Lysosomal storage diseases. Sphingolipidoses – leukodystrophy

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Лейкодистрофиями называют заболевания, обусловленные демиелинизацией и потерей белого вещества мозга. Это заболевания из группы лизосомных болезней накопления, связанных общим патогенетическим механизмом, в основе которого лежит дефект или дефицит лизосомного фермента и накопление нерасщепленных продуктов в лизосомах клеток [1]. К лизосомным болезням накопления также относятся мукополисахаридозы, сфинголипидозы и ганглиозидозы [1–7]. Суммарная частота наследственных лейкодистрофий составляет 1 : 8000 новорожденных [20]. Среди них к лизосомным болезням накопления относятся метахроматическая лейкодистрофия, глобоид-клеточная лейкодистрофия, или болезнь Краббе, комбинированная сапозиновая и множественная сульфатазная недостаточность.

Метахроматическая лейкодистрофия, которая также называется метахроматической формой диффузного церебрального склероза, или сульфатидным липидозом, относится к нейродегенеративным заболеваниям [8]. Это полиморфная группа наследственных лизосомных болезней, при которых происходит избыточное накопление галактосфингосульфатидов в белом веществе центральной и периферической нервной системы, а также в ряде других органов. Болезнь получила свое название потому, что сульфидные отложения формируют метахроматические гранулы, которые при микроскопическом исследовании отличаются по цвету от окружающего клеточного материала [10]. В первую очередь поражаются миелин-продуцирующие клетки как основные компоненты центральной и периферической нервной системы. Сульфатидные накопления постепенно приводят к разрушению миелиновых оболочек и демиелинизации, снижению эффективности проведения нервных импульсов и потере белого вещества мозга. В результате у пациентов наблюдается прогрессирующее снижение интеллектуальных функций и двигательной активности, вплоть до полной потери способности к самостоятельному передвижению. Сопутствующие проявления заболевания — периферическая нейропатия, недержание (потеря контроля над тазовыми функциями), судорожный синдром, парезы и параличи, регресс речи, зрения и слуха.

В настоящее время идентифицированы две генетические формы заболевания. Наиболее частая аутосомно-рецессивная форма метахроматической лейкодистрофии обусловлена наследственной недостаточностью лизосомного фермента арилсульфатазы А [41, 84]. Вторая значительно более редкая форма заболевания связана с наследственным дефектом активатора цереброзидсульфатазы — сапозина В [61].

Глобоид-клеточная лейкодистрофия, или болезнь Краббе, — это аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное наследственной недостаточностью каталитической активности лизосомного фермента галактоцереброзидазы вследствие мутаций в соответствующем гене — GALC [92]. В основе патогенеза заболевания лежит демиелинизация и разрушение белого вещества центральной и периферической нервной системы в результате накопления в ней галактозилцерамида и галактозилсфингозина, или психозина. В очень редких случаях болезнь Краббе обусловлена присутствием специфических мутаций в гене просапозина (PSAP). Эти мутации приводят к недостаточности активатора галактоцереброзидазы — сапозина А [100].

Причиной комбинированной сапозиновой недостаточности являются специфические мутации в гене PSAP, приводящие к недостаточности всех сапозинов и избыточному накоплению в нервной системе, костном мозге, печени и других органах глюкозилцерамида и церамида [43].

Множественная сульфатазная недостаточность, или ювенильный сульфатидоз, обусловлен присутствием рецессивных инактивирующих мутаций в гене SUMF1 сульфатаз-модифицирующего фактора 1, участвующего в биосинтезе целого семейства сульфатаз [29, 32]. Патогенез заболевания связан с накоплением сульфатидов, сульфатированных гликозаминогликанов, сфинголипидов и стероидных сульфатов во многих органах и тканях.

МЕТАХРОМАТИЧЕСКАЯ АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНАЯ ЛЕЙКОДИСТРОФИЯ

Клиника и эпидемиология

Для аутосомно-рецессивной метахроматической лейкодистрофии, обусловленной недостаточностью арилсульфатазы А, характерен выраженный клинический полиморфизм. Выделяют 5 вариантов заболевания в зависимости от его дебюта и остаточной активности дефектного фермента: врожденный, поздний инфантильный, ювенильный, взрослый и вариант с псевдонедостаточностью арилсульфатазы А. Врожденная форма заболевания наблюдается в очень редких случаях [88]. Она проявляется в виде апноэ/диспноэ, цианоза, судорог, генерализованной мышечной слабости и гибели ребенка в неонатальном периоде.

Наиболее частый поздний младенческий вариант диагностируют у 50–60 % больных. Первые симптомы болезни обнаруживаются в возрасте 1,5–3 лет. Первыми признаками этой формы метахроматической лейкодистрофии, часто предшествующими поражению со стороны центральной нервной системы (ЦНС), является быстро прогрессирующая периферическая невропатия, характеризующаяся неуклюжестью, мышечной слабостью, нарушением чувствительности и арефлексией. Исследования нервной проводимости (электронейромиография) демонстрируют серьезное замедление моторной и сенсорной проводимости [14]. В дальнейшем развитие спастичности может маскировать симптомы периферической невропатии. Часто наблюдаются расстройства мочеиспускания — поллакиурия, никтурия, задержка мочи, которые могут потребовать катетеризации мочевого пузыря. Следствием периферической нейропатии и спастичности может быть развитие деформации стоп. У части пациентов отмечается нейропатическая боль, поддающаяся успешной терапии габапентином или амитриптилином [14].

К ранним клиническим симптомам также относятся: дизартрия и потеря речи, нарушение походки, двигательные расстройства в виде тремора, атетозных движений, атаксии, развитие нистагма. Позже присоединяются судороги, эпизоды спастичности мышц, вплоть до мышечной ригидности, атрофия зрительных нервов. Нарастает регресс психического развития, зрения, слуха, формируется тетраплегия, бульбарные расстройства [15]. Летальный исход наступает через несколько лет от начала болезни в возрасте от 5 до 10 лет.

Юношеская форма метахроматической лейкодистрофии у 20–30 % больных дебютирует в возрасте 4–15 лет в виде затруднений в обучении и проблем с поведением [15]. Первые симптомы — это поведенческие нарушения, изменение походки и осанки, дизартрия, трудности обучения в школе, прогрессирующая атрофия зрительных нервов, тетрапарез. При неврологическом осмотре выявляют гипо- и арефлексию, атаксию и пирамидную недостаточность [14]. При юношеской форме болезнь прогрессирует медленнее, и развернутая картина заболевания, сходная с той, которая наблюдается у пациентов с поздней инфантильной формой, может наступить после 10–20 лет.

Взрослая форма метахроматической лейкодистрофии встречается у 15–20 % больных. Описаны два клинических фенотипа заболевания. Первый характеризуется симптоматикой со стороны ЦНС в виде пирамидной недостаточности, мозжечковой атаксии, периферической невропатии. Второй начинается с психических расстройств, таких как навязчивые идеи, бред, галлюцинации. У большинства таких пациентов в течение нескольких лет какие-либо проявления периферической невропатии, как правило, отсутствуют [15]. В этих случаях ошибочно устанавливается первоначальный диагноз шизофрении.

При данной форме заболевания избыток метахроматического материала накапливается в большей степени в сером, а не в белом веществе мозга. Болезнь прогрессирует на протяжении 20–30 лет и часто имеет волнообразное течение — периоды относительной стабильности могут чередоваться с периодами быстрого ухудшения состояния.

Демиелинизация при метохроматической лейкодистрофии приводит к двусторонней симметричной аномальной гиперинтенсивности Т2-сигнала, начиная с мозолистого тела и затем вовлекая перивентрикулярное белое вещество. При инфантильной форме заболевание обычно начинается в валике мозолистого тела и теменно-затылочном белом веществе, при взрослой форме — в роструме и белом веществе лобных долей головного мозга [88].

Изменения в области мозолистого тела, выявляемые при магнитно-резонансной томографии (МРТ), становятся характерными ранними признаками заболевания, присутствующими у 71, 94 и 100 % симптоматических пациентов с поздней младенческой, ювенильной и взрослой формами соответственно. У 47 % пациентов с поздней младенческой формой не было изменений на МРТ или были только легкие аномалии белого вещества, даже при наличии симптомов со стороны ЦНС, включая признаки поражения пирамидной системы [97].

В некоторых случаях индивидуумы, у которых активность арилсульфатазы А составляет менее 3–5 % нормы, не имеют клинических проявлений метахроматической лейкодистрофии. Этот вариант называется псевдонедостаточностью арилсульфатазы [40, 54].

У гетерозигот по мутациям в гене арилсульфатазы А не наблюдается неврологических аномалий или изменений на электроэнцефалограмме, однако для них характерно ухудшение показателей при проведении нейропсихологических тестов, включающих пространственные или конструктивные компоненты [59].

