Immunohistochemical value to treat patients with chronic endometritis

Full Text

Успехи медицины за последние годы не изменили состояние вопроса о воспалительных заболеваниях половых органов (ВЗПО), в структуре гинекологической патологии ВЗПО по-прежнему занимают 1-е место. Но изменилась ситуация с бесплодием и репродуктивными потерями, в последние годы их частота возрастает [1, 3, 5, 8]. К примеру, воспалительные заболевания матки и эндометрия, так называемый «маточный фактор» бесплодия, встречаются более чем у половины женщин репродуктивного возраста [9, 11]. Самой частой причиной маточного бесплодия является хронический эндометрит (ХЭ). Особенность этой нозологии определяется значительными трудностями ее распознавания [9]. Проблеме ХЭ как причины репродуктивных потерь посвящено много работ, вместе с тем в настоящее время отмечается недостаточность внимания врачей-специалистов к оптимизации профилактики и лечения женщин с этой патологией как к резерву повышения фертильности. Неизменно высокая частота ХЭ опровергает принадлежность проблемы к разряду банальных, более того, контрверсии последних лет постулируют уход от однобокого восприятия заболевания исключительно как классического гнойно-воспалительного процесса, осложняющего, согласно статистике, каждый 4–5-й хирургический аборт [6].

Хронический эндометрит — клинико-морфологический синдром, при котором в результате длительного повреждения эндометрия инфекционным (и/или вирусным) агентом возникают морфофункциональные изменения, нарушающие циклическую трансформацию и рецепторный аппарат слизистой оболочки тела матки. Среди пациенток с ХЭ 97,6 % составляют женщины репродуктивного возраста, что подчеркивает особую значимость данной патологии с точки зрения влияния на репродуктивную функцию [4, 9]. По разным данным, у женщин с бесплодием ХЭ встречается в 12–68 % случаев, достигая максимума при наличии трубно-перитонеального фактора бесплодия. Среди пациенток с неудачными попытками экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбрионов (ПЭ) частота ХЭ составляет 60 % и более [9]. Корреляция между ХЭ и привычным невынашиванием беременности (ПНБ) отмечена в 60,5–86,7 % случаев [6].

К факторам риска развития ХЭ можно отнести все инвазивные вмешательства в полости матки (гистероскопия, выскабливание полости матки, биопсия эндометрия, гистеросальпингография, манипуляции в программах вспомогательных репродуктивных технологий и др.), инфекционно-воспалительные осложнения после беременностей и родов, внутриматочную контрацепцию, инфекции влагалища и шейки матки, деформации полового тракта с нарушением оттока выделений [10]. Важная роль в развитии ХЭ на сегодняшний день принадлежит облигатно-анаэробным микроорганизмам — бактероидам и пептострептококкам в сочетании с микроаэрофилами (микоплазмами и гарднереллами), а также факультативно-анаэробным микроорганизмам (эшерихии, энтерококки, стрептококки группы В) [7, 11]. Особое место в развитии хронического эндометрита занимает герпетическая инфекция. Ее распространенность, в том числе среди пациенток репродуктивного возраста, достаточно высокая. Герпесвирусная инфекция способна поражать практически все органы и системы организма хозяина. К сожалению, ухудшение экологической обстановки, рост стрессовых ситуаций, нерациональное назначение лекарственных препаратов приводят к увеличению частоты иммунодефицитных состояний, на фоне которых происходит активация и генерализация персистирующей герпетической инфекции. Герпетический эндометрит возникает, как правило, у страдающих атипичными или бессимптомными формами генитального герпеса и вызван длительной персистенцией вируса простого герпеса (ВПГ) в эндометрии [2].

