Sex differences of the content on the monoamines levels in symmetrical structures of the C3H-A mice brain

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В последние годы накапливается все больше фактов, свидетельствующих о том, что выявляемые у грызунов различия в когнитивном поведении самцов и самок находятся не только под контролем гормонов гипоталамо-гипофизарной оси, но и регулируются определенными медиаторными системами мозга, различающимися по функциональной активности у противоположных полов. Так, например, именно дофаминовые проекции префронтальной коры отвечают за память, социальную адаптацию и планирование действий [6]. При этом у самцов функциональная активность дофаминергических нейронов префронтальной коры более выражена, чем у самок [4]. Также обнаружились половые различия в активности ферментов моноаминоксидазы и катехол-о-метилтрансферазы, модулирующих активность моноаминергических систем, что объясняет разное поведение мужчин и женщин при пограничных и аффективных расстройствах и различный ответ на терапию психотропными веществами [18, 19]. Уже доказано, что мужчины и женщины по-разному отвечают на терапию антидепрессантами [16]. Различные ответы мужчин и женщин на воздействие психотропных средств объясняется не только генетическим полиморфизмом ферментов, модулирующих активность нейромедиаторов, но и половыми различиями в организации нейрональных структур ключевых отделов мозга. В экспериментах на животных показано, что синаптическая плотность в области СА1 гиппокампа, которая отвечает за долговременную потенциацию («след памяти»), выше у самцов, чем у самок [15]. Зависимостью синаптической пластичности от пола, возможно, объясняется гораздо более высокая чувствительность женщин к никотину, по сравнению с мужчинами [7]. Различная чувствительность мужских и женских особей к психотропным препаратам подтверждается в экспериментах на животных. Так, у самцов потомков от самок, которые получали флуоксетин (блокатор обратного захвата серотонина) во время беременности, отмечаются не только более выраженные изменения в определенных поведенческих тестах, но и более значимые нейрохимические различия в определенных структурах мозга. Это проявилось в изменении серотонина прежде всего в базолатеральной части миндалины [12]. В исследованиях, посвященных действию аналогичного препарата - кломипрамина, было показано, что он по-разному влияет на структуры левого и правого полушария. Так, крысы, регулярно получавшие препарат с 8-го по 21-й день постнатального развития, во взрослом состоянии демонстрируют сниженный уровень серотонина в лимбических отделах правой стороны мозга [3]. С учетом того, что психотропные средства все шире применяются в медицинской практике и при этом они асимметрично влияют на функционирование нейромедиаторных систем левого и правого полушарий головного мозга мужчин и женщин, актуальными являются работы, направленные на изучение нейрохимической асимметрии головного мозга грызунов, как основного объекта доклинического тестирования лекарственных препаратов. В связи с этим мы предприняли сравнительное исследование по определению концентрации моноаминов и их метаболитов в симметричных структурах мозга самцов и самок мышей линии С3Н-А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Опыты проводили на 16 мышах (10 самцах весом 27-31 г и 6 самках весом 24-28,5 г) линии С3Н-А, выращенных в питомнике Рапполово. После получения из питомника животных не менее 18 дней содержали в стандартных условиях вивария, обеспечивая свободный доступ к пище и воде. Животных декапитировали, мозг извлекали. Из правой и левой половин мозга на льду выделяли определенные морфологические структуры, взвешивали на торсионных весах и помещали в 0,01 М раствор соляной кислоты: стриатум - в 50 мкл, гиппокамп и обонятельный бугорок - в 100 мкл, кору больших полушарий - в 150 мкл. Пробы гомогенизировали с помощью прибора УЗДН-2 Т, центрифугировали в течение 10 мин при 15 000g. Надосадочную жидкость собирали в пробирки и хранили до анализа при -90 оС. Концентрации норадреналина (НА), дофамина (ДА), серотонина (5-НТ) и их метаболитов - диоксифенилуксусной (ДОФУК), гомованилиновой (ГВК) и 5-гидроксииндолуксусной (5-ГИУК) кислот определяли методом обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией на хроматографе Beckman Coulter (США) [14]. Хроматографическая система включала инжектор Rheodyne 7125 с петлей на 20 мкл для нанесения образцов, колонку Phenomenex (250,0 × 4,6 мм) с сорбентом Sphere Clone 5 u ODS (2) и амперометрический детектор LC-4 С BAS. Определение концентраций исследуемых веществ проводили при потенциале +0,70 В. Подвижная фаза включала 5,5 mМ цитратно-фосфатный буфер с 0,7 mМ октансульфоновой кислотой, 0,5 mМ ЭДТА и 8 % ацетонитрила (рН 3,0). Скорость элюции подвижной фазы составляла 1 мл/мин, время анализа одной пробы - около 20 минут. Полученные результаты обрабатывали методом дисперсионного анализа (ANOVA) с применением стандартного статистического пакета GraphPad PRISM 5.0. Для получения дополнительной информации в ряде случаев достоверность различий между группами дополнительно оценивали по t-критерию Стьюдента (в этом случае в рисунках при указании достоверности различий рядом с условным обозначением группы в скобках поставлена буква «t»). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ По содержанию НА в коре и гиппокампе группы самцов и самок не различались (рис. 1, 2). Половые различия по уровню этого медиатора выявлены в стриатуме и обонятельном бугорке, причем в стриатуме содержание НА было выше у самцов (рис. 4), а в обонятельном бугорке - у самок (рис. 3). Несмотря на то что в обонятельном бугорке у самцов уровень НА был ниже, чем у самок, именно в группе самцов наблюдалась асимметрия по этому показателю с преобладанием НА в правом обонятельном бугорке (P < 0,05). В коре больших полушарий и гиппокампе по содержанию НА не было выявлено ни половых различий, ни асимметрии. Содержание ДА в коре и гиппокампе у самцов было выше, чем у самок (рис. 2), а в обонятельном бугорке и стриатуме - ниже (рис. 3, 4). Необходимо отметить, что в гиппокампе у самцов была выявлена асимметрия по содержанию ДА с достоверным преобладанием этого медиатора справа (P < 0,05) (рис. 2). У самок в левом гиппокампе содержание ДА было столь низким, что нашими методами его определить не удалось, в то время как в правом гиппокампе самок ДА отчетливо определялся, хотя его уровень был достоверно ниже, чем у самцов (P < 0,05) (рис. 2). По содержанию ДОФУК в гиппокампе достоверных различий между группами выявлено не было (рис. 2). Формально то же самое можно сказать об уровне другого метаболита ДА - ГВК. Однако в гиппокампе всех самок, в отличие от самцов, содержание этого вещества было неизмеримо мало (рис. 2). В коре больших полушарий мозга самок, наряду со сниженным уровнем ДА, наблюдалось пониженное содержание его метаболитов - ДОФУК (P < 0,01 слева и P < 0,05 справа) и ГВК (P < 0,001) (рис. 1). В обонятельном бугорке и стриатуме наблюдалась противоположная картина. В этих структурах мозга содержание ДА у самок было достоверно выше, чем у самцов (P < 0,01) (рис. 3, 4). Эти различия сопровождались повышенным уровнем метаболитов ДА в обонятельном бугорке самок (рис. 3). Причем достоверные половые различия по содержанию ДОФУК выявлены в обеих половинах мозга (P < 0,001), а по ГВК - только слева (P < 0,05). И у самок, и у самцов в стриатуме и обонятельном бугорке содержание ДА и его метаболитов было симметричным (рис. 4). При исследовании серотонинергической системы выявлены половые различия в гиппокампе и обонятельном бугорке (рис. 2, 3). В этих структурах мозга уровень 5-НТ и его метаболита (5-ГИУК) у самок был выше, чем у самцов (P < 0,001). Повышеное содержание 5-ГИУК у самок по сравнению с самцами также отмечалось в левом стриатуме (P<0,05), хотя по содержанию самого 5-НТ в стриатуме половые различия выявлены не были (рис. 4). Необходимо отметить, что по содержанию 5-НТ в обонятельном бугорке у самок была выявлена асимметрия: уровень этого медиатора справа был выше, чем слева (P < 0,05) (рис. 3). Если у самок была обнаружена асимметрия по содержанию самого 5-НТ, то у самцов она выявлялась в отношении его метаболита - 5-ГИУК. Так, у самцов были отмечены достоверное преобладание этого вещества в правом гиппокампе (P < 0,001) (рис. 2) и выраженные тенденции к преобладанию 5-ГИУК в правом обонятельном бугорке (Р = 0,054) (рис. 3) и правом стриатуме (Р = 0,068) (рис. 4) по сравнению с аналогичными левыми структурами. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Анализ половых различий по содержанию катехоламинов позволяют условно разделить исследованные структуры мозга на две группы. Первую группу составляют кора и гиппокамп (старая кора), в которых уровень НА у самцов и самок не различался, а уровень ДА был выше у самцов. Вторая группа - стриатум и обонятельный бугорок. В этих структурах проявляются половые различия по содержанию НА (в стриатуме - выше у самцов, а в обонятельном бугорке - у самок) и по ДА (в обеих структурах - выше у самок). Несмотря на то что в обонятельном бугорке у самцов уровень НА был ниже, чем у самок, именно в группе самцов наблюдалась асимметрия по этому показателю с преобладанием НА в правом обонятельном бугорке (P < 0,05). В коре больших полушарий и гиппокампе по содержанию НА не было выявлено ни половых различий, ни асимметрии. Этот факт, на первый взгляд, не согласуется с данными, полученными на самцах крыс, о преобладании НА в правой коре [2]. Однако несоответствие наших данных с приводимой работой, возможно, только кажущееся. Поскольку Р. И. Кругликов с соавт. (1991) определяли моноамины «в коре» и «в остальном мозге», вполне вероятно, что в пробы коры был включен обонятельный бугорок, расположенный поверхностно на вентральной стороне головного мозга. Так как содержание моноаминов в обонятельном бугорке в 1,5-2 раза превышает таковое в коре, можно утверждать, что асимметрия по содержанию НА, обнаруженная Р. И. Кругликовым с соавт. (1991), фактически отражает преобладание этого медиатора в правом обонятельном бугорке у самцов грызунов. Содержание ДА в коре и гиппокампе у самцов было выше, чем у самок, а в обонятельном бугорке и стриатуме - ниже. По содержанию ДОФУК в гиппокампе достоверных различий между группами выявлено не было. Это вполне согласуется с результатами исследования R. E. Bowman с соавт. (2009), показавшими, что в гиппокампе самок активность ДА-ергической системы, оцениваемая по соотношению ДА/ДОФУК, выше, чем у самцов [5]. Вместе с тем аналогичный результат в отношении префронтальной коры, описанный в работе R. E. Bowman с соавт., в нашем исследовании не подтвердился. Поскольку, по нашим данным, в коре самцов по сравнению с самками преобладал как уровень ДОФУК, так и ДА, индекс ДОФУК/ДА у самок достоверно не превышал таковой у самцов. Повышенный уровень ДОФУК в коре самцов по сравнению с самками вполне можно было бы объяснить способностью эстрогенов снижать активность моноаминоксидазы [8, 13], однако неясно, почему это свойство проявилось только в коре и только - в отношении ДА-ергической, но не серотонинергической системы мозга. Имеются литературные данные о том, что способность половых гормонов влиять на обмен моноаминов специфично для определенных структур мозга. Так, было показано, что у самцов крыс гонадэктомия способна повышать активность моноаминоксидазы в префронтальной коре, но не в стриатуме [17]. Однако моноаминоксидазная активность у гонадэктомированных самцов крыс возвращается к норме как при заместительной терапии андрогенами, так и при хроническом введении эстрогенов [17]. Содержание другого метаболита ДА - ГВК - в коре и гиппокампе самок было значительно ниже, чем у самцов. Этот результат может объясняться тем, что андрогены имеют свойство повышать в префронтальной коре экспрессию гена, кодирующего фермент катехол-О-метилтрансферазу, обусловливающего образование ГВК [17]. Важным результатом нашего исследования явилась асимметрия по содержанию ДА с достоверным преобладанием этого медиатора в правом гиппокампе. Необходимо отметить, что в аналогичном исследовании, проведенным нами ранее на самцах мышей линии BALB/c, асимметрии по этому показателю у животных, содержащихся в группе, обнаружено не было [1]. Возникает вопрос, типично для грызунов вообще правостороннее преобладание ДА в правом гиппокампе, обнаруженное нами у самцов линии С3Н-А, или оно является специфическим именно для мышей данной линии. При сравнении уровня ДА в стриатуме мышей линии С3Н-А было показано, что уровень этого медиатора у самок выше, чем у самцов. Этот результат согласуется с результатами исследований D. E. Dluzen с соавт. (2008), показавшими, что в ткани стриатума резерпин и хлорид калия способны вызвать значительно более сильное высвобождение ДА у самок, чем у самцов [10, 11]. По данным этих исследователей, половые различия стимулированного высвобождения ДА связаны с повышенной активностью ДА-транспортера и везикулярного транспортера моноаминов. Увеличенный выброс ДА демонстрировали не только нормальные, но и гонадэктомированные самки [10]. Таким образом, можно предположить, что повышенная реактивность ДА- ергической системы стриатума самок не связана с уровнем эстрогенов, по крайней мере во взрослом состоянии. При исследовании серотонинергической системы выявлены половые различия в гиппокампе и обонятельном бугорке. В этих структурах мозга уровень серотонина (5-НТ) у самок был выше, чем