Частота метахроматической лейкодистрофии в разных популяциях варьирует в пределах от 1 : 40 000 до 1 : 160 000 населения. Однако в некоторых изолированных популяциях эта частота может быть значительно больше. Так, в небольшой по численности группе евреев, состоящей из 1000–1200 индивидуумов, эмигрировавших в Израиль из Йеменского города Хаббана, частота метахроматической лейкодистрофии с поздним началом составляет 1 на 75 человек [117]. Частота гетерозиготных носителей среди женатых пар, принадлежащих этому сообществу, достигает 17 %, и в некоторых семьях оба супруга оказались гетерозиготными, что позволяет проводить пренатальную диагностику заболевания в этом генетическом изоляте. Повышенная частота метахроматической лейкодистрофии (1 : 8000–10 000) обнаружена и у арабов, проживающих в двух районах Израиля — в районе Иерусалима и в Галилее [120]. Среди западных индейцев Навахо (Navajo Nation) также обнаружена повышенная частота заболевания [51]. Высокая частота метахроматической лейкодистрофии (1 : 2500) зарегистрирована среди потомков небольшой группы индейцев Навайо, переселившихся на запад после конфликта с США в 1860 г. [51]. Ни одного случая заболевания на протяжении 18 лет наблюдений не найдено в восточной группе навайцев. За это время у них родилось около 60 000 детей. Это еще одно хорошо документированное подтверждение последствий «эффекта основателя» и «узкого горлышка бутылки».

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПАТОГЕНЕЗА

При всех возрастных формах заболевания наблюдается одинаково низкая активность арилсульфатазы А. Таким образом, биохимические основы различного дебюта заболевания до сих пор неизвестны. В ряде семей у некоторых здоровых родственников пациентов также обнаруживается низкий уровень каталитической активности фермента по отношению к искусственным и естественным субстратам. В этом случае говорят о псевдонедостаточности арилсульфатазы А. Однако, несмотря на одинаково низкую активность фермента, в культивируемых фибробластах здоровых людей с псевдонедостаточностью арилсульфатазы А катаболизм цероброзидсульфата все же происходит.

Определена кристаллическая структура арилсульфатазы А с разрешением в 2,1 ангстрем [69]. Коровая часть фермента состоит из двух β-листов, соединенных несколькими водородными связями и одним дисульфидным мостиком. Большой центральный β-лист на каждой стороне ассоциирован с несколькими спиральными структурами, сходными с бактериальной щелочной фосфатазой. Четвертичная структура фермента сильно зависит от pH. При нейтральном pH она преимущественно димерная. При кислом лизосомном pH фермент находится в форме гомо-октамера, составленного из четырех расположенных в форме кольца димеров. Равновесие между двумя структурами регулируется депротонизацией остатка glu424.

Картирование и идентификация гена ARSA

Методом соматической гибридизации гены арилсульфатазы А и B были картированы в хромосомах 22 и 5 соответственно [31]. Обнаружение пациента с делецией цитогенетической области 22q13.31-qter позволило уточнить локализацию гена ARSA [80]. Клонирована и секвенирована полноразмерная кДНК гена ARSA [101]. Ген ARSA разделен на восемь экзонов [62]. Соответствующий белковый продукт состоит из 507 аминокислотных остатков, включая 18 аминокислот сигнального пептида и 3 потенциальных сайта гликозилирования. В разных тканях обнаружены три типа мРНК гена ARSA, размером 2,1, 3,7 и 4,8 кб соответственно, которые образуются, по-видимому, за счет использования различных сигналов полиаденилирования.

Мутации в гене ARSA

Большинство мутаций в гене ARSA, идентифицированных у пациентов с аутосомно-рецессивной формой метахроматической лейкодистрофии, миссенс-типа, хотя описаны также сплайсинговые мутации и небольшие делеции [41]. Превалирующими среди них являются 2 мутации: так называемый I-аллель — G-A-замена в донорном сайте сплайсинга экзона 2 (IVS2DS, G-A, +1) и А-аллель — C-T-транзиция, вызывающая замену пролина на лейцин в 426-м положении арилсульфатазы А (P426L) [84]. Интересно, что I-аллель включает еще две молчащие замены в кодирующей части гена ARSA. Гомозиготы по этому аллелю, а также гетерозиготы в компаунде с неизвестной мутацией, как правило, обнаруживаются среди пациентов с поздним началом заболевания. У гомозигот по А-аллелю развиваются ювенильные и взрослые формы метахроматической лейкодистрофии, в то время как компаунд-гетерозиготы, сочетающие одновременно А- и I-аллели, находятся исключительно среди пациентов с ювенильными формами заболевания. Эти два аллеля — А и I — составляют более 50 % всех мутаций в гене ARSA. Частой среди пациентов со взрослой формой заболевания является также миссенс-мутация I179S, хотя она встречается у больных только в компаунде с другими мутациями [68]. По-видимому, в гомозиготном состоянии она ведет себя как псевдоаллель.

Все мутации в гене ARSA делят на два класса: нулевые аллели, при которых активность арилсульфатазы А полностью отсутствует, и R-аллели, при которых сохраняется остаточная активность фермента. Наиболее тяжелые ранние формы метахроматической лейкодистрофии, наблюдаются при сочетании двух нулевых аллелей [18]. При сочетании нулевого аллеля с R-аллелем болезнь носит сходный характер, хотя и прогрессирует медленнее. В каждом из этих двух случаев отмечается раннее вовлечение в патологический процесс периферической нервной системы. Несмотря на значительную вариабельность клинических проявлений, наиболее мягкие формы заболевания наблюдаются у больных, несущих два R-аллеля.

На выборке из 42 пациентов с поздним началом была изучена ассоциация типа мутаций с клиническими особенностями метахроматической лейкодистрофии [87]. Двадцать два из них были гомозиготами по аллелю А (P426L), а остальные 20 — компаунд-гетерозиготами по миссенс-мутации I179S. У гомозигот по аллелю А остаточная активность арилсульфатазы А была меньше по сравнению с компаунд-гетерозиготами. Первым проявлением заболевания у гомозигот было прогрессирующее нарушение походки, обусловленное спастическим парапарезом и церебеллярной атаксией. Скорость периферической нервной проводимости также была снижена. Однако интеллектуальные расстройства появлялись лишь на поздних стадиях заболевания. У компаунд-гетерозигот, напротив, болезнь дебютировала шизофреническими изменениями поведения, социальной дисфункцией и снижением умственных способностей, в то время как двигательные нарушения встречались редко.

Расшифрована молекулярная природа «псевдодефицитного» аллеля — PD-аллель [40]. Оказалось, что этот аллель представляет собой сочетание двух A-G-транзиций в цис-положении. Одна из них — регуляторная мутация в 3'-нетранслируемой области гена, изменяющая первый сигнал полиаденилирования. Другая — миссенс-мутация в 6-м экзоне, приводящая к замене аргинина на серин в 352-м положении белка и к потере сайта N-гликозилирования. В опытах in vitro показано, что направленное введение в нормальную кДНК ARSA мутации, разрушающей сайт гликозилирования, не затрагивает скорость синтеза, устойчивость и каталитические свойства арилсульфатазы А в трансфицированных клетках. В то же время, вторая регуляторная мутация в 3'-области гена приводит к потере 90 % мРНК и специфическому отсутствию одного из транскриптов размером 2,1 кб, активно экспрессирующихся в нормальных фибробластах. Гетерозиготы и гомозиготы по данному аллелю не имеют каких-либо клинических проявлений заболевания. Однако при сочетании «псевдодефицитного» аллеля с другими мутациями, инактивирующими арилсульфатазу А, такими как C-T-транзиция в экзоне 2, сопровождающаяся заменой серина на фенилаланин в 96-м положении белка, развивается тяжелая форма лейкодистрофии.

В некоторых странах аллель «псевдонедостаточности» широко распространен. Его частота в Израиле составляет 15 % [46], в Испании — 12,7 % [24]. При этом частота компаунд-гетерозигот по «псевдоаллелю» и мутантному аллелю в гене арилсульфатазы А может достигать 0,0073 %. Предполагается, что у таких пациентов могут развиваться нейропсихические нарушения в позднем возрасте [49]. Это согласуется с данными о большей по сравнению с контрольным уровнем частоте лиц со сниженной активностью лейкоцитарной арилсульфатазы А среди пациентов с психическими расстройствами [85]. При скрининге здоровых лиц в Мексике, выявлено, что частота псевдодефицита составляет около 2 %, наиболее частые варианты: c.1055A>G (p.Asn352Ser) (rs2071421) и c.*96A>G (rs6151429) [54].

