz S., Füßl M., Steiger S. Koop H.-U. Development of novel types of plastid transformation vectors and evaluation of factors controlling expression // Transgenic Res. 2005. V. 14. P. 969. https:doi.org/10.1007/s11248-005-2542-7
- Tangphatsornruang S., Birch-Machin I., Newell C.A., Gray J.C. The effect of different 3′ untranslated regions on the accumulation and stability of transcripts of a gfp transgene in chloroplasts of transplastomic tobacco // Plant Mol. Biol. 2011. V. 76. P. 385. https:doi.org/10.1007/s11103-010-9689-1
- Dhingra A., Daniell H. Chloroplast genetic engineering via organogenesis or somatic embryogenesis // Meth. Mol. Biol. 2006. V. 323. P. 245. https:doi: 10.1385/1-59745-003-0:245.
- Ruhlman T., Verma D., Samson N., Daniell H. The role of heterologous chloroplast sequence elements in transgene integration and expression // Plant Physiol. 2010. V. 152. P. 2088. https:doi.org/10.1104/pp.109.152017
- Lacroix B., Citovsky V. Biolistic approach for transient gene expression studies in plants // Meth. Mol. Biol. 2020. V. 2124. P. 125. https:doi.org/10.1007/978-1-0716-0356-7_6
- Hibberd J.M., Linley Ph.J., Khan M.S., Gray J.C. Transient expression of green fluorescent protein in various plastid types following microprojectile bombardment // Plant J. 1998. V. 16. P. 627. https:doi.org/10.1046/j.1365-313x.1998.00328.x
- Kwak S.Y., Lew T.T.S., Sweeney C.J., Koman V.B., Wong M.H., Bohmert-Tatarev K., Snell K.D., Seo J.S., Chua N.H., Strano M.S. Chloroplast-selective gene delivery and expression in planta using chitosan-complexed single-walled carbon nanotube carriers // Nat. Nanotech. 2019. V. 14. P. 447. https:doi.org/10.1038/s41565-019-0375-4
- Daniell H., Ruiz G., Denes B., Sandberg L., Langridge W. Optimization of codon composition and regulatory elements for expression of human insulin like growth factor-1 in transgenic chloroplasts and evaluation of structural identity and function // BMC Biotech. 2009. V. 9. Р. 33. https:doi.org/10.1186/1472-6750-9-33
- Khakhlova O., Bock R. Elimination of deleterious mutations in plastid genomes by gene conversion. // Plant J. 2006. V. 46. P. 85. https:doi.org/10.1111/j.1365-313X.2006.02673.x
- Gerasymenko I.M., Sheludko Y.V., Klebanovych A.A., Rudas V.A., Shakhovsky A.M., Klein T.M., Kuchuk N.V. Comparison of effectiveness of 5′-regulatory sequences in transplastomic tobacco chloroplasts // Transgenic Res. 2017. V. 26. P. 65. https:doi.org/10.1007/s11248-016-9980-2
- Sheludko Y.V., Gerasymenko I.M., Herrmann F.J., Warzecha H. Evaluation of biotransformation capacity of transplastomic plants and hairy roots of Nicotiana tabacum expressing human cytochrome P450 2D6 // Transgenic Res. 2022. V. 31. P. 351. https:doi.org/10.1007/s11248-022-00305-x
- Wang Y., Wei Zh., Fan J., Song X., Xing Sh. Hyper-expression of GFP-fused active hFGF21 in tobacco chloroplasts // Protein Expr. Purif. 2023. V. 208. Р. 106271. https:doi.org/10.1016/j.pep.2023.106271.
- Zhou F., Badillo-Corona J.A., Karcher D., Gonzalez-Rabade N., Piepenburg K., Borchers A.-M.I., Maloney A.P., Kavanagh T.A., Gray J.C., Bock R. High-level expression of human immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes // Plant Biotech. J. 2008. V. 6. P. 897. https:doi.org/10.1111/j.1467-7652.2008.00356.x
- Kwon K.-C., Chan H.-T., Leon I.R., Williams-Carrier R., Barkan A., Daniell H. Codon optimization to enhance expression yields insights into chloroplast translation // Plant Physiol. 2016. V. 172. P. 62. https:doi.org/10.1104/pp.16.00981
Supplementary files
Supplementary Files
Action
1.
JATS XML
2.
Fig. 1. The scheme of the pPlastEx-GFP genetic design for the expression of egfp and aadA genes in tobacco plastids (chloroplasts). PrrnG10L is a promoter of the rRNA operon (Prrn) fused with the leader sequence of the T7 phage gene 10 (G10L), egfp is the coding sequence of the green fluorescent protein gene, RBS is the ribosome binding site, aadA is the coding sequence of the spectinomycin resistance gene, TpsbA is the terminator of the psbA gene encoding photosystem II protein D1, LF and RF – left and right flanking sequences.
Download (84KB)
3.
Fig. 2. Evaluation of the expression activity of the pPlastEx_GFP genetic construct in E. coli cells. a-g cells of E. coli transformed by the expression vector on a nutrient medium with a different content of spectinomycin. (a) - 50 mg/l; (b) – 100 mg/l; (c) – 200 mg/l; (d) – 400 mg/l. The green color is eGFP fluorescence. * – colonies that do not express egfp.
Download (528KB)
4.
Fig. 3. Electrophoregram of amplification products in 1% agarose gel (using the example of 7 samples), confirming the presence of aadA and egfp genes in the genome of transplastomic plants. M – marker of molecular weights Step100 Long.
Download (171KB)
5.
Fig. 4. Detection of recombinant eGFP using confocal microscopy on the example of closing stomatal cells in tobacco leaves. a – eGFP fluorescence in chloroplasts; b – autofluorescence of chloroplasts; c – phase contrast; d – combination. Scale range: 10 microns.
Download (667KB)
6.
Fig. 5. Accumulation of recombinant eGFP protein in lines of transplastomic plants and nuclear transformants. a – transplastomic tobacco plants of the T1 generation obtained from self–pollination of the initial T0 transformants; b - transplastomic tobacco regenerant plants R2 obtained as a result of two rounds of regeneration from leaf explants of the initial T0 transplastomic transformants (blue columns – transplastomic plants of the T1 generation, for comparison, obtained from the same initial T0); c – nuclear transformers of the T0 generation.
Download (499KB)
7.
Fig. 6. The expression level of the aadA and egfp genes as part of the pPlastEx_GFP genetic construct in plastids of transplastomic plants by accumulation of matrix RNA. a – plants of generation T1; b – regenerating plants of generation R2; blue (1) – aadA; green (2) – egfp; rel. units – relative units.
Download (323KB)
8.
Fig. 7. Determination of the homoplasmia of transplastomic plants. a – in transplastomic plants of T1 generation; b – in transplastomic regenerate plants R2: yellow (1) – aadA gene; green (2) – egfp gene; red frame – homoplasmic boundaries; rel. units – relative units.
Download (362KB)
9.
Supplement
Download (417KB)
