Correction of mitochondrial dysfunction of rabbit cardiomyocytes using substrate antihypoxants

Full Text

Актуальность исследования Особенности энергетического обмена у детей с сердечно-сосудистой патологией имеют важное практическое значение. При ревматизме, миокардитах, врожденных пороках сердца прогностически важно определить состояние энергетического обмена и нормализовать его, так как биоэнергетический дефицит кардиомиоцита приводит к значительному снижению сократительной способности миокарда и создает условия для прогрессирования сердечной недостаточности [1]. Предпринятые в последние годы экспериментальные и клинические исследования патогенеза идиопатических кардиомиопатий у детей [10] прямо указывают на нарушения окислительного фосфорилирования в ткани миокарда, обусловленные снижением активности митохондриальной электронно-транспортной системы. Многочисленные врожденные синдромы, такие как синдром Ivemark, Holt-Oram, Ellis-Van Creveld, Ivemark, Noonan, Greeg, Kugel-Stoloff, Werner, West, Adams-Stokes, MERRF [15] в своем симптомокомплексе содержат кардиомиопатию. В настоящее время установлено, что кардиомиопатии могут являться одним из проявлений митохондриальных заболеваний непосредственно связанных с мутацией митохондриальной или ядерной ДНК, ответственных за синтез структурных белков и фермент-субстратных комплексов дыхательной цепи [10]. В литературе также имеются описания кардиомиопатий, обусловленных митохондриальной дисфункцией вследствие недостаточности цитохром-С-оксидазы, дефицита карнитина [10], снижения активности I, II, III или IV комплексов дыхательной цепи [2, 5, 7, 8, 11]. Если для моделирования митохондриальных болезней необходимы так называемые «трансмитохондриальные лабораторные животные», характеризующиеся наличием митохондриальных гетероплазией, то дисфункцию митохондрий возможно воспроизвести в моделях гипоксии [5, 7, 18]. Суть митохондриальной дисфункции сводится к нарушениям электронтранспортной и энергопродуцирующей роли дыхательной цепи. Активность фермент-субстратных комплексов митохондрий угнетается, начиная от НАД-зависимого участка, затем последовательно вовлекая ФАД- зависимый участок дыхательной цепи, вплоть до цитохромоксидазного. Это явление развивается при многих патологических состояниях, носит неспецифический характер по отношению к виду неблагоприятного фактора и получило название биоэнергетическая гипоксия [5, 11]. Для моделирования дисфункции митохондрий миокарда и оценки эффективности фармакологической коррекции нами была использована неинвазивная экспериментальная модель вибрационно-обусловленного гипоксического типа клеточного метаболизма [3, 4]. Данная модель не сопряжена с хирургической, наркозной агрессией, позволяет поступательно проследить не только развитие патофизиологических феноменов на уровне системы энергопродукции органов и тканей, но и оценить возможности фармакологической коррекции митохондриальной дисфункции по типу биоэнергетической гипоксии [5, 11]. Цель работы С помощью вибрационной модели гипоксического типа клеточного метаболизма, оцененной на кардиомиоцитах кролика, доказать кардиопротективные свойства субстратного антигипоксанта янтарной кислоты в составе препарата янтарь-антитокс, реализуемые на уровне системы энергопродукции ткани. Материалы и методы Эксперименты проведены на 95 кроликах-самцах породы Шиншилла массой 2,5-3 кг. Действие общей вертикальной вибрации с амплитудой 0,5 мм осуществляли с помощью промышленной установки. Ежедневно в течение 56 дней проводили сеансы вибрации с частотой 44 Гц по 60 мин с 9.00 до 11.00 в осенне-зимний период. В качестве средства фармакологической защиты использовали субстратный антигипоксант препарат янтарь-антитокс, разработанный НИИФ ТНЦ СО РАМН (НФК, г. Томск) в разовой дозе 8,4 мг/кг [17]. Препарат вводили по 2 мл суспензии внутрипищеводно с помощью тонкого эластичного зонда за 60 мин до вибрации. Интактные и контрольные животные, которые подвергались воздействию вибрации без фармакологической защиты, получали физиологический раствор. Активность нативных митохондрий (Мх) сердца изучали полярографическим методом [9], при 37 °С в 1 мл солевой среды инкубации, уравновешенной с кислородом воздуха. Скорость дыхания Мх (V) в зависимости от добавок в среду инкубации выражали в нг-атом О мин-1 мг-1 белка. Метаболические состояния Мх «покоя» и «активности» моделировали in vitro при варьировании экзогенных энергетических субстратов (до и после введения в ячейку 2,4-ДНФ). Вклад в эндогенную дыхательную активность митохондрий НАД- и ФАД-зависимых субстратов (НАД-ЗС, ФАД-ЗС) оценивали по данным ингибиторного анализа с амиталом или малонатом по 2 мМ. В качестве экзогенных субстратов использовали ФАД-ЗС - янтарную кислоту (ЯК), 1 мМ или смесь НАД-ЗС - яблочной и глутаминовой кислот (Мал + Глу) по 3 мМ. Введением в ячейку разобщителя 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ) до 20 мкМ имитировали состояние АТФ-азной «активности» Мх [9, 13]. Отклик Мх на неблагоприятный фактор in vivo и фармакологическую защиту оценивали по совокупности кинетических (V) и расчетных параметров. В метаболических состояниях Мх рассчитывали коэффициенты приращения сукцинатзависимого дыхания (КП) в состоянии покоя (п) и разобщения (р): КПэ = [ФАД/НАД]э = мал. ч. / ам. ч.; КПп = [ФАД/НАД]п = Vяк / Vглу+мал; КПр = [ФАД/НАД]-р = Vяк-р / Vглу + мал-р, где мал. ч и ам. ч - доли малонат- и амиталчувствительного эндогенного дыхания, Vяк и Vглу + мал - скорости окисления экзогенного сукцината и смеси глутамата и малата в состоянии «покоя», Vяк-р и Vглу + мал-р - скорости окисления субстратов в «активном» состоянии Мх в условиях АТФ-азной нагрузки. «Регуляторные» параметры количественно характеризовали переход Мх в разные состояния (от эндогенного в состояние «покоя»; от покоя в «активное» состояние). Рассчитывали коэффициенты стимуляции - КСяк, и КСглу + мал, или разобщения КРглу + мал, КРяк. Их вычисляли как КСс = Vс / Vэ; КРс = Vс-р / Vс, где: КСс - стимуляция эндогенного дыхания экзогенным субстратом (с), Vс - скорость дыхания Мх после добавления экзогенного субстрата (ЯК или Глу + Мал), Vэ - скорость эндогенного дыхания; КРс - стимуляция субстратного дыхания 2,4-ДНФ, Vс-р - скорость окисления экзогенного субстрата после добавления 2,4-ДНФ. КСс и КРс выражали в относительных единицах. Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета прикладных программ «Exel-2002» (МS Оffice 2002), «STATISTICA» 6,0. Значимость межгрупповых различий оценивали параметрическим (t-критерия Стьюдента) и непараметрическим (Манна-Уилки-U-теста) критериями в зависимости от типа распределения, который определяли в модуле «Basic Statistica/Tables. Frequency tables» ППП STATISTICA 6.0. Результаты исследования и обсуждения Длительная вибрация с частотой 44 Гц оказывала повреждающее действие на разных уровнях биологической интеграции ткани. На уровне Мх сначала (после 7-21 сеанса вибрации) происходила активация ФАД-зависимого звена дыхательной цепи на фоне ослабления функции НАД-зависимого звена. При дальнейшей пролонгации вибрационного воздействия (до 56 сеансов) развивались напряжение и деэнергизация ФАД-зависимой фракции, свидетельствуя о формировании низкоэнергетического сдвига в системах энергообеспечения Мх миокарда [9] или биоэнергетической гипоксии [11]. Неблагоприятные эффекты на сердце от воздействия вибрации [19-24] в качестве стрессирующего фактора [21] сопровождались морфологическими изменениями изучаемой ткани: дистрофией кардиомиоцитов, уменьшением капиллярной сети, спазмом артериол, увеличением межклеточного и межпучкового отека, постепенным расширением очагов кровоизлияний и некроза. Воздействие вибрации на фоне применения субстратного антигипоксанта (рис. 1) изменила структуру эндогенного дыхания (Vэ): амиталчувствительность возрастала более чем на 50 % (р ≤ 0,01), а малонатчувствительность снижалась на 30 % (р ≤ 0,05). Скорость Vяк колебалась около уровня интактных животных. Коэффициент КПп уменьшался на 32 % по отношению к показателю вибрированных животных, свидетельствуя о некотором смещении баланса активности фракций Мх в пользу НАД-ЗС, что характерно для интактного состояния. Показатели Vглу + мал-р, Vяк-р снижались незначительно, однако по отношению к интактным животным уменьшение составило 44 % (р ≤ 0,01) и 24 %, соответственно, указывая на переход активности Мх на иной уровень функционирования. Регресс стимулирующего действия экзогенных субстратов на Мх в состоянии «покоя» был более значительным в системе окисления янтарной кислоты (ЯК) и составил для КСяк 40 % (р ≤ 0,01), приблизив показатель к интактному уровню. Действие 2,4-ДНФ проявилось уменьшением КРяк < 1,0, что свидетельствовало о торможении активности сукцинатзависимой энергетики. Таким образом, по совокупности показателей, можно сделать вывод, что препарат янтарь-антитокс восстанавливал и повышал активность НАД-зависимого звена Мх, одновременно ограничивая чрезмерную активность сукцинатдегидрогеназной системы окисления, усугубляющую деструктивные процессы на уровне