При обследовании 34 индивидуумов с низкой активностью арилсульфатазы А были идентифицированы три генотипических класса [57]. Из них 10 индивидуумов оказались гомозиготами по «псевдоаллелю», 6 — компаунд-гетерозиготами по «псевдоаллелю» и мутантному аллелю, у остальных 16 человек было по два мутантных аллеля. Эти генотипические классы отличались по уровню остаточной активности арилсульфатазы А. Наивысшая активность (10–50 % нормы) была у гомозигот по «псевдоаллелю», которые не имели никаких проявлений метахроматической лейкодистрофии. Остаточная активность арилсульфатазы А у компаунд-гетерозигот составляла около 10 %, но у них была снижена способность деградировать сульфатиды. У некоторых компаунд-гетерозигот наблюдались мягкие неврологические аномалии. У гомозиготных носителей мутантных аллелей остаточная активность фермента и способность деградировать сульфатиды были резко снижены, и они имели как ранние, так и поздние формы метахроматической лейкодистрофии.

Расшифрована молекулярная природа метахроматической лейкодистрофии у евреев-«хаббонитов» [120]. Все они оказались гомозиготами по PD-аллелю и инактивирующей миссенс-мутации P377L. Такой же мутантный генотип часто встречается среди больных с поздним началом у евреев из Йемена, у мусульманских арабов из Иерусалима и у представителей других этнических групп [121]. Не вызывает сомнения существование общего предка у всех этих больных, но как происходило распространение данного мутантного генотипа среди представителей разных национальностей остается неясным.

Все больные из арабских семей, проживающих в районе Иерусалима, оказались гомозиготами по аллелю I и имеют сходный гаплотип по внутригенным полиморфным сайтам [120]. Такой же гаплотип найден у гомозиготных по I-аллелю больных не арабского происхождения из США и Европы. Это указывает на участие «эффекта основателя» в распространении данной мутации и возможности ее попадания в Иерусалим во время Крестового похода. У больных детей из неродственных арабских семей, проживающих в районе Галилеи, напротив, найдены пять разных мутаций в гене ARSA, ассоциированных с четырьмя разными гаплотипами, что указывает на их независимое происхождение [45].

Экспериментальные модели

Создана модель аутосомно-рецессивной метахроматической лейкодистрофии у мышей путем направленного разрушения гена Arsa в эмбриональных стволовых клетках [47]. Хотя в нейрональных и других тканях мутантных животных накапливаются значительные отложения сфинголипидцереброзид-3-сульфата, до двухлетнего возраста ребенка серьезных разрушений белого вещества мозга с прогрессирующей демиелинизацией не происходит. Начиная с 1 года жизни, наблюдается астроглиоз, активация микроглиальных клеток, изменение морфологии клеток Пуркинье дендритов. В акустических ганглиях значительно снижается число нейронов и миелинизированных волокон, что указывает на потерю аудиторного потенциала. При неврологическом обследовании Arsa-дефицитных животных отмечается значительное ухудшение нейродвигательной координации.

Проведены испытания генотерапии аутосомно-рецессивной метахроматической лейкодистрофии на трансгенной модели Arsa-дефицитных мышей путем внутривенного введения рекомбинантной ДНК, содержащей нормальный ген ARSA человека [77]. После однократной инъекции наблюдали высокую активность арилсульфатазы А в печени, умеренную — в периферической нервной системе и почках, и очень низкую — в мозге, а также время- и дозозависимое снижение избытка сульфатида в периферической нервной системе и почках (до 70 %) и отсутствие какого-либо снижения в мозге. Однако после четырех еженедельных инъекций по 20 мг/кг веса животного снижение сульфатидных накоплений происходило также и в ЦНС. Одновременно наблюдали улучшение нейродвигательной координации и общей двигательной активности, что указывает на принципиальную возможность генотерапии и ферментная заместительная терапия аутосомно-рецессивной метахроматической лейкодистрофии.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ

Главными клиническими маркерами метахроматической лейкодистрофии являются прогрессирующие психомоторные расстройства с потерей ранее приобретенных навыков после варьирующего периода нормального развития в сочетании с патологическими изменениями на КТ/МРТ головного мозга в виде участков демиелинизации и атрофии. У больных наблюдается избыточное накопление метахроматических галактосфингосульфатидов с PAS-включениями в белом веществе ЦНС, почках и моче. Содержание белка в спинномозговой жидкости обычно выше 100 мг%. Биохимическим критерием диагноза служит недостаточность каталитической активности арилсульфатазы А в лейкоцитах, плазме и других жидкостях и тканях. Значительное снижение активности арилсульфатазы А наблюдается в культивируемых фибробластах пациентов и промежуточные значения характерны для гетерозигот [55]. Подтверждением диагноза служит идентификация инактивирующих мутаций в гене ARSA.

В качестве одного из методов лечения метахроматической лейкодистрофии с поздним началом предложена и апробирована трансплантация костного мозга от HLA-идентичных родственников больного [13]. После лечения пациентов отмечали улучшение нейропсихологических функций и сульфатидного метаболизма на протяжении 5 лет наблюдений [63, 64].

Во многих медицинских центрах на экспериментальных моделях и в клинических испытаниях исследуется возможность использования современных патогенетических методов лечения метахроматической лейкодистрофии, таких как переливание пуповинной крови, пересадка клеток костного мозга, трансплантация гемопоэтических стволовых клеток и их предварительная генетическая модифицикация ex vivo, ферментная заместительная терапия и генная [88, 93].

При изучении механизмов терапевтического действия трансплантации гемопоэтических стволовых клеток было показано, что эта процедура способна приостановить процесс демиелинизации и индуцировать ремиелинизацию, тем самым способствуя сохранению белого вещества мозга [113]. Так, иммунногистохимический анализ, выполненный на аутопсийных тканях мозга восьми пациентов с метахроматической лейкодистрофией, двум из которых была сделана трансплантация, показал присутствие только у леченных больных метаболически компетентных донорских макрофагов, продуцирующих распределенную по всему белому веществу мозга арилсульфатазу А. Эти макрофаги экспрессируют противовоспалительные маркеры, способные поддержать выживание и дифференцировку олигодендроцитов. Они расщепляют накопленные сульфатиды и могут играть нейропротективную роль, участвуя в процессе ремиелинизации. Подчеркивается важная роль иммуномодуляции в добавлении к метаболической коррекции в улучшении общего терапевтического эффекта, достигаемого при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Целью любого терапевтического подхода при лечении метахроматической лейкодистрофии является устойчивое обеспечение высокого уровня экспрессии арилсульфатазы А в центральной и периферической нервной системе. И в этом смысле генная терапия с использованием аденоассоциированных векторов может обеспечить идеальный баланс между потенциальной эффективностью и безопасностью выбранной процедуры, что уже подтверждено в ряде преклинических испытаний [91].

Однако все эти патогенетические методы пока не нашли широкого применения в клинической практике, и требуются дальнейшие исследования для оценки эффективности и безопасности терапевтических процедур, предлагаемых для лечения метахроматической лейкодистрофии.

МЕТАХРОМАТИЧЕСКАЯ ЛЕЙКОДИСТРОФИЯ, ОБУСЛОВЛЕННАЯ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ САПОЗИНА В

В редких атипичных случаях у пациентов с клиническими проявлениями метахроматической лейкодистрофии активность арилсульфатазы А сохраняется в пределах нормы, и в гене ARSA инактивирующих мутаций не обнаруживается. Однако присутствуют специфические мутации в гене просапзина, приводящие к инактивации сапозина В [60, 61]. Сапозин В образуется из своего предшественника путем протеолитического расщепления. Он является активаторным белком для нескольких лизосомных ферментов, в первую очередь, для арилсульфатазы А. Сапозин В участвует также в контроле транспорта липидов к внешней мембране клеток и может распознаваться иммунной системой [56, 112, 115].

Течение метахроматической лейкодистрофии, обусловленной недостаточностью сапозина В, часто сходно с юношеской или взрослой формой заболевания [35, 102], есть единичное описание поздней инфантильной формы [60]. Однако у больных не изменена структура арилсульфатазы А и ее активность составляет не менее 50 % нормы. Тем не менее в ЦНС и ряде других тканей больных наблюдаются сульфидные отложения, формирующие метахроматические гранулы. В культивируемых фибробластах больных снижен гидролиз цереброзидсульфатов, причем это нарушение нормализуется при добавлении сапозина В.

Недостаточность сапозина В у больных атипичной формой метахроматической лейкодистрофии может быть обусловлена миссенс-мутациями T23I, T216I, C241S в гене PSAP, а также инсерцией 33 нуклеотидов в положении 777–778, связанной с нарушением процесса сплайсинга [50, 61, 111, 116]. Все эти мутации затрагивают участок гена, кодирующий сапозин В. К 2019 г. описано 12 мутаций в гене просапозина В, приводящие к развитию клиники метохроматической лейкодистрофии [60].

ГЛОБОИД-КЛЕТОЧНАЯ ЛЕЙКОДИСТРОФИЯ, БОЛЕЗНЬ КРАББЕ. КЛИНИКА И ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

Глобоид-клеточная лейкодистрофия, или болезнь Краббе, — это аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное наследственной недостаточностью каталитической активности лизосомного фермента галактоцереброзидазы. Для этой формы лейкодистрофии характерно присутствие в тканях мозга «глобоидных» клеток, в которых обычно содержится несколько ядер. В основе патогенеза заболевания лежит тотальная демиелинизация и разрушение белого вещества центральной и периферической нервной системы, обусловленное накоплением галактозилцерамида, или психозина в миелиновых оболочках нервных клеток. Накопление психозина, в первую очередь, оказывает патологическое действие на олигодендроциты и ведет к инфильтрации активированных моноцит/макрофагов в ЦНС. В экспериментальных исследованиях получены доказательства того, что психозин нарушает целостность клеточных мембран [44].

Наиболее частой является ранняя инфантильная форма заболевания, при которой первые проявления в виде повышенной возбудимости, плаксивости, потери ранее приобретенных навыков обнаруживаются в грудном возрасте (от 3 до 6 мес.). Временами наблюдается пронзительный крик, судороги. Появляются мышечная слабость, затруднения в кормлении ребенка, эпизоды гипертермии и возбуждения без каких-либо признаков инфекции, позы напряжения (stiff posture). При неврологическом обследовании обнаруживаются спастические тетрапарезы, нередко атрофия зрительных нервов, снижение слуха. Отмечается отставание в моторном и психическом развитии. Заболевание протекает прогредиентно с появлением бульбарных симптомов, децеребрации, кахексии, судорог, потери зрения. Дети, как правило, погибают в возрасте до 4 лет [16]. Диагноз может быть подтвержден при обнаружении в тканях мозга характерных «глобоидных клеток», производных от моноцит-макрофаговых стволовых клеток костного мозга. В «глобоидных» клетках в избыточном количестве накапливается галактозилцерамид.

При обследовании 38 пациентов с болезнью Краббе в Германии у 30 (79 %) детей болезнь дебютировала в виде раздражительности, нарушения движений, регресса психомоторного развития в первый год жизни, причем у 27 из них до 6 мес. жизни. У остальных первые симптомы отмечались позднее в большом возрастном диапазоне от 1 года до 60 лет [65]. При раннем дебюте наблюдали быстрое прогрессирование заболевания с утратой способности к фиксации взора, необходимостью зондового кормления и летальным исходом. При поздних формах первой и основной жалобой было нарушение походки, скорость прогрессирования была различной [65].

В 10–15 % случаев болезнь дебютирует позднее и прогрессирует медленнее. Выделяют поздние инфантильные (от 6 мес. до 3 лет), ювенильные (от 3 до 8 лет) и даже взрослые формы болезни, специфическим образом распространенные в различных этнических группах [72]. Тяжесть течения заболевания может значительно варьировать даже у членов одной семьи. Первыми клиническими проявлениями заболевания при поздних инфантильных и ювенильных формах могут быть мышечная слабость, приводящая к затруднению при ходьбе, дефекты зрения и снижение интеллектуальных способностей. При взрослых формах спастические парапарезы могут быть единственными проявлениями заболевания. В соматических гибридах, полученных при слиянии культивируемых фибробластов пациентов с различными формами заболевания, комплементации генетических дефектов не наблюдается, что доказывает их аллельную природу [67].

Молекулярные механизмы патогенеза глобоид-клеточной лейкодистрофии, обусловленной недостаточностью галактоцереброзидазы, в настоящее время изучены недостаточно, и для их объяснения выдвигается, по крайней мере, две гипотезы: психозин-индуцируемая демиелинизация и вторичное нейровоспаление, обусловленное накоплением галактозилцерамида в макрофагах [109].

Описаны единичные случаи атипичной болезни Краббе, обусловленной специфическими мутациями в гене просапозина (PSAP), приводящими к недостаточности сапозина А [100]. Сапозин А образуется из первого домена просапозина и является активаторным белком для глюкозилцерамидазы и галактоцереброзидазы. Клинически эта генетическая форма болезни Краббе проявляется уже в первом полугодии жизни тяжелой прогрессирующей неврологической симптоматикой, обусловленной генерализованной атрофией и диффузной демиелинизацией белого вещества мозга. Летальный исход наступает через несколько месяцев после начала заболевания.

В среднем, болезнь Краббе встречается с частотой 1 : 100 000, причем в разных странах эта частота варьирует и составляет: 1,35 — в Нидерландах, 1,21 — в Португалии, 1,00 — в Турции, 0,71 — в Австралии и 0,40 — в Чехии [105]. Наибольшая частота заболевания среди европейских народов зарегистрирована в Швеции — 1 : 50 000 рождений. На Сицилии чаще встречается поздняя инфатильная форма болезни [37]. Необычно высокая частота болезни Краббе — 6 : 1000 новорожденных — зарегистрирована в одном из инбредных религиозных арабских изолятов Израиля, насчитывающих около 8000 жителей [118].

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПАТОГЕНЕЗА

Галактоцереброзидаза, или галактозилцерамидаза, — лизосомный фермент, участвующий в катаболизме предшественника галактоцереброзида — галактозилцерамида, или психозина, — основного липидного компонента миелина, почек и эпителиальных клеток кишечника [26]. Галактоцереброзидаза участвует в гидролизе терминальной галактозы от галактоцеpебpозида, психозина, моногалактозилдиглицерида и лактозилцерамида. При недостаточности этого фермента или белка сапозина А, который помогает ферменту «узнавать» субстрат, происходит накопление этих негидролизованных субстратов в бимолекулярном слое миелинового волокна как центральной, так и периферической нервной системы. Психозин является токсическим веществом для нервной системы, вызывает гибель олигодендроцитов, распад миелинового волокна и образование характерных включений в глиальной ткани — «глобоидных клеток».

У пациентов с глобоид-клеточной лейкодистрофией снижена каталитическая активность галактоцереброзидазы. Однако дефектные формы этого белка иммунологически идентичны нормальному ферменту и, как правило, их содержание у больных также не отличается от контрольного уровня. У гетерозигот наблюдаются промежуточные значения активности галактоцереброзидазы в сыворотке крови, лейкоцитах и фибробластах.

Несмотря на то что первичный биохимический дефект при болезни Краббе был известен достаточно давно, попытки выделить галактоцереброзидазу и получить моноклональные антитела долгое время не удавались. Впервые этот фермент был выделен в чистом виде из лимфоцитов крови [25]. Молекулярный вес галактоцереброзидазы около 73 кД, белок состоит из 669 аминокислот, из которых 26 представляют собой N-терминальный сигнальный пептид. Белок содержит 6 потенциальных сайтов гликозилирования.

Картирование и идентификация гена GALC

Успешному картированию и идентификации гена галактоцереброзидазы способствовало описание генетической линии мышей twitcher с аутосомно-рецессивной лейкодистрофией, энзиматическая природа которой оказалась сходна с метаболической основой болезни Краббе у человека [58]. Локус, ответственный за развитие наследственной лейкодистрофии в линии twitcher, расположен в хромосоме 12 мыши в области, синтенной хромосоме 14 человека [104]. С использованием серии микросателлитных индексных маркеров хромосомы 14 человека ген галактоцереброзидазы (GALC) был картирован в области 14q21-q31 [119]. В дальнейшем с использованием метода гибридизации in situ удалось уточнить расположение гена GALC в области 14q31 [21].

Выделение галактоцереброзидазы в чистом виде из лимфоцитов крови и получение моноклональных антител к этому ферменту позволило изолировать кДНКовые клоны гена GALC из различных тканеспецифических библиотек генов [92]. Ген состоит из 17 экзонов, распределенных на площади около 60 кб геномной ДНК и содержит два альтернативных сайта инициации транскрипции, с которых образуются два белка-предшественника, различающихся только по лидерным последовательностям [70, 71, 105].

Мутации в гене GALC

Обнаружение нонсенс-мутации кДНК гена GALC у одного из пациентов с типичной клиникой болезни Краббе стало доказательством того, что именно этот ген ответственен за развитие заболевания [92]. Второй мутацией в гене GALC, найденной в гомозиготном состоянии у двух неродственных больных инфантильной формой глобоид-клеточной лейкодистрофии, оказалась делеция 30 нуклеотидов, ассоциированная с полиморфной транзицией 502C-T — аллель 502/del [70, 86]. При дополнительном обследовании 46 пациентов с началом заболевания в детском возрасте аллель 502/del в гомозиготном состоянии был найден у 8 больных и в компаунде с другими мутациями в гене GALC — у 5 пациентов. Оказалось, что эта делеция часто присутствует также у больных с поздним дебютом [30]. Таким образом, 502/del относится к классу мажорных мутаций [110].