у самцов. В литературе имеются данные о том, что эстрогены оказывают двойное действие на серотонинергическую передачу: усиливают активность транспортера обратного захвата моноаминов и ингибируют фермент моноаминоксидазу, что может приводить к снижению скорости деградации серотонина [13]. Эти факты объясняют обнаруженное нами преобладание уровня серотонина у самок по сравнению с самцами. Более низким уровнем серотонина у самцов по сравнению с самками, возможно, объясняется повышенная реактивность мужских особей на серотонинергические препараты. Так, применение кломипрамина (ингибитора обратного захвата серотонина) у самцов вызывает более выраженные поведенческие сдвиги, чем у самок [3]. В литературе имеются указания на способность эстрогенов ингибировать активность моноаминоксидазы - одного из ферментов образования 5-ГИУК [13]. Поэтому можно было бы ожидать, что у самок по сравнению с самцами скорость метаболизма серотонина будет снижена. Однако результаты нашего исследования показывают, что у самок содержание 5-ГИУК в гиппокампе и обонятельном бугорке было выше, чем у самцов. Повышеное содержание этого метаболита у самок по сравнению с самцами также отмечалось в левом стриатуме, хотя по уровню самого 5-НТ в стриатуме половые различия выявлены не были. Так как эстрогены являются важнейшим регулятором активности серотонинергической системы [13], можно предположить, что асимметрия серотонинергических систем может быть связана с асимметричным распределением в головном мозге рецепторов к эстрогенам. В единственном известном нам исследовании на эту тему показано, что у взрослых самок крыс эстрогеновые рецепторы преобладают в правой коре, а у самцов - в левой [9]. Парадоксально, что из всех четырех исследованных нами структур головного мозга именно в новой коре не было обнаружено ни асимметрии, ни половых различий по содержанию 5-НТ и 5-ГИУК. Однако в обонятельном бугорке (древняя кора) по уровню 5-НТ у самок была выявлена асимметрия: этого медиатора справа было больше, чем слева. Если у самок была обнаружена асимметрия по содержанию самого 5-НТ, то у самцов она выявлялась в отношении его метаболита. У животных этой группы были отмечены достоверное преобладание 5-ГИУК в правом гиппокампе и выраженные тенденции к преобладанию этого вещества в правом обонятельном бугорке и правом стриатуме по сравнению с аналогичными левыми структурами. Таким образом, все обнаруженные нами случаи асимметрии серотонинергической системы заключались в правостороннем преобладании концентраций исследуемых веществ, причем асимметрия у самок касалась содержания самого медиатора, а у самцов - его метаболита. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные исследования позволяют сделать следующие обобщения. Во-первых, у мышей линии С3Н-А выявлены половые различия по содержанию моноаминов и их метаболитов в структурах головного мозга: 1) содержание НА у самцов выше в стриатуме, а у самок - в обонятельном бугорке; 2) содержание ДА у самцов в коре и гиппокампе выше, а в обонятельном бугорке и стриатуме - ниже, чем у самок; 3) уровень 5-НТ и 5-ГИУК в гиппокампе и обонятельном бугорке у самок выше, чем у самцов. У самок по сравнению с самцами повышено содержание 5-ГИУК в левом стриатуме. Во-вторых: у самцов установлены три случая нейрохимической межполушарной асимметрии головного мозга: 1) НА больше в правом обонятельном бугорке; 2) содержание ДА выше в правом гиппокампе; 3) уровень 5-ГИУК выше в правом гиппокампе. В-третьих, у самок зарегистрирован только один случай межполушарных различий: уровень 5-НТ достоверно выше в правом обонятельном бугорке.

About the authors

Inessa Vladimirovna Karpova

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: inessa.karpova@gmail.com
PhD, Associate Professor, Leading researcher, The Laboratory of Motor Behavior Physiology and Pathology

Sergey Nikolayevich Proshin

Saint-Petersburg State Pediatric Medical University

Email: psnjsn@rambler.ru
MD, PhD, Chief of the Department of pharmacology

Ruslan Ivanovich Glushakov

Kirov Military Medical Academy

Email: glushakovruslan@gmail.com
MD, PhD

Vladimir Vladimirovich Mikheyev

Kirov Military Medical Academy

Email: vmikheev58@gmail.com
PhD, Assistant Professor, Department of Pharmacology

Evgeny Rudolfovich Bychkov

Institute for Experimental Medicine of RAMS

Email: bychkov@mail.ru
MD, PhD, Associate Professor, Senior researcher, The Department of Neuropharmacology by S. V. Anichkov

References

Supplementary files