Degenerative changes of the Medial arcuate hypothalamic nucleus neurons in the male hypogonadism model

Full Text

Актуальность Изучение закономерностей гормональной регуляции полового развития подростков, включая механизмы физиологического и патологического изменения скорости созревания гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы, остается предметом активного исследовательского интереса [5, 6]. Благодаря серии исследований, выполненных в последние годы, стали более понятны генетические и эпигеномные механизмы центрального (гипогонадотропного) гипогонадизма - задержки полового созревания особей обоего пола, вызванных недостаточностью выработки гонадолиберинов. Речь идет о последовательном включении генов «верхнего и нижнего эшелона» («upstream» и «downstream» гены) в цепи нейронов мелкоклеточных гипоталамических ядер [15]. Продуктами транскрипционной активности этих генов являются нейромедиаторы, влияющие на выработку гонадолиберина. К их числу относятся глутамат, нейрокинин B, динорфин, гамма-аминобутират и семейство кисспептинов [12, 14, 17]. Известно также, что уровень половых стероидов изменяет выработку гонадолиберина нейронами мелкоклеточных гипоталамических ядер по принципу отрицательной обратной связи как за счет связывания рецепторов стероидов самими нейросекреторными клетками, так и через рецепторы к медиаторам (кисспептинам) ассоциативных клеток этих же ядер [9]. Поэтому экспериментальное снижение концентрации тестостерона, вызывающее задержку полового развития (гипогонадизм), оказывает также многофакторное биохимико-физиологическое влияние и на нейроны мелкоклеточных гипоталамических ядер. Изменения строения нейронов, количества их патологических форм, пространственных глио-нейрональных и межнейрональных взаимоотношений в гипоталамических ядрах при моделировании периферического гипогонадизма до настоящего времени остаются слабо изученными. Между тем эти изменения, установленные в комплексе после моделирования воздействия ишемии и интоксикаций на разные мозговые центры, зарекомендовали себя как чувствительные и пластические [1, 2, 3]. Знание степени развития этих изменений клеток в аркуатных гипоталамических ядрах - одном из главных источников выработки гонадолиберина - при гипогонадизме, и возможности коррекции этих изменений способствовали бы более глубокому пониманию механизмов эндокринного взаимодействия гонад и гонадолибериновых центров в процессе полового созревания. Целью настоящего исследования является установление количественных, структурных изменений нейронов, пространственных глио-нейрональных и межнейрональных взаимоотношений в медиальном аркуатном ядре при экспериментальном гипогонадизме и степени коррекции этих изменений после терапии тестостероном. Материалы и методы Для моделирования мужского гипогонадизма у 14 новорожденных самцов-крыс линии Вистар в возрасте 2-3 дней (масса 6-7 г) под кратковременным эфирным наркозом удаляли одну гонаду. У животных первой экспериментальной группы (7 крыс), таким образом, было индуцировано устойчивое снижение выработки тестостерона (гипогонадизм). Животным другой группы (7 крыс) после аналогичной операции в возрасте 4 месяцев (половозрелые особи) ежедневно, курсом 10 дней, внутримышечно вводили раствор тестостерона пропионата из расчета 3-5 мг/кг (гипогонадные самцы с лечением). Контролем служили интактные животные (7 крыс). В возрасте 4 месяцев и 10 дней всех крыс умерщвляли путем декапитации с использованием гильотины после содержания в парах медицинского эфира в течение 10 минут. Эксперимент был осуществлен в весенне-летний период, когда резко возрастает экспрессия рецепторов к тестостерону у различных тканевых клеток [11]. В ходе подготовки и проведения эксперимента были соблюдены принципы гуманного отношения к лабораторным животным в соответствии с «Руководящими методическими материалами по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств» (1984), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985) и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 2003 г. № 267). Объектом исследования было медиальное аркуатное ядро - наиболее крупный подотдел аркуатного ядерного комплекса, который устанавливали при микроскопии пробных неокрашенных парафиновых фронтальных срезов согласно стереотаксическому атласу [16]. После окрашивания срезов по Нисслю в площади 0,01 мм2 правого и левого медиального аркуатного ядра у каждой особи (m, общее количество подсчетов =14) определяли фенотип нейронов согласно классификации Ю. М. Жаботинского [4]. Раздельно подсчитывали количество неизмененных, гипохромных, сморщенных гиперхромных и теневидных клеток, устанавливали площадь малоизмененных нейронов. Определяли также