При обследовании 30 неродственных итальянских больных были идентифицированы 33 различные мутации в гене GALC, включая 15 новых, из которых четыре были миссенс-типа и затрагивали высоко консервативные аминокислотные остатки, семь мутаций со сдвигом рамки считывания, одна сплайсинговая и три нонсенс-мутации [105]. Таким образом, более 70 % мутаций в гене GALC приводят к преждевременному прекращению трансляции и образованию укороченного белка.

При проведении ретроспективного анализа показано, что у итальянских пациентов около 66 % мутаций в гене GALC ассоциированы с поздними формами болезни Краббе [36]. Частой является миссенс-мутация G41S, и ее распространение в Италии объясняется «эффектом основателя». В этом исследовании не было найдено корреляции между возрастом начала заболевания, тяжестью его течения, генотипическими особенностями и остаточной активностью галактоцереброзидазы, которая у гомозигот по G41S варьировала в пределах от 1 до 6 %.

Иной спектр мутаций в гене GALC найден у японских больных глобоид-клеточной лейкодистрофией [114]. Четыре специфические мутации — 12del3ins, I66M + I289V, G270D и T652P — составляют около 57 % всех мутаций в гене GALC в Японии, причем мутации I66M + I289V, G270D и L618S ассоциированы с мягкими формами заболевания.

Экспериментальные модели

В соответствии с гистопатологическими данными, отобранная из природной популяции генетическая линия мышей twitcher является естественной моделью глобоид-клеточной лейкодистрофии, или болезни Краббе, человека [58]. Трансплантация мутантным мышам этой линии костного мозга, полученного от нормальных животных, приводит к увеличению галактоцереброзидазной активности в ЦНС до 15 % нормального уровня, появлению донорских пенистых макрофагов, способных метаболизировать накопившийся галактозилцерамид, и постепенному исчезновению «глобоидных клеток». Подобные трансплантации предотвращают развитие параличей передних конечностей, характерных для мышей данной линии, и продлевают жизнь животных с 30–40 до 100 и более дней [52].

Удивительные результаты были получены при скрещивании мышей линии twitcher с трансгенными «нокаут»-мышами с недостаточностью кислой β-галактозидазы [106]. Оказалось, что мутантные гомозиготны по двум генам (galc–/–, bgal–/–), имеют более мягкий неврологический фенотип и большую продолжительность жизни по сравнению с мышами линии twitcher. Более того, мыши, имеющие один функциональный аллель в гене Gal (galc–/–, bgal+/–), имели более тяжелые проявления лейкодистрофии, более короткую жизнь и более высокий уровень аномальных отложений в мозге по сравнению с мышами линии twitcher. У двойных «нокаут»-мышей были массивные накопления лактозилцерамида во всех исследованных тканях, но только вдвое сниженный по сравнению с нормой уровень галактозилцерамида в мозге. Авторы предположили, что ген кислой β-галактозидазы является модификатором фенотипической экспрессии галактозилцерамидазной недостаточности.

Глобоид-клеточная лейкодистрофия неоднократно описана у кошек и собак, в последнем случае чаще всего принадлежащих к различным породам терьеров [22, 38]. Этих собак используют в качестве экспериментальных моделей для изучения молекулярных основ патогенеза заболевания и оценки эффективности и безопасности различных терапевтических подходов, прежде всего трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и генной терапии. У больных животных в возрасте 2–4 нед. наблюдали значительное повышение психозина в сыворотке крови и спинномозговой жидкости. В дальнейшем концентрация психозина устойчиво возрастала на протяжении всей жизни больных собак и строго коррелировала с тяжестью течения заболевания.

Пресимптоматическая монотерапия болезни Краббе у собак путем интратекального введения нормального гена GALC в составе аденоассоциированного вектора AAV9 приводит к увеличению активности галактоцереброзидазы, нормализации содержания психозина, улучшению процесса миелинизации и подавлению воспаления как в центральной, так и в периферической нервной системе [17]. При этом у собак не развивались тяжелые неврологические проявления глобоид-клеточной лейкодистрофии, и их продолжительность жизни увеличивалась более чем в 7 раз. Эффективность терапии существенно зависит от дозы вводимого препарата, и при высоких дозах положительный эффект может наблюдаться даже при начале лечения в постсимптоматический период.

Лабораторная диагностика, профилактика и лечение

Диагностика основана на клинической картине, инструментальных, лабораторных и молекулярно-генетических исследованиях.

Главные клинические проявления глобоид-клеточной лейкодистрофии — прогрессирующая задержка психомоторного развития, часто очевидная уже на первом году жизни, тонико-клонические судороги, периферическая нейропатия, пирамидные расстройства с последующим развитием децерабрационной ригидности и полной обездвиженности. При исследованиях спинномозговой жидкости выявляют повышение содержание белка.

Данные МРТ отличаются при ранних и поздних формах болезни Краббе. При ранней форме демиелинизация белого вещества отмечается в центральной части головного мозга, перивентрикулярном белом веществе, белом веществе мозжечка и зубчатом ядре. МРТ при поздней инфантильной форме показала перивентрикулярную и преимущественно центральную акцентированную демиелинизацию, аналогичную ранней инфантильной форме, но с поздними аномалиями белого вещества мозжечка. По сравнению с ранней инфантильной формой, поздние инфантильные формы никогда не обнаруживают аномалий зубчатого ядра. Что касается форм с дебютом после первого года жизни, то МРТ-признаком является вовлечение пирамидного тракта, которое может возникать изолированно во взрослой форме или сочетаться с демиелинизацией в теменно-затылочной области и валике мозолистого тела [65].

Биохимическими критериями заболевания являются недостаточность каталитической активности галактоцереброзидазы в лейкоцитах и накопление предшественника галактоцереброзида — галактозилцерамида, или психозина, который вызывает гибель олигодендроцитов и распад миелинового волокна. Диагноз может быть подтвержден при обнаружении характерных «глобоидных клеток», в которых обычно содержится несколько ядер и в избыточном количестве накапливается галактозилцерамид. Подтверждением диагноза считается идентификация мутаций в гене GALC.

Впервые патогенетическое лечение болезни Краббе было произведено путем трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток на выборке из 5 детей с инфантильной (4 детей) и поздней (1 ребенок) формами заболевания [63]. Четверо из этих детей имели серьезные неврологические нарушения. После трансплантации неврологический статус этих больных значительно улучшился. Одному ребенку с инфантильной формой заболевания трансплантация была проведена в возрасте 2 мес., когда неврологические расстройства у него еще не сформировались. Нарушений функций ЦНС у этого ребенка не наблюдалось и спустя 14 мес. после трансплантации. Авторы делают вывод, что трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток может не только восстанавливать неврологические нарушения при болезни Крабе, но и предотвращать их развитие.

При сравнении двух групп пациентов с инфантильной формой болезни Краббе — (1) бессимптомных новорожденных в возрасте от 2 нед. до 1,5 мес. и (2) детей в возрасте от 4 мес. до 1 года, у которых уже были очевидны неврологические симптомы заболевания — показано, что лечение путем трансплантации клеток пуповинной крови от неродственных доноров может быть эффективно только в том случае, если оно начато до появления первых неврологических симптомов заболевания [33]. Трансплантация сопровождалась миелоаблативной химиотерапией. Скорость приживления и выживания донорных клеток составила 100 и 100 % для бессимптомных новорожденных и 100 и 43 % для больных детей. У выживших детей наблюдали устойчивые приживления донор-производных гемопоэтических клеток с сохранением нормальных уровней галактоцереброзидазы в крови. У детей, подвергшихся трансплантации до появления симптомов заболевания, процесс миелинизации в ЦНС не был нарушен, и развитие двигательных и когнитивных функций было близко к норме, хотя в некоторых случаях наблюдалась задержка речи и двигательной активности (gross motor function). У детей при проведении трансплантации после появления первых симптомов заболевания наблюдали лишь минимальные улучшения в функционировании нервной системы.

В связи с этим актуальна разработка программ неонатального скрининга для раннего выявления больных глобоид-клеточной лейкодистрофией. Первые программы были основаны на определении активности галактоцереброзидазы в высушенных пятнах крови новорожденных. Однако этот метод не обладает достаточной специфичностью и дает много ложноположительных результатов. Более чувствительным оказался тест на психозин (PSY), экстрагируемый из высушенных пятен крови или эритроцитов новорожденных и измеряемый методом жидкостной хроматографии — тандемной масс-спектрометрии [42, 107]. Разработанный алгоритм позволяет проводить дифференцировку инфантильных и поздних форм заболевания и выявлять носителей псевдодефицитных аллелей. Тест на психозин оказался пригодным и для мониторинга состояния больных до и в процессе их лечения методом трансплантации клеток пуповинной крови или гемопоэтических стволовых клеток.