В настоящее время нет четких критериев поэтапной диагностики, профилактики ХЭ и программы восстановления репродуктивной функции женщин с наличием ХЭ [5, 6]. Следует отметить, что в литературе нет данных о роли вирусных агентов в этиологии ХЭ. Представления о данном процессе фрагментарны и мало изучены, что отражается на подборе и проведении этиотропной терапии, направленной на элиминацию инфекционного агента. Это во многом определяет сложности профилактики, лечения и восстановления репродуктивной функции при хроническом эндометрите и требует дополнительных исследований.

Цель исследования

Оптимизировать алгоритм диагностики ХЭ.

Задачи исследования

При планировании и проведении настоящего исследования перед нами стояли следующие цели: 1) обследовать женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом на предмет ХЭ; 2) оценить состояние эндометрия при хроническом эндометрите по данным гистологического и иммуногистохимического исследований; 3) на основе полученных клинико-лабораторных и иммуноморфологических данных предложить алгоритм восстановления репродуктивной функции женщин с ХЭ.

Материалы и методы

Исследование проводилось на базе СПбГБУЗ «Женская консультация № 22» (Санкт-Петербург) и кафедры патологической анатомии с курсом судебной медицины Санкт-Петербургского государственного педиатрического медицинского университета.

Объектом исследования стали 60 женщин репродуктивного возраста (18–35 лет) вне беременности, из них: 40 — с репродуктивными потерями в анамнезе (основная группа) и 20 — без репродуктивных потерь в анамнезе (группа сравнения). Отбор пациенток происходил случайно, по мере обращения в женскую консультацию.

Критерии включения в основную группу:

• небеременные женщины в возрасте от 18 до 35 лет, у которых в анамнезе были самопроизвольные прерывания беременности, в том числе неразвивающаяся беременность, преждевременные роды, антенатальная гибель плода, выскабливания полости матки по поводу прерывания беременности «по желанию», женщины с вторичным бесплодием, обусловленным маточным фактором, а именно развившимся ХЭ, вызванным персистенцией патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;
• информированное добровольное согласие пациентки на проведение всех необходимых лечебно-диагностических мероприятий.

Критерии включения в контрольную группу:

• небеременные женщины в возрасте от 18 до 35 лет без репродуктивных потерь в анамнезе;
• информированное добровольное согласие пациентки на проведение всех необходимых лечебно-диагностических мероприятий.

Критерии исключения из обеих групп:

• женщины с пороками развития половых органов;
• опухоли половых органов;
• эндокринная патология (нарушения желез внутренней секреции, влияющие на репродуктивную функцию);
• серьезные экстрагенитальные заболевания.

Пациенткам проводилось клинико-лабораторное обследование: взятие мазков на микробиоценоз, ПЦР real-time на репродуктивно значимые инфекции. Ультразвуковая диагностика проводилась всем женщинам в I фазу менструального цикла (5–7-й день менструального цикла). На 9–11-й день менструального цикла выполнялась аспирационная биопсия эндометрия с последующими гистологическим и иммуногистохимическим исследованиями биоптата. Для морфологических исследований использовали серийные парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином и эозином. Полученные образцы ткани эндометрия фиксировали 10 % раствором формалина в течение 24 ч. После соответствующей обработки образцы эндометрия заключали в парафин, парафиновые срезы толщиной один микрон окрашивали гематоксилином и эозином. Для верификации диагноза использовались следующие морфологические признаки ХЭ: 1) наличие в эндометрии воспалительных инфильтратов, состоящих преимущественно из лимфоидных элементов с включением макрофагов и эозинофилов, расположенных чаще вокруг желез и кровеносных сосудов, реже диффузно; 2) наличие в инфильтратах плазматических клеток; 3) очаговое фиброзирование стромы эндометрия; 4) склеротические изменения стенок спиральных артерий эндометрия.