количество групп нейронов (группой считали скопление клеток, расстояние между телами которых не превышало 2 мкм) и глиоцито-нейрональный индекс (отношение числа сателлитной формы олигодендроцитов и астроцитов к числу жизнеспособных нейронов - неизмененных, гипохромных и пикноморфных). Морфометрию проводили с помощью программы Imagescope (Russia). Различия средней величины и ее ошибки считали значимыми при р < 0,05. Полученные результаты Лево- и правостороннее медиальные аркуатные гипоталамические ядра у взрослых интактных крыс обладали наиболее крупными размерами, в сравнении с остальными ядрами аркуатного комплекса; тела их нейронов, визуально, также были крупнее, чем клетки соседних ядер, располагались компактно и относительно равномерно (рис. 1). Большинство тел нейронов медиального аркуатного ядра характеризовалось звездчатой формой; они обладали отчетливыми, ровными, слегка выпуклыми контурами клеточной поверхности. Значительная часть поверхности ядер этих клеток была ровной, выпуклой, на некоторых небольших участках содержала неглубокие инвагинации ядерной оболочки. Хроматофильная субстанция имела вид плотно упакованных глыбок, занимала большую часть цитоплазмы, располагаясь преимущественно вблизи ядра. Основание отростков и небольшие участки цитоплазмы вблизи клеточной мембраны были просветлены (рис. 2 а). Данные нейроны были идентифицированы как неизмененные (нормохромные). Единичные нейроны имели вид просветленных, лишенных хроматофильной субстанции, некоторые из них выглядели сморщенными, имели участки стертости клеточной поверхности. Другая часть нейронов с просветленными цитоплазмой и ядром значительных изменений не имели. Ядерный хроматин этих клеток, как и неизмененных, был конденсирован, преимущественно на периферии ядерной оболочки; крупное ядрышко, более светлое, чем у неизмененных нейронов, было обычно смещено к ядерной оболочке. Данные нейроны обозначались как гипохромные клетки. Среди нейронов определялись также единичные сморщенные клетки с гиперхромными ядром и цтоплазмой. Осевой отросток или тело такого нейрона могли выглядеть штопорообразно скрученными и не содержать различимого ядра. Теневидные нейроны обладали стертыми контурами поверхности тела и ядерной оболочки, были, сморщены. Они часто имели вид сморщенных слабо окрашенных фрагментов ядерной оболочки (апоптотических телец). Распределение абсолютного и удельного количества фенотипических форм нейронов, параметры площади тел малоизмененных нейронов и количества групп нейронов уточнены в таблицах 1 и 2. Глиоцито-нейрональный индекс составил 0,23 ± 0,05 отн. ед. В результате моделирования устойчивого снижения выработки тестостерона в неонатальном периоде среди нейронов медиальных аркуатных ядер взрослых крыс были выявлены значительные патологические нарушения (рис. 2 б). Нейроны, измененные в наименьшей степени (малоизмененные), содержали цитоплазму визуально меньшего размера (более узкую), чем у интактных крыс. В ней, однако, глыбки хроматофильной субстанции были различимы, располагались компактно и равномерно, исключая основание главных отростков. Светлое ядро неизмененной формы содержало крупное ядрышко, у многих клеток определявшееся вблизи внутренней поверхности ядерной оболочки. Гипохромные, сморщенные гиперхромные и теневидные нейроны по строению не отличались от соответствующих фенотипических форм у интактных крыс, но были значительно увеличены в количестве (р < 0,05). Соответственно, доля малоизмененных нейронов в основной экспериментальной (гипогонадной) группе сократилась в 2 раза (табл. 1). Площадь тел малоизмененных нейронов также значительно сократилась; многие клетки были объединены в группы, причем в группе могли состоять наряду с малоизмененными нейронами другие формы жизнеспособных клеток - гипехромные и сморщенные гиперхромные (табл. 2). Количество клеток сателлитов и глиоцито-нейрональный индекс значительно увеличились. В результате терапии гипогонадных крыс тестостероном большинство нейронов медиальных аркуатных ядер обладало признаками малоизмененных (рис. 2 в). Эти нейроны выглядели более крупными, чем в основной экспериментальной группе, содержали многочисленные глыбки хроматофильной субстанции в хорошо выраженной цитоплазме и не были склонны к образованию групп. Удельное количество гипохромных и сморщенных гиперхромных клеток существенно не различалось с данным параметром у интактных крыс (табл. 1 и 2), тогда как доля теневидных нейронов в медиальном аркуатном ядре у животных обеих экспериментальных групп многократно превышала этот параметр у здоровых животных (р < 0,05). Площадь тел малоизмененных нейронов и количество групп нейронов после терапии тестостероном значительно уменