Expression of the hypoxia-inducible factor as a predictor of the resistance of the organism of laboratory animals to hypoxia

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

К настоящему времени известно, что одним из ключевых транскрипционных регуляторов, определяющих устойчивость клеток организма к гипоксии, является гипоксия-индуцибельный фактор 1 альфа (HIF-1α), вовлеченный в индукцию транскрипции генов гликолиза и транспортеров глюкозы, гемопоэза, ангиогенеза, образования оксида азота, антиоксидантной защиты, работы клеток эндотелия, надпочечников, адренорецепторов, ростковых факторов, процессов апоптоза регенерации. Свойства HIF-1α достаточно подробно рассмотрены в ряде обзоров [5, 6, 8, 9, 15, 21, 24]. Традиционно HIF-1α изучается при различных видах гипоксических, ишемически-реперфузионных поражениях, заболеваниях сердечно-сосудистой системы, почек, нейродегенеративных заболеваниях [2, 7, 10, 14, 20, 23, 25, 26]. В последние десятилетия акцент в исследованиях HIF сместился в область онкологии, где он в частности рассматривается как фактор ускользания опухоли от химиотерапевтического или радиотерапевтического воздействия [4, 13, 16, 22].

Известно, что в условиях экстремального гипоксического состояния (кратковременное пребывание крыс среднеустойчивой линии Wistar на высоте 12 км) происходит статистически достоверное повышение экспрессии HIF-1α в почках и сердце и снижение в органах, где экспрессия этого транскрипционного фактора в условиях нормоксии была повышенной, а именно в мозге и печени. Причем в менее экстремальных условиях (высота 8–11 км) его экспрессия в печени повышалась, а в тканях мозга снижение в разной степени отмечалось в широком диапазоне высот — от 6 до 12 км [11].

Устойчивость организма к гипоксии во многом определяет и устойчивость к другим критически значимым воздействиям (гипертермия, гипотермия, гипербария, ионизирующие излучения, химические вещества и др.) [17, 19, 27]. Однако количественной оценки этого влияния в изученной нами литературе обнаружить не удалось, что послужило основанием для выполнения данного исследования.

Цель исследования — оценить количественный вклад уровня экспрессии гипоксия-индуцибельного фактора HIF-1α в различных тканях лабораторных животных в повышение устойчивости животных к воздействию экстремальной гипоксической гипоксии. Достижение поставленной цели позволит обосновать новые патогенетические подходы к диагностике и коррекции уровня устойчивости к неблагоприятным воздействиям экстремального диапазона интенсивности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные и их содержание

В исследовании использовали здоровых нелинейных белых крыс-самцов с массой тела на начало исследования 180–220 г, поступивших из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская обл.) в одном привозе, с ветеринарным свидетельством, и прошедших 14-дневный карантин. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день животных наблюдали в клетках (заболеваемость и смертность). Крысы содержались в стандартных условиях в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики¹ в условиях сертифицированного вивария в клетках по 5–10 голов, при контролируемых условиях окружающей среды (температура 22 ± 3 °C и относительная влажность воздуха 30–70 %, световой режим — день/ночь, 12/12). Питание животных осуществлялось полнорационным комбинированным кормом для грызунов, корм и питьевая вода предоставлялись животным в режиме свободного доступа без ограничений. Уход за животными и их кормление обеспечивали прошедшие специальное обучение сотрудники. Для маркировки животных использовали спиртовой раствор пикриновой кислоты. Сопоставимость экспериментальных групп обеспечивали рандомизацией животных, признанных годными для включения в исследование.

Исследование выполняли в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации², приказом Минздрава России³, согласно утвержденному письменному протоколу, одобренному локальной биоэтической комиссией НКЦТ ФМБА России.

 

¹ ГОСТ 33044–2014 от 01.08.2015 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

² Национальный стандарт РФ. ГОСТ Р-53434–2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

³ Приказ Минздрава России от 01 апреля 2016 г. № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики».

 

Дизайн исследования

Для достижения поставленной цели выполнено моделирование экстремальной гипоксической гипоксии в группах лабораторных животных, достоверно различающихся по уровню устойчивости к заданному воздействию. Для этого прошедшие 14-недельный карантин белые беспородные крысы (40 голов) в фоновом исследовании предварительно тестировались на устойчивость к гипоксии (по критерию резервного времени при воздействии предельно переносимой гипоксической гипоксии).

Для тестирования индивидуального уровня устойчивости к гипоксии животные подвергались барокамерному гипоксическому воздействию путем подъема в барокамере на высоту 11 500 м. Скорость подъема 120–180 м/с (при такой скорости у животных практически не включаются срочные адаптационные реакции). Регистрируемый показатель — время появления второго агонального вдоха (резервное время, Т_р), после чего животное «спускалось» с той же скоростью до уровня нормобарии. Анализировалась частотная кривая распределения животных по резервному времени пребывания на площадке. Полученная кривая асимметрична и смещена влево (что отражает степень экстремальности гипоксического воздействия). Для низкоустойчивых животных показатель резервного времени составлял менее 3 мин, для высокоустойчивых он должен быть более 9 мин. Предварительное тестирование позволило сформировать 4 экспериментальные группы по 5 животных, из них две группы (1 и 3) включали в себя животных с низким уровнем устойчивости к гипоксии, и две (2 и 4) — с высоким уровнем устойчивости. Через 12–15 дней после тестирования исходного уровня устойчивости к гипоксии анализировалась экспрессия исследуемых генов HIF-1α и TSPO в образцах тканей лабораторных животных (плазма, цельная кровь, почки, печень, сердце и головной мозг), осуществлялся забор биологического материала для ПЦР-исследования. У животных групп 1 и 2 образцы тканей забирались в нормоксических условиях (без гипоксического воздействия), в группах 3 и 4 — сразу после прекращения воздействия на животных умеренной гипобарической гипоксии (подъем на высоту 7000 м со скоростью 150–165 м/с, пребывание на высоте 30 мин, спуск до уровня нормоксии со скоростью 150 м/с).

Методика изучения экспрессии гипоксия-индуцибельного фактора HIF-1α в ответ на экстремальное воздействие. Сразу же после прекращения гипоксического воздействия животных выводили из эксперимента методом декапитации, и забирали у них образцы цельной крови, почек, печени, сердца и головного мозга. Пробы замораживались в жидком азоте и хранились до выполнения исследования в низкотемпературном холодильнике при температуре –140 °C. Контролем служили аналогичные животные, помещаемые в работающую барокамеру без герметизации и воздействия неблагоприятного фактора («холостой прогон», позволяющий снизить значимость стрессового фактора на животных). Из исследуемого материала выделяли тотальную РНК методом аффинной сорбции на частицах силикагеля согласно протоколу производителя к комплекту реагентов для экстракции РНК/ДНК из клинического материала «АмплиПрайм РИБО-сорб» (ИнтерЛабСервис, Москва). Синтез первой цепи кДНК проводили согласно указаниям инструкции «Комплекта реагентов для получения кДНК на матрице РНК РЕВЕРТА-L» (ИнтерЛабСервис, Москва).

Амплификацию, с последующим определением уровня экспрессии гена HIF-1α крыс, проводили методом ПЦР с детекцией накопления продуктов реакции в режиме реального времени (Real-TimePCR, USA) с помощью детектирующего амплификатора CFX-96 (Bio-Rad, США) и специфических праймеров и зондов к гену HIF-1α крыс (ДНК-Синтез, Россия). Праймеры для последовательностей HIF-1α и TSPO (гену «домашнего хозяйства») были подобраны с помощью программы VectorNTI. Последовательности мРНК HIF-1α и TSPO были взяты в базе данных NCBIGenBank и синтезированы фирмой ООО «ДНК-Синтез», Москва (табл. 1).

 

Таблица 1. Праймеры и зонды для Real-TimePCR

Table 1. Primers and probes for Real-Time PCR

Исследуемая мишень / Target under study	Олигонуклеотидные праймеры и зонды / Oligonucleotide primers and probes
Ген HIF-1α / HIF-1α gene	HIF_1a_F: 5-ACTCATCATGACATGTTTACTAAAGGAC-3 HIF_1a_R: 5-TGTCAAACGGAAGATGGCAG-3 ZHIF_1a: 5-ROX-TCACCACAGGACAGTACAGGATGCTTGC-BHQ1-3
Ген «домашнего хозяйства» крысы TSPO / TSPO rat “housekeeping” gene	TSPO_F: 5-AGGCTGTGGATCTTTCCAGAAC-3 TSPO_R: 5-GGCTGGGCACCAGAGTGA-3 ZTSPO: 5-FAM-CAATCACTATGTCTCAATCCTGGGTACCCG-BHQ1-3

 

Стадию амплификации кДНК HIF-1α крыс в режиме реального времени проводили в 25 мкл смеси: ПЦР буфер (×10) — 700 ммоль Трис-HCl, pH 8,6; 25 °C, 166 ммоль (NH₄)₂SO₄, 25 ммоль MgCl₂, 0,2 ммоль dNTPs, Taq — полимераза, на детектирующем амплификаторе CFX-96 (Bio-Rad, США). Условия проведения амплификации кДНК HIF-1α с праймерами HIF-1α_F/HIF-1α_Rи зонда ZHIF-1α: 95 °C — 15 мин; затем 50 циклов: 95 °C — 30 с, 65 °C — 50 с, 72 °C — 30 с.

Количество исследуемых кДНК (копийных ДНК, полученных из РНК путем обратной транскрипции) в образцах рассчитывали путем определения пороговых циклов ПЦР. Для оценки уровня экспрессии гена HIF-1α в качестве стандарта сравнения использовался ген TSPO, экспрессия которого считается стабильной для животного. Нормализацию количества изучаемых транскриптов к общему количеству кДНК в пробе проводили с помощью отношения HIF-1α/TSPO.

Критерии включения: беспородные лабораторные крысы — самцы массой на начало исследования 180–210 г, у которых за период наблюдения (карантин 14 дней плюс 12–15 дней после фонового тестирования устойчивости) не выявлены признаки какого-либо заболевания, и рандомизированные по уровню устойчивости к гипоксии в одну из четырех экспериментальных групп по признаку полярности устойчивости организма к экстремальному воздействию.

Критерии невключения: животные, у которых в процессе фонового тестирования устойчивости был выявлен средний уровень, не позволяющий отнести их к категории устойчивых или неустойчивых к гипоксии.

Критерии исключения: животные, у которых во время периода наблюдения были выявлены любые признаки какого-либо заболевания.

Рандомизация животных на группы производилась случайным выборочным методом из сформированных блоков животных с высоким или низким уровнем индивидуальной устойчивости к гипоксии.

Методы статистического анализа данных

Статистическую обработку полученных результатов проводили в программной среде процессора таблиц Excel с помощью пакета прикладных программ «Анализ данных» методом дисперсионного анализа ANOVA. Различия между группами оценивали по F-критерию при уровне значимости p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты определения экспрессии генов HIF-1α и TSPO в полярных по уровню устойчивости к гипоксии группах животных представлены в табл. 2–4.

 

Таблица 2. Экспрессия генов TSPO в разных тканях в нормоксических условиях и после воздействия гипобарической гипоксии у животных с разным уровнем устойчивости к гипоксии, тыс. копий, M ± m

Table 2. Expression of TSPO genes in different tissues under normoxic conditions and after exposure to hypobaric hypoxia in animals with different levels of resistance to hypoxia, thousand copies, M ± m

Ткань / Tissue	Нормоксия (высота 0 м) / Normoxia (height 0 m)			Умеренная гипоксия (высота 7000 м) / Moderatehypoxia (height 7000 m)
	НУ / LR	ВУ /HR	различия / differences	НУ / LR	ВУ / HR	различия / differences
Плазма крови / Bloodplasma	3,2 ± 0,7	7,2 ± 0,6	+125 %, р = 0,002	5,6 ± 1,0	15,0 ± 0,9	+167 %, р = 2 · 10–4
Цельная кровь / Wholeblood	165 ± 5	293 ± 6	+78 %, р = 1 · 10–4	325 ± 13	581 ± 18	+78 %, р = 5 · 10–6
Почки / Kidneys	3440 ± 53	5122 ± 57	+49 %, р = 3 · 10–8	6881 ± 134	10205 ± 88	+48 %, р = 2 · 10–7
Печень / Liver	980 ± 35	1490 ± 21	+52 %, р = 9 · 10–6	1967 ± 42	3383 ± 151	+72 %, р = 4 · 10–4
Сердце / Heart	2300 ± 55	2780 ± 34	+21 %, р = 2 · 10–4	4597 ± 58	5613 ± 50	+22 %, р = 1 · 10–6
Мозг / Brain	247 ± 13	351 ± 6	+42 %, р = 5 · 10–4	495 ± 29	719 ± 26	+45 %, р = 4 · 10–4

Примечание. Группы животных: НУ — низкоустойчивые к гипоксии; ВУ — высокоустойчивые к гипоксии. Note. Groups of animals: NR — low resistant to hypoxia; HR — highly resistant to hypoxia.

 

Таблица 3. Экспрессия гена HIF-1α в разных тканях в нормоксических условиях и после воздействия гипобарической гипоксии у животных с разным уровнем устойчивости к гипоксии, тыс. копий, M ± m

Table 3. Expression of HIF-1α gene in different tissues under normoxic conditions and after exposure to hypobaric hypoxia in animals with different levels of resistance to hypoxia, thousand copies, M ± m

Ткань / Tissue	Нормоксия (высота 0 м) / Normoxia (height 0 m)			Умеренная гипоксия (высота 7000 м) / Moderatehypoxia (height 7000 m)
	НУ / LR	ВУ /HR	различия / differences	НУ / LR	ВУ / HR	различия / differences
Плазма крови / Bloodplasma	0,6 ± 0,1	6,1 ± 0,6	+820 %, р = 5 · 10–4	0,4 ± 0,1	29,6 ± 2,2	+597 %, р = 2 · 10–4
Цельная кровь / Wholeblood	104 ± 2	328 ± 7	+215 %, р = 2 · 10–6	6802 ± 582	18586 ± 1151	+173 %, р = 1 · 10–4
Почки / Kidneys	1924 ± 49	6338 ± 53	+229 %, р = 7 · 10–12	6001 ± 62	9735 ± 774	+62 %, р = 8 · 10–3
Печень / Liver	11385 ± 399	29030 ± 117	+155 %, р = 3 · 10–7	97692 ± 1953	228238 ± 12419	+133 %, р = 4 · 10–4
Сердце / Heart	4940 ± 326	9785 ± 216	+98 %, р = 6 · 10–6	10057 ± 170	23185 ± 215	+130 %, р = 1 · 10–10
Мозг / Brain	50583 ± 2722	121308 ± 4362	+140 %, р = 4 · 10–6	171393 ± 8220	32663 ± 1428	–80 %, р = 5 · 10–5

Примечание. Группы животных: НУ — низкоустойчивые к гипоксии; ВУ — высокоустойчивые к гипоксии. Note. Groups of animals: NR — low resistant to hypoxia; HR — highly resistant to hypoxia.

 

Таблица 4. Уровень экспрессии гена HIF-1α в разных тканях в нормоксических условиях и после воздействия гипобарической гипоксии у животных с разным уровнем устойчивости к гипоксии, нормированный по активности гена TSPO, отн. ед., M ± m

Table 4. The expression level of HIF-1α genes in different tissues under normoxic conditions and after exposure to hypobaric hypoxia in animals with different levels of resistance to hypoxia, normalized by TSPO gene activity, relative units, M ± m

 

Ткань / Tissue	Нормоксия (высота 0 м) / Normoxia (height 0 m)			Умеренная гипоксия (высота 7000 м) / Moderatehypoxia (height 7000 m)
	НУ / LR	ВУ /HR	различия / differences	НУ / LR	ВУ / HR	различия / differences
Плазма крови / Bloodplasma	0,21 ± 0,01	0,84 ± 0,0,01	+306 %, р = 2 · 10–9	0,08 ± 0,01	1,96 ± 0,05	+2360 %, р = 5 · 10–7
Цельная кровь / Wholeblood	0,63 ± 0,01	1,12 ± 0,01	+77 %, р = 2 · 10–9	20,8 ± 1,2	32,0 ± 1,8	+54 %, р = 1 · 10–3
Почки / Kidneys	0,56 ± 0,04	1,24 ± 0,02	+121 %, р = 4 · 10–9	0,87 ± 0,02	0,96 ± 0,08	+9 %, р = 0,39
Печень / Liver	11,62 ± 0,08	19,50 ± 0,30	+68 %, р = 4 · 10–6	49,7 ± 0,2	67,4 ± 0,8	+35 %, р = 1 · 10–5
Сердце / Heart	2,14 ± 0,09	3,52 ± 0,04	+64 %, р = 1 · 10–5	2,19 ± 0,03	4,13 ± 0,06	+89 %, р = 2 · 10–7
Мозг / Brain	205 ± 4	345 ± 7	+68 %, р = 9 · 10–7	347 ± 5	45,4 ± 1,1	–87 %, р = 2 · 10–7

Примечание. Группы животных: НУ — низкоустойчивые к гипоксии; ВУ — высокоустойчивые к гипоксии. Note. Groups of animals: NR — low resistant to hypoxia; HR — highly resistant to hypoxia.

 

Для финальной оценки экспрессии гена HIF-1α было выполнено его нормирование по экспрессии гена «домашнего хозяйства» TSPO (табл. 4).

Анализ данных табл. 2–4 показывает, что уровень устойчивости животных к гипоксии в существенной степени определяется их генетическими особенностями. Даже в условиях нормоксии экспрессия гена TSPO «домашнего хозяйства» животных с высоким уровнем устойчивости к гипоксии с высокой степенью достоверности отличается от низкоустойчивых животных (в почках, печени и мозге — в среднем на 40–50 %, в сердце — на 25 %). Важно, что даже значения экспрессии этого гена, определяемого в цельной крови или плазме, позволяет дифференцировать группы животных по уровню устойчивости к гипоксии. Интересно, что аналогичное соотношение между животными с высокой и низкой устойчивостью к гипоксии наблюдается и в тканях, полученных сразу после гипоксического воздействия. Анализ реакции системы геномной регуляции на гипоксическое воздействие показал, что подъем животных на высоту 7000 м в 2 раза повышает экспрессию гена TSPO в равной степени во всех тканях, независимо от уровня устойчивости животных к гипоксии (единственным исключением стала экспрессия этого гена в печени — в условиях гипоксии она выросла несколько в большей степени — в 2,27 раза).

Для гена HIF-1α обнаружены аналогичные закономерности, но выраженность их проявлений имеет более существенный (в 2–2,5 раза для условий нормоксии и в 1,6–2,3 раза для условий гипоксии) и достоверный характер. Однако реакция генных механизмов на гипоксическое воздействие в группах устойчивых и неустойчивых животных не такая однородная (см. рисунок), как было отмечено для гена TSPO.

 

Рисунок. Коэффициенты реактивности на умеренное гипоксическое воздействие экспрессии гипоксия-индуцибельного фактора HIF-1α в разных тканях в группах высоко- и низкоустойчивых животных (ВУ и НУ соответственно) Figure.

Figure. Coefficients of reactivity to moderate hypoxic exposure to the expression of the hypoxia-inducible factor HIF-1α in different tissues in groups of high- and low-resistant animals (HR and LR, respectively)

 

Обращает на себя внимание тот факт, что для низкоустойчивых к гипоксии животных накопление фрагментов HIF-1α в тесте ПЦР выше, чем для высокоустойчивых (за исключением плазмы крови, для которой у низкоустойчивых животных отмечен не рост, а снижение показателя на 36 %, но оно не является статистически достоверным, р = 0,23). В принципиальном плане отличается реакция на гипоксию для экспрессии HIF-1α в тканях мозга: повышение в 3,5 раза для группы неустойчивых животных и снижение в 3 раза для высокоустойчивых. Такая реакция экспрессии HIF-1α в мозге на гипоксию ранее была описана в работе [11] для группы, не дифференцированной по уровню устойчивости к гипоксии животных.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют, что основным органом, обеспечивающим высокий уровень устойчивости к гипоксии, связанный с базовой (в условиях нормоксии) экспрессией HIF-1α, является головной мозг. Экспрессия в нем гипоксия-индуцибельного фактора более чем в 300 раз превышает экспрессию генов «домашнего хозяйства». Второй по значимости орган — печень, активность экспрессии HIF-1α в которой более чем 15 раз превышает экспрессию генов «домашнего хозяйства». В условиях умеренной гипоксии отмечена компенсаторно-приспособительная реакция, связанная с активацией механизмов гипоксической защиты в клетках крови и печени, а у низкоустойчивых животных — еще и в ткани мозга. В миокарде такая компенсаторно-приспособительная реакция активизируется только в группе высокоустойчивых животных. Несколько неожиданным кажется полученное отсутствие различий в реакции на гипоксию системы регуляции экспрессии HIF-1α в почках для группы высокоустойчивых животных, а также переключение у этих животных геномного ответа на гипоксию с HIF-1α на иные сигнальные механизмы, что проявилось снижением экспрессии генов этого транскрипционного фактора практически в 7 раз.

Выявленные нами особенности свидетельствуют, что принципиальные механизмы повышения устойчивости к гипоксическому воздействию для организмов со сниженным уровнем устойчивости к гипоксии протекают с участием активации экспрессии трансляционного фактора HIF-1α во всех органах и тканях, а также о наличии особых механизмов компенсаторно-приспособительных реакций на гипоксию в группе высокоустойчивых животных. Полученные данные согласуются с выводами, что в механизме действия прямых антигипоксантов типа амтизола, эффективно защищающих ткани организма от острого гипоксического воздействия именно у неустойчивых к гипоксии лиц, существенную роль играет HIF-1α [1]. Высокий уровень базовой экспрессии транскрипционного фактора HIF-1α в повседневных (нормоксических) условиях может быть предиктором высокого уровня устойчивости данного животного к гипоксии.

При анализе литературных источников нам не удалось найти работ, решающих в прямой постановке задачи, аналогичные тем, что ставили перед собой мы. Однако обнаружены публикации, позволяющие высказать предположения о механизмах влияния высокого уровня экспрессии HIF-1α на переносимость экстремальных воздействий. Среди них можно выявить несколько групп механизмов, основным из которых является стабилизация митохондриальных функций и энергопродукции. Показана способность HIF-1α в большей степени активизировать гликолиз у генетически более устойчивых к гипоксии организмов [18]. Такая активация происходила с использованием сигнального пути mTORC1/eIF4E, а для тканей головного мозга сопровождалась повышением экспрессии транспортера фруктозы GLUT5 и кетогексокиназы, что свидетельствует об активном вовлечении утилизации фруктозы в качестве резервного источника энергии. Доказана активация альтернативного гликолизу пути утилизации глюкозы с генерацией восстановленных эквивалентов и фосфорибозы — пентозофосфатного метаболического шунта, устойчивого к влиянию к гипоксии и митохондриальным дисфункциям, так как его реакции осуществляются на мембранах эндоплазматического ретикулума клеток [3]. Второй универсальный механизм влияния повышенной экспрессии HIF на устойчивость животных к экстремальным воздействиям — снижение скорости апоптоза клеток, индуцированного экстремальным воздействием (гипоксии, в частности). Показано, что у устойчивых к экстремальным воздействиям животных индукция апоптоза идет медленнее, а уровень экспрессии HIF при этом становится достоверно выше [12]. Третий универсальный механизм касается не столько механизмов энергопродукции, дефицитной для экстремальных состояний, сколько механизмов нейроадаптации, стабилизации функций нейронов при неблагоприятных воздействиях [8].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокий уровень базовой экспрессии транскрипционного фактора HIF-1α в повседневных (нормоксических) условиях может быть предиктором высокого уровня устойчивости данного животного к гипоксии. Для повышения устойчивости организма к экстремальным воздействиям целесообразно использовать медицинские технологии, повышающие уровень экспрессии гена HIF-1α в повседневных (нормоксических) условиях в ключевых тканях — головном мозге, печени, миокарде.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

About the authors

Aleksey E. Kim

Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: alexpann@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4591-2997

MD, PhD, assistant professor, Department of Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Evgeny B. Shustov

Golikov Scientific and Clinical Center of Toxicology

Email: shustov-msk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5895-688X

MD, PhD, Dr. Sci. (Med.), professor, chief researcher. Golikov Scientific and Clinical Center of Toxicology

Russian Federation, Saint Petersburg

Vadim A. Kashuro

St. Petersburg State Pediatric Medical University; Herzen University

Email: kashuro@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7892-0048

MD, PhD, Dr. Sci. (Med.), assistant professor, head of the Department of Biological Chemistry; professor of the Department of Anatomy and Physiology of Animals and Humans

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Vyacheslav P. Ganapolsky

Kirov Military Medical Academy

Email: ganvp@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7685-5126

MD, PhD, Dr. Sci. (Med.), colonel of the medical service, acting head of the Department of Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Elena B. Katkova

Kirov Military Medical Academy

Email: elenaelenakatkova@mail.ru

MD, PhD, assistant professor, Department of Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files