Клинический пример болезни Краббе

Пациент мужского пола в возрасте 8 мес. впервые был направлен на консультацию к врачу-генетику в Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Диагностический центр (медико-генетический)» (СПб ГБУЗ МГЦ).

Анамнез жизни: мальчик от 4-й беременности (1-я — замершая, 2-я — медицинский аборт, 3-я — здоровая дочь), протекавшей на фоне анемии, многоводия. Роды срочные на 41-й неделе беременности путем кесарева сечения. Оценка по шкале Апгар 6/7 баллов. Вес при рождении — 4100 г.

Ребенок от кровнородственного брака, отец и мать пробанда — четвероюродные брат и сестра. Родители родом из Дагестана.

Анамнез заболевания: в первые дни жизни в роддоме отмечалась гипербилирубинемия, синдром угнетения нервной системы. С первых месяцев жизни наблюдался неврологом с диагнозом «перинатальное поражение ЦНС», отмечалась задержка психомоторного развития. В возрасте 6 мес. проведено обследование. По данным ультразвукового исследования органов брюшной полости выявлена гепатомегалия и паренхиматозные изменения печени (гепатоз). На электроэнцефалограмме: признаки выраженной дезорганизации регуляторного характера коркового ритма на фоне признаков дисфункции подкорково-диэнцефальных структур. Типичная эпилептиформная активность не зарегистрирована. Нейросонография: диффузные атрофические изменения головного мозга. Изменения в паренхиме мозга могут соответствовать метаболическим нарушениям. Проведено МРТ головного мозга МР-признаки поражения белого вещества головного мозга, вероятнее всего заболевание из группы метаболических энцефалопатий. Наружная заместительная гидроцефалия. Mega cisterna magna.

К 8 мес. по результатам обследования неврологом установлен диагноз: «Детский церебральный паралич, спастико-гиперкинетическая форма. По системе Gross Motor Function Classification System (GMFCS) уровень IV. Задержка психомоторного развития».

Мальчик осмотрен офтальмологом: офтальмопарез обоих глаз.

В связи с подозрением на заболевание из группы наследственных болезней обмена направлен в СПб ГБУЗ МГЦ.

При объективном осмотре врачом-генетиком в возрасте 8 мес. в СПб ГБУЗ МГЦ: телосложение правильное, задержка физического развития. Рост 68,5 см (–2 сигмальных отклонения — SDS), вес 7,75 к (–1,65 SDS), окружность головы 44,6 см (10-й перцентиль), окружность грудной клетки 44 см (менее 3-го перецентиля). Грубая задержка психомоторного развития — голову удерживает с трудом, не переворачивается, не сидит. Микроаномалий развития не обнаружено. Отмечалась очаговая неврологическая симптоматика — изменения по пирамидному типу и мышечная дистония — тонус в нижних конечностях повышен. Живот правильной формы, печень +2 см из-под реберной дуги, селезенка не пальпируется. Суставы интактны.

Результаты обследования в СПб ГБУЗ МГЦ:

• исследование лактата, пирувата в крови и их соотношения — повышение лактата до 3435 (560–2250 мкмоль/л) и пирувата до 289 (29–113 мкмоль/л), соотношение в пределах нормы — 12 (до 20) — данные о наличии митохондриального заболевания сомнительные;
• тандемная масс-спектрометрия (ТМС) — выявлены нарушения в аминокислотном обмене и в окислении длинноцепочечных жирных кислот, вероятно вторичного характера;
• органические кислоты мочи — данных о наличии наследственных ацидурий не получено.

По клиническим данным заподозрено заболевание из группы лизосомных болезней накопления с ранним дебютом.

Для дообследования сухие пятна крови направлены в Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова» (ФГБНУ МГНЦ): скрининг на лизосомные болезни накопления, выявлено снижение активности галактоцереброзидазы до 0,06 (0,7–10,0 мкмоль/(л × ч). При повторном исследовании снижение до 0,1 (0,7–10,0 мкмоль/ч). Установлен диагноз болезни Краббе, инфантильная форма.

Для подтверждения диагноза болезни Краббе в ФГБНУ МГНЦ было проведено молекулярно-генетическое исследование: обнаружена делеция 30 тыс. п. н. в гомозиготном состоянии гена GALC. Методом прямого автоматического секвенирования проведен анализ 5-го экзона. Предшествующий делеции полиморфный вариант c.550C>T (p.Arg184Cys), обнаружен в гомозиготном состоянии. Диагноз болезни Краббе подтвержден на молекулярно-генетическом уровне.

Таким образом, к возрасту 9 мес. ребенку был установлен диагноз наследственного заболевания. Прогноз при инфантильной форме болезни Краббе неблагоприятный, ребенок умер не достигнув возраста 3 лет.

По литературным данным, делеция размером 30 тыс. п. н. (c.1161+6532_polyA+9kbdel) описана одной из первых и является наиболее распространенной мутацией среди пациентов европейского происхождения. Эта делеция начинается около середины интрона 10 и распространяется до экзона 17 плюс дополнительные 9 тыс. п. н. Следовательно, это приводит к удалению кодирующей области для субъединицы 30 кДа и 15 % кодирующей области для субъединицы 50 кДа. Делеция размером 30 тыс. п. н. неизменно связана с полиморфным доброкачественным вариантом c.550C>T на той же аллели. Почти у всех людей с болезнью Краббе активность фермента галактоцереброзидазы снижена до 0–5 % от нормальной активности в лейкоцитах, выделенных из цельной гепаринизированной крови, или в культивированных фибробластах кожи [73].

БОЛЕЗНЬ КРАББЕ, ОБУСЛОВЛЕННАЯ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ САПОЗИНА С

В очень редких случаях у пациентов с глобоид-клеточной лейкодистрофией активность галактоцереброзидазы сохраняется в пределах нормы и мутаций в гене GALC не обнаруживается, но присутствуют специфические мутации в гене просапозина (PSAP). Эти мутации приводят к недостаточности активатора галактоцереброзидазы — сапозина А [100]. Cапозин A — термоустойчивый 16-кД-гликопротеин, образующийся из первого домена просапозина, является вторым активаторным белком для глюкозилцерамидазы и бета-галактозилцерамидазы.

В одной из родственных арабских семей у ребенка с атипичной формой болезни Краббе идентифицирована гомозиготная делеция трех нуклеотидов в гене PSAP, приводящая к отсутствию консервативного валина в 11-м положении зрелого сапозина А [100]. У этого больного была снижена активность галактоцереброзидазы в лейкоцитах, в то время как в фибробластах она сохранялась в пределах нормы. В возрасте 3,5 мес. у девочки развились тяжелые быстро прогрессирующие неврологические нарушения. Спустя 5 мес. ребенок умер от тяжелой энцефалопатии.

Создана трансгенная линия мышей с недостаточностью сапозина А [76]. У нулевых по сапозину А мутантов в возрасте 2,5 мес. начинает развиваться медленно прогрессирующий паралич передних конечностей, гибель наступает через 2–3 мес. Тремор и другие симптомы демиелинизации появляются лишь на конечной стадии заболевания. Качественно патологические и биохимические аномалии идентичны тем, которые наблюдаются при глобоид-клеточной лейкодистрофии, однако у мутантных мышей они выражены в гораздо более мягкой форме. Полученные результаты указывают на то, что сапозин А необходим для деградации галактозилцерамида.

Нулевые мутанты по сапозину А способны размножаться, при этом у самок во время беременности наблюдается улучшение многих неврологических показателей, и в частности, резко снижается уровень демиелинизации и инфильтрации «глобоидных» клеток [75]. Предполагается, что эти улучшения связаны с повышением уровня эстрогена, происходящим во время беременности. Исходя из этих данных, предполагается, что дополнительное назначение эстрогена пациентам с наследственными лейкодистрофиями может в определенной степени способствовать улучшению их состояния.

НЕДОСТАТОЧНОСТЬ ПРОСАПОЗИНА — SAP-ПРЕДШЕСТВЕННИКА АКТИВАТОРОВ СФИНГОЛИПИДОВ

Просапозин — полифункциональный белок, роль которого особенно важна при развитии двух систем — нервной и репродуктивной. После синтеза просапозин расщепляется с образованием четырех небольших белков A, B, C и D, которые называются сапозинами — сфингомиелин-активаторными протеинами [82]. Сапозины являются активаторами лизосомных ферментов, участвующих в деградации сфинголипидов. Сапозины A и D принимают участие в процессинге сфинголипидов, а сапозин С служит активатором для бета-глюкоцереброзидазы — фермента деградации глюкоцереброзида.