митохондрий. Морфологические изменения в миокарде на фоне фармакологической защиты от вибрации характеризовались слабой гипертрофией, незначительным отеком, уменьшением диапедезных кровоизлияний, восстановлением структуры артериол, активизацией стромальной реакции и ангиогенеза. Миокард является высоко уязвимым органом, реагирующим на любое неблагоприятное воздействие. Это связано с его высокой функциональной активностью и большими энергетическими потребностями, восполняемыми преимущественно за счет аэробного метаболизма свободных жирных кислот, глюкозы, молочной кислоты и аминокислот. Бета-окисление жирных кислот протекает в матриксе митохондрий только в аэробных условиях и заканчивается образованием ФАДН2, НАД ∙ Н и ацетил-КоА, который поступает в цикл трикарбоновых кислот и служит основным источником энергии синтеза АТФ по механизму окислительного фосфорилирования. Жирные кислоты, благодаря высокой активности β-оксибутиратоксидазы в условиях нормального функционирования, на 60 % покрывают запросы миокарда в субстратах окисления [6, 16]. Остальные эндогенные субстраты (янтарная, яблочная, изолимонная, фумаровая, кетоглутаровая кислоты), аминокислоты, кетоновые тела и пируват окисляются в митохондриях миокарда в гораздо меньших количествах, но их энергетическая роль повышается в условиях стресса различного генеза [6]. Работа сердца в импульсном режиме требует варьирования энергопродукции в широком диапазоне, однако для митохондрий сердца характерна не только более высокая степень активности, по сравнению с другими тканями, требующая высоких скоростей образования макроэргов [6], но и более высокая степень уязвимости [14], обусловленная низкой субстратной обеспеченностью. Янтарная кислота, реактивируя быстрый метаболический кластер (БМК) [17] и восстанавливая β-окисление жирных кислот в кардиомиоцитах, обладает способностью регулировать процессы энергообеспечения в миокарде [5, 8, 18], улучшает показатели динамики коллатерального кровотока и внутрижелудочкового давления, повышает сократительную активность миокарда, нормализует гемодинамику в целом и повышает выживаемость животных в эксперименте [7]. В совокупности вышеназванные эффекты обеспечивают кардиопротективное, антиаритмическое и мембраностабилизирующее действие янтарной кислоты [8, 18]. Немаловажное значение имеет способность данного субстарата увеличивать проницаемости клеточных мембран для интермедиатов цикла Кребса и повышать резистентность окислительных систем митохондрий к гипоксии в условиях «загрузки» их субстратами цикла Кребса [9]. При экспериментальной острой гипоксии показаны антигипоксическая и антиоксидантная активность янтарной кислоты [7, 8, 18], что позволяет отнести препараты на основе данного митохондриального субстрата к так называемым субстратным антигипоксантам [5]. Возможно предположить, что выявленный нами биоэнергетический механизм реализации кардиопротективного эффекта препарата янтарь-антитокс связан с восстановлением НАД-зависимого звена ДЦ Мх и регуляторным сдерживанием гиперактивации системы сукцинатдегидрогеназы (СДГ) или быстрого метаболического кластера (БМК), что приводит к снижению потребности кардиомиоцитов в кислороде и повышению эффективности окисления. Ограничение активности СДГ имеет защитное значение, так как предупреждает «разрыхление» дыхательной цепи [9] и реализуется по типу естественного механизма предупреждения чрезмерной активности процесса окислительного фосфорилирования. Подобная точка зрения основывается на том, что торможение СДГ-зависимого окисления в митохондриях сочетается в наших исследованиях с благоприятными морфогистологическими признаками. Таким образом, в условиях взаимодействия стрессирующего и защитного фармакологического факторов формируется новое устойчивое состояние Мх миокарда, позволяющее сохранять резистентность его структуры и функции, и тем самым, возможно, повышать эффективность терапии.

About the authors

Viktoriya Vladimirovna Vorob’eva

North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov

Email: vvvorobeva@mail.ru
Ph.D., M.D., Dr Med Sci., Head of Department of Pharmacology

Petr Dmitrievich Shabanov

Russian Medicomilitary Academy

Email: pdshabanov@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci. Professor, Head. Department of pharmacology

Sergei Nikolaevich Proshin

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: psnjsn@rambler.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Head of the Department of Pharmacology

References

Supplementary files