Иммуногистохимические (ИГХ) исследования материала на парафиновых срезах проводили по схеме, рекомендуемой фирмой-производителем. В работе использовались мышиные моноклональные антитела к эстрогеновым рецепторам (клон 6F11 фирмы Leica, США) и прогестероновым рецепторам (клон R6R-312 фирмы Novocastra, Великобритания), а также поликлональные антитела к ВПГ фирмы Daco (Дания), моноклональные антитела к цитомегаловирусу (ЦМВ) и вирусу Эпштейна – Барр фирмы Novocastra (Великобритания). Количественный анализ результатов иммуногистохимических реакций проводили под увеличением объектива ×400.

ИГХ-реакция в строме оценивалась только в ее резидентных клетках. Интенсивность ИГХ-реакции к эстрогену и к прогестерону в ядрах клеток эпителия желез и стромы оценивали по методике гистологического счета H-score по формуле

S = 1a + 2b + 3c,

где а — процент слабо окрашенных ядер клеток; b — процент умеренно окрашенных ядер клеток; с — процент сильно окрашенных ядер клеток.

Проводилась балльная оценка степени выраженности экспрессии к эстрогену и прогестерону: 0–10 баллов — отсутствие экспрессии, 11–100 баллов — слабая экспрессия, 101–200 баллов — умеренная экспрессия, 201–300 баллов — выраженная экспрессия. Интенсивность реакции антигенов к ВПГ, ЦМВ, вирусу Эпштейна – Барр оценивалась полуколичественным способом: слабая «+» — 1–10 клеток, имеющих положительную окраску, умеренная «++» — 11–20 клеток, имеющих положительную окраску, резко положительная «+++» — 21 и более клеток, имеющих положительную окраску ядер или цитоплазмы во всем срезе. Результаты исследования параметров местного иммунитета (CD56+, CD16+ и HLA-DR(II)+) измеряли количественным способом, просматривая в световом микроскопе окрашенные иммуногистохимическим методом ткани в трех полях зрения. Подсчитывали количество положительно окрашенных клеток (экспрессирующих изучаемые маркеры) в каждом поле зрения. В случае незначительного разброса количественных показателей в разных полях зрения определялось среднее арифметическое значение. При количестве клеток, экспрессирующих CD56+, CD16+, HLA-DR(II)+ от 0 до 10 в поле зрения, диагностируют отсутствие эндометрита. При количестве клеток, экспрессирующих CD56+ выше 10, и при количестве клеток, экспрессирующих CD16+ и HLA-DR(II)+ от 0 до 10 в поле зрения, диагностируют аутоиммунный хронический эндометрит. При количестве клеток, экспрессирующих CD56+, CD16+, HLA-DR(II)+ выше 10 в поле зрения, диагностируют обострение аутоиммунного хронического эндометрита. При количестве клеток, экспрессирующих CD16+ и HLA-DR(II)+ выше 10, и при количестве клеток, экспрессирующих CD56+ от 0 до 10 в поле зрения, диагностируют хронический эндометрит с обострением или острый эндометрит. При количестве клеток, экспрессирующих CD16+, CD56+ выше 10, и при количестве клеток, экспрессирующих HLA-DR(II)+ от 0 до 10 в поле зрения, диагностируют хроническое воспаление с аутоиммунным компонентом, но без активации процесса. При количестве клеток, экспрессирующих CD16+ выше 10, и при количестве клеток, экспрессирующих CD56+ и HLA-DR(II)+ от 0 до 10 в поле зрения, диагностируют хронический эндометрит.

Для идентификации патогенных микроорганизмов выполнялась хромато-масс-спектрометрия.

Контроль эффективности лечения проводился через 3 месяца после проведенной терапии путем взятия аспирационной биопсии на 9–11-й день менструального цикла с последующими гистологическим и иммуногистохимическим исследованиями биоптата.

Результаты и их обсуждение

Средний возраст обследуемых пациенток составил 31,9 ± 0,16 года в 1-й группе и 29,4 ± 1,2 года во 2-й группе. Достоверных различий по основным параметрам здоровья в группах выявлено не было (р > 0,05).