Мутации в гене просапозина (PSAP), затрагивающие функции различных сапозинов, могут приводить к четырем нозологически самостоятельным формам лизосомных болезней и одной из аутосомно-доминантных форм болезни Паркинсона [83]. В редких случаях мутации нарушают функции всех сапозинов и становятся причиной комбинированной сапозиновой недостаточности [43]. Чаще всего мутации в гене PSAP приводят к недостаточности сапозина В и обнаруживаются у больных с вариантными формами метахроматической лейкодистрофии [61]. Недостаточность сапозина А обнаруживается также у некоторых пациентов с атипичной формой болезни Краббе [100]. Сапозин С отсутствует у пациентов с тяжелой атипичной формой болезни Гоше [5, 27, 103, 108]. Мутации в гене PSAP, сопровождающиеся инактивацией сапозина D, ассоциированы с одним из наследственных вариантов болезни Паркинсона [83].

Клиника и эпидемиология

Комбинированная сапозиновая недостаточность проявляется вскоре после рождения ребенка в виде грубых неврологических нарушений — гиперкинезов, клонических судорог, фасцикуляций языка и пераукрикулярных мышц — в сочетании с респираторной недостаточностью и гепатоспленомегалией [43, 66]. Характерен «лошадиный» крик. При гистологическом обследовании в костном мозге больных обнаруживаются крупные, лишенные вакуолей клетки, подобные клеткам Гоше, а в клетках печени видны отложения глюкозилцерамида и церамида. В культивируемых фибробластах и лейкоцитах больных снижена активность глюкозилцерамидазы, галактозилцерамидазы и церамидазы. Витальный прогноз неблагоприятный.

Биохимические основы патогенеза

Просапозин — гликопротеин с молекулярным весом 70 кД, состоящий из 511 аминокислот, является предшественником для четырех сапозинов, обозначаемых A, B, C и D [79]. Каждый из доменов просапозина размером примерно 80 аминокислот фланкирован протеолитическими сайтами расщепления и имеет сходное расположение цистеиновых остатков, сайтов гликозилирования и спиралевидных (хеликсных) участков. Просапозин может существовать в двух формах — как секреторный и как интегральный мембранный белок. In vivo он действует как ганглиозид-связывающий и транспортирующий белок, а также как нейротропный фактор [48, 81]. Просапозин и сапозины способны формировать устойчивые комплексы с 13 различными ганглиозидами, трансфецируя их от донорских липосом к мембранам теней эритроцитов. При этом просапозин в большей степени, чем зрелые сапозины, активирует GM1-бета-галактозидазу.

Сапозин B образуется из второго домена просапозина. Это термоустойчивый неэнзиматический активатор арилсульфатазы А, а также α- и β-галактозидазы [82]. Производным третьего домена является сапозин C — активатор β-галактозидазы и β-глюкоцереброзидазы. Предполагается, что сапозины В и C участвуют в транспортировке липидных антигенов от лизосомных мембран к CD1B и облегчают их ассоциацию с CD1D [56, 112, 115]. Высокий процент гомологии между сапозинами A и C позволяет предполагать их происхождение от общего предкового сегмента, дуплицированного в гене просапозина. Сапозин D образуется из четвертого домена просапозина и является активатором для кислой церамидазы и специфической сфингомиелинфосфодиэстеразы [11, 78].

Картирование и идентификация гена PSAP

Методом флуоресцентной гибридизации in situ ген PSAP был картирован в области 10q22.1 [12]. Он состоит из 13 экзонов размером от 57 до 120 нуклеотидов, распределенных на площади около 20 кб [90]. Величина интронов варьирует от 91 до 3812 нуклеотидов. Районы, кодирующие сапозины A, B и D, содержат по три экзона, в то время как сапозин С кодируется двумя экзонами. Анализ положения интронов указывает на то, что ген просапазина до инсерции интронных областей эволюционировал от предкового ДНК-сегмента путем двух дупликаций и, по крайней мере, одной структурной перестройки, включающей двойной кроссинговер.

Мутации в гене PSAP

Мы уже писали о мутациях в гене PSAP, обнаруживаемых у пацентов с атипичными вариантами болезни Гоше, метахроматической лейкодистрофии и болезни Краббе. К комбинированной сапозиновой недостаточности приводят такие мутации в гене PSAP, которые приводят к недостаточности всех сапозинов. Примером может служить гомозиготная делеция одного нуклеотида 803delG в области В домена, сопровождающаяся сдвигом рамки считывания, идентифицированная в одной из словацких семей у пациента с комбинированной сапозиновой недостаточностью [53]. Иммуногистохимический анализ подтвердил отсутствие у него всех четырех сапозинов. В трех семьях с аутосомно-доминантной формой болезни Паркинсона идентифицированы три разных патогенных варианта в гене PSAP, затрагивающие сапозин D [83]. Экзомное секвенирование не выявило никаких других мутаций, ассоциированных с наследственными вариантами болезни Паркинсона или лизосомными болезнями накопления. У всех пациентов был нарушен процесс аутофагии, изменена внутриклеточная локализация просапозина и наблюдалась агрегация альфа-синуклеина в культуре кожных фибробластов или в допаминергических нейронах, дифференцировка которых была индуцирована из плюрипотентных стволовых клеток.

Экспериментальные модели

С использованием техники гомологичной рекомбинации создана модельная «нокаут»-линия мышей с инактивированным геном Psap сфинголипидного активаторного белка просапозина [39]. Значительный процент мутантных животных линии Sap(–/–) погибает в период внутриутробного развития или вскоре после рождения. У выживших мышей наблюдается комплекс фенотипических и биохимических аномалий, сходных с теми, которые характерны для больных с комбинированной сапозиновой недостаточностью. К 18–20 дням у них развивается тремор головы, мышечная слабость и атаксия передних конечностей, которые с возрастом прогрессируют до постоянного тонического статуса и эпилепсии. Гибель животных наступает в 35–38-дневном возрасте на фоне полного истощения. При патологоанатомическом обследовании выявлены тяжелая гипомиелинизация, увеличение общего содержания ганглиозидов и, особенно, моносиалоганглиозидов в мозге и кислые Schiff-положительные включения в нервной системе, а также в аномальных клетках печени и селезенки. В тканях мозга, печени и почек мутантных мышей резко увеличено содержание лактозилцерамида, а также церамида, глюкозилцерамида, галактозилцерамида, сульфатида и глоботриаозилцерамида. В культивируемых фибробластах мутантных животных катаболизм этих веществ был значительно замедлен. Сконструированная модельная линия мышей может быть использована для уточнения функций индивидуальных сапозинов и просапозина, а также для разработки методов терапии соответствующих наследственных заболеваний человека.

У нулевых по сапозину D мутантных мышей в возрасте 2 мес. развивается прогрессирующая полиурия, а в 4 мес. появляются признаки атаксии и почечной тубулярной дегенерации с последующим гидронефрозом [74]. В мозжечке сапозин D-дефицитных мышей происходит прогрессирующая селективная потеря клеток Пуркинье, и к 12 мес. они почти полностью исчезают. В клетках почек, мозга и особенно мозжечка происходит массированное накопление церамидов, что подтверждает роль сапозина D в церамидном метаболизме. В дополнение к этому у мутантных мышей с недостаточностью сапозина D наблюдается прогрессирующая двигательная дисфункция и дегенерация допаминергических нейронов. Эти данные указывают на участие сапозина D в генетическом контроле некоторых аутосомно-доминантных форм болезни Паркинсона.

Лабораторная диагностика и лечение

У детей с тяжелой прогрессирующей неврологической симптоматикой, очевидной уже в неонатальном периоде, в лейкоцитах снижена активность глюкозилцерамидазы, галактозилцерамидазы и церамидазы. Отсутствуют иммунологические формы просапозина. На КТ/МРТ головного мозга выявляются области пониженной плотности белого вещества. Подтверждающим тестом является идентификация в гене PSAP мутаций с преждевременной терминацией трансляции.

Методы патогенетической терапии не описаны.

МНОЖЕСТВЕННАЯ СУЛЬФАТАЗНАЯ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ, МУКОСУЛЬФАТИДОЗ ИЛИ ЮВЕНИЛЬНЫЙ СУЛЬФАТИДОЗ, БОЛЕЗНЬ ОСТИНА

Клиника и эпидемиология

Множественная сульфатазная недостаточность — это аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся накоплением сульфатидов, сульфатированных гликозаминогликанов, сфинголипидов и стероидных сульфатов. В основе патогенеза лежит недостаточность модифицирующего сульфатазу фактора 1, участвующего в биосинтезе целого семейства сульфатаз, обусловленная присутствием инактивирующих мутаций в гене SUMF1 [28, 32].

Клинически болезнь характеризуется комбинированными проявлениями метахроматической лейкодистрофии и мукополисахаридоза [23]. У ребенка наблюдаются тяжелые неврологические нарушения с развитием гидроцефалии, задержкой психомоторного и психоречевого развития вплоть до умственной отсталости, судорожным синдромом, атаксией, сочетающиеся со скелетными аномалиями, рисками стеноза позвоночного канала, низкорослостью, органомегалией, кардиомиопатией, грубыми чертами лица, нейросенсорной тугоухостью, снижением зрения (помутнение роговицы и дегенерация сетчатки) и ихтиозом. На МРТ можно увидеть лейкодистрофию, атрофию коры больших полушарий и мозжечка, вентрикуломегалию, атрофию мозолистого тела, признаки сдавления спинного мозга в шейном отделе позвоночника. Средняя продолжительность жизни детей с множественной сульфатазной недостаточностью составляет по данным метаанализа 13 лет (9,8–16,2 года) [96].

В зависимости от начала заболевания выделяют неонатальные, поздние инфантильные и ювенильные формы.

Наиболее тяжелая форма — неонатальная, с широким спектром проявлений мукополисахаридоза и летальным исходом в первые 2 года жизни. В часть симптомов входят скелетные деформации и гепатоспленомегалия, которые могут возникнуть пренатально [95].

Чаще всего встречается поздняя инфантильная форма с дебютом до 2 лет. Клинически она сходна с поздней инфантильной метахроматической лейкодистрофией, но сопровождается прогрессирующей потерей умственных и двигательных способностей и развитием скелетных аномалий. Потеря большинства навыков происходит к 5 годам.

При редких ювенильных формах болезнь дебютирует позднее — до 4 лет и развивается медленнее [19].

Частота заболевания 1 : 2 000 000, частота гетерозиготного носительства мутаций в гене — 1 : 700.

Биохимические основы патогенеза

Модифицирующий сульфатазу фактор 1, или формилглицин(FGly)-производящий фермент — FGE, участвует в посттрансляционной модификации и каталитической активации целого семейства сульфатаз, основной функцией которых является гидролиз сульфатных эфиров, таких как гликозаминогликаны, сульфолипиды и стероидные сульфаты. Эта модификация, происходящая в эндоплазматическом ретикулуме, заключается в превращении цистеинового остатка в С-α-формилглицин (FGly) — каталитический остаток в активном сайте эукариотических сульфатаз [89]. По крайней мере, 9 сульфатаз не имеют каталитической активности у больных множественной сульфатазной недостаточностью [34].

Коэкспрессия модифицирующего сульфатазу фактора 1 с сульфатазами приводит к потенцированному увеличению их каталитической активности, что указывает на то, что это необходимый и лимитирующий фактор для сульфатаз [28]. Каталитическая активность самого FGE зависит от положения двух аминокислот — cys336 и cys341 — в активном сайте фермента [89]. Эволюционный консерватизм модифицирующего сульфатазу фактора 1, который прослеживается от прокариот до эукариот, свидетельствует о важной биологической функции этого фермента. Идентичность по аминокислотным последовательностям между FGE человека и ортологичными белками мыши и крысы составляет 87 и 94 % соответственно.

Картирование гена SUMF1

Анализ секвенированных геномных ДНК человека показал, что ген SUMF1 расположен в области 3p26 [32]. Это подтверждается также данными по картированию гена Sumf1 в синтенной области генома мыши. Выделение очищенного бычьего FGE позволило изолировать кДНК гена SUMF1 человека, которая кодирует белок протяженностью 374 аминокислоты, 33 из которых являются сигнальной последовательностью. Молекулярный вес этого белка 42–44 кД, он имеет сайт гликозилирования и тройственную доменную структуру. Ген SUMF1 экспрессируется во всех исследованных тканях с образованием мРНК размером в 2,1 кб [28, 32]. Ген разделен на 9 экзонов, распределенных на площади в 105 кб геномной ДНК.

Мутации в гене SUMF1

Идентификация гомозиготных и компаунд-гетерозиготных мутаций в гене SUMF1 у больных множественной сульфатазной недостаточностью стала доказательством его причастности к развитию заболевания [28, 32]. В опытах in vitro показано, что трансдукция нормальной кДНК гена SUMF1 частично восстанавливает сульфатазную активность в культуре фибробластов больных, и этого не происходит, если вводится мутантная кДНК. Спектр мутаций в гене SUMF1 достаточно разнообразен [29]. Это миссенс-, нонсенс-, сплайсинговые мутации и микроделеции. В большинстве случаев идентифицированные мутации полностью разрушают активность всех девяти исследованных сульфатаз. Для двух миссенс-мутаций было показано, что у некоторых сульфатаз сохраняется достаточно высокая остаточная активность. Таким образом, некоторые мутации могут оказывать вариабельный эффект на активность различных сульфатаз.

Анализ взаимодействия между генотипом и фенотипом показал, что пациенты с тяжелыми неонатальными формами множественной сульфатазной недостаточности и нарушением стабильности и каталитической активности модифицирующего сульфатазу фактора 1 чаще всего являются компаунд-гетерозиготами по сплайсинговым и нонсенс-мутациям [94]. Двое больных в этом исследовании с поздним началом и мягким течением заболевания оказались гомозиготами по миссенс-мутации G263V, для которой в опытах in vitro была показана самая высокая остаточная активность некоторых сульфатаз.

Экспериментальные модели

Создана трансгенная «нокаут»-линия мышей с нулевой активностью FGE [99]. Мутантные животные рано умирали и имели фенотипические особенности, сходные с клиническими проявлениями множественной сульфатазной недостаточности, включая врожденную задержку роста, неврологические и скелетные аномалии. Во всех тканях наблюдали массивные лизосомные накопления гликозаминогликанов, коррелирующие с воспалительными процессами, апоптозом и нейродегенерацией. Активность всех сульфатаз у Sumf1-нулевых мышей полностью отсутствовала. В клетках мутантных мышей наблюдали увеличенное количество аутофагосом, обусловленное нарушением их слияния с лизосомами, а также накопления убиквитин-положительных включений и большое число нефункциональных митохондрий [98]. Сходный характер нарушений выявлен также у трансгенных мышей, моделирующих мукополисахаридоз III типа. Авторы предполагают, что нарушение аутофагии может быть общим механизмом, лежащим в основе нейродегенеративных процессов при многих лизосомных болезнях.

Лабораторная диагностика и лечение

У детей с клиническими симптомами мукополисахаридоза и постепенной задержкой и регрессом психомоторных функций в моче повышено содержание сульфатидов, дерматансульфата, гепарансульфата и холестерилсульфата, а в плазме — холестерилсульфата. В лейкоцитах и культуре фибробластов резко снижена активность сульфатаз А, В и С, идуронатсульфатазы, гепаран-N-сульфамидазы и других сульфатаз. Подтверждением диагноза является идентификация мутаций в гене SUMF1.

Хотя предпринимаются попытки производства рекомбинантного модифицирующего сульфатазу фактора 1 с использованием микроРНК-технологии, никакой патогенетической терапии множественной сульфатазной недостаточности в настоящее время не описано [9].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цель нашего обзора состояла в обобщении современных знаний по лейкодистрофиям как отдельной нозологической группе в структуре лизосомных болезней накопления. К сожалению, в настоящее время для большинства лейкодистрофий не разработано патогенетической терапии, но расширение знаний и выявление пациентов с некурабельными заболеваниями несомненно приведет к актуализации поиска подходов к терапии. Для тех форм, где есть возможность трансплантации костного мозга или гемопоэтических стволовых клеток, важным аспектом эффективности терапии является ранняя диагностика заболевания.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли одинаковый равный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

About the authors

Victoria N. Gorbunova

Saint Petersburg State Pediatric Medical University, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: vngor@mail.ru

PhD, Professor, Department of Medical Genetics

Russian Federation, Saint Petersburg

Natalia V. Buchinskaia

Saint Petersburg State Pediatric Medical University; Saint Petersburg State Medical Diagnostic Center (Genetic medical center)

Email: nbuchinskaia@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2335-3023
SPIN-code: 4820-4246

MD, PhD pediatrician, Assistant at the Department of Hospital Pediatrics; geneticist, Consulting Department

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Anastasia O. Vechkasova

Saint Petersburg State Medical Diagnostic Center (Genetic medical center)

Email: vechkasova.nastia@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-8775-9630
SPIN-code: 2642-3514

General Practitioner, Geneticist, Consulting Department

Russian Federation, Saint Petersburg

Varvara S. Kruglova

Saint Petersburg State Medical Diagnostic Center (Genetic medical center)

Email: varvara-kruglova@mail.ru
ORCID iD: 0009-0008-2648-3772

Geneticist, Consulting Department

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files