При анализе соматических заболеваний было установлено, что приоритетные позиции занимали заболевания почек и мочевыводящих путей, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), органов зрения и варикозная болезнь. При этом заболевания почек и мочевыводящих путей достоверно чаще наблюдались у пациенток 1-й группы (42,5 %) по сравнению с пациентками 2-й группы (10,0 %) (р < 0,05).

При анализе гинекологического анамнеза статистической достоверной разницы в возрасте наступления менархе между двумя группами выявлено не было (р > 0,05). Обращало на себя внимание, что в 1-й группе количество пациенток, начавших раннюю половую жизнь (60 %), статистически достоверно больше по сравнению с пациентками 2-й группы (30 %) (р < 0,05); что у каждой второй пациентки 1-й группы было более трех половых партнеров, во 2-й группе у каждой 4-й пациентки было более трех половых партнеров.

В 1-й группе роды были у 29 (72,5 %) пациенток, во 2-й группе — у 14 (70 %). Одни роды отмечались у 21 женщины (72,4 %) 1-й группы и у 12 (92,3 %) женщин 2-й группы, у четырех (27,6 %) пациенток в 1-й группе было 2 родов в анамнезе, столько же у одной пациентке (7,7 %) во 2-й группе. При этом роды через естественные родовые пути были у 19 (65,5 %) человек в 1-й группе и у 10 человек (71,4 %) 2-й группы, роды путем операции кесарева сечения у 10 человек (34,5 %) 1-й группы и у 4 человек (28,6 %) во 2-й группе. В ходе исследования не было выявлено статистически достоверной разницы между двумя группами в способе родоразрешения (р > 0,05). Артифициальный аборт в анамнезе отмечен у 20 женщин (50 %), при этом в 55 % случаев имело место хирургическое прерывание беременности, в 14 % случаев медикаментозное прерывание беременности, а в 33 % случаев беременности прерывались обоими методами; спонтанное прерывание беременности отмечено у 11 пациенток (27,5 %).

При сравнении данных УЗИ была выявлена статистически значимая разница в таких косвенных признаках ХЭ, как неоднородность эхоструктуры эндометрия (р < 0,05) и неоднородность толщины слоя эндометрия (р < 0,05). По таким признакам, как расширение полости матки, увеличение переднезаднего размера матки, статистически достоверной разницы выявлено не было (р > 0,05).

Анализ образцов эндометрия при морфологическом исследовании и ИГХ-исследовании представлен в таблице 1.

Таблица 1. Анализ образцов эндометрия при морфологическом исследовании и ИГХ-исследовании

Из таблицы видно наличие морфологических признаков ХЭ у 82,5 % пациенток из 1-й группы и отсутствие данных признаков у пациенток 2-й группы (р < 0,05). ИГХ-анализ выявил наличие антигенов (АГ) ВПГ у 23 пациенток (57,5 %) 1-й группы и двоих пациенток (10 %) 2-й группы (р < 0,05); АГ вируса Эпштейна – Барр (ВЭБ) — у 6 пациенток (15 %) 1-й группы, у пациенток 2-й группы АГ ВЭБ выявлено не было; АГ ЦМВ были выявлены у 10 пациенток (25 %) 1-й группы и у 1 пациентки (5 %) из 2-й группы. При оценке рецепторного аппарата эндометрия не было выявлено статистически достоверной разницы в выраженности экспрессии рецепторов к эстрогену ни в строме, ни в железах эндометрия в обеих группах (р > 0,05), однако при оценке выраженности экспрессии рецепторов к прогестерону в строме эндометрия в 52,5 % случаев в 1-й группе была выявлена выраженная экспрессия рецепторов к прогестерону по сравнению с 15 % случаев во 2-й группе (р < 0,05). Аналогичная картина выраженности экспрессии рецепторов к прогестерону наблюдалась и в железах эндометрия: 62,5 % в 1-й группе и 5 % во 2-й группе (р < 0,05). По результатам исследования параметров местного иммунитета (CD56+, CD16+ и HLA-DR(II)+) у всех пациенток 1-й группы было выявлено CD16+ более 10 в поле зрения и у 42,8 % экспрессия HLA-DR(II)+ более 10 в поле зрения, у пациенток 2-й группы экспрессия данных маркеров выявлена не была (р < 0,05). Маркер плазматических клеток (CD138) также был выявлен у всех обследованных пациенток 1-й группы и не выявлен у пациенток 2-й группы (р < 0,05).

По данным хромато-масс-спектрометрии у пациенток 1-й группы в 60 % случаев обнаруживались Propionibacterium freundenreihii, в 62,5 % случаев — Streptococcus/Ruminococcus, в 47,5 % — Clostridium Coccoides и в 35 % — Streptococcus mutans, у пациенток 2-й группы данные микроорганизмы обнаруживались в предельно допустимых значениях.

Пациенткам 1-й группы с целью элиминации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов проводился пролонгированный курс антибактериальной терапии (защищенными пенициллинами и макролидами). Пациенткам, у которых по данным ИГХ были выявлен АТ к ВПГ, ЦМВ, вирусу Эпштейна – Барр, проводилась противовирусная терапия препаратом «Фамцикловир» в дозировке 250 мг 2 раза в день курсом 3 месяца и иммуномодулирующая терапия препаратом «Панавир» (полисахариды побегов Solanum tuberosum) курсом пять внутривенных инъекций. Вторым этапом осуществлялась физиотерапевтическое лечение (электрофорез с Zn и Сu по 5 процедур) и назначались препараты, направленные на улучшение маточного кровотока — дипиридамол (курантил).

После клинико-лабораторного обследования и проведенного лечения через 3 месяца пациенткам 1-й группы была выполнена контрольная аспирационная биопсия эндометрия.

Оценка состояния эндометрия подтвердила эффективность назначенной терапии: морфологические признаки ХЭ были отмечены у 12,5 %, АГ ВПГ отмечались у 12,5 %, АГ ЦМВ и АГ ВЭБ выявлены не были. Также данные контрольной хромато-масс-спектрометрии выявили в 7,5 % случаев Propionibacterium freundenreihii, в 10 % случаев Streptococcus/Ruminococcus, в 5 % Clostridium Coccoides и в 5 % Streptococcus mutans, что является статистически достоверно значимым (р < 0,05) и может свидетельствовать о рациональности представленной схемы терапии и эффективности проведенного лечения ХЭ.

Заключение

В ходе исследования ХЭ был выявлен у 82,5 % пациенток с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, в группе контроля ХЭ обнаружен не был. Специфическая иммуногистохимическая методика позволила диагностировать смешанную бактериально-вирусную этиологию ХЭ, что имело большое значение при подборе фармакологических препаратов с целью элиминации возбудителей. Представленные алгоритм диагностики и рациональная схема терапии ХЭ, подкрепленные статистически значимыми эффективными результатами, могут использоваться врачами-специалистами, работающими в сфере оценки репродуктивности и повышения фертильности пациенток с бесплодием.

About the authors

Vera A Kolmyk

Author for correspondence.
Email: vera-kolmyk@mail.ru
Postgraduate Student. Department of Children Gynecology and Female Reproductology, Faculty of Postgraduate Education Russian Federation

Ruslan A Nasyrov

Email: rrmd99@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Head. Department of Pathological Anatomy at the rate of Forensic Medicine Russian Federation

Galiya F Kutusheva

Email: Galiya@chadogyn.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Head. Department of Children Gynecology and Female Reproductology, Faculty of Postgraduate Education Russian Federation

Vitaliy V Petrov

Email: petrovit@inbox.ru
MD, PhD, Resident doctor. Department of Military Surgery Russian Federation

Stepan G Grigoryev

Email: Gsg_rj@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Leading Scientist. Department of Medical Service Management Automation Russian Federation

References

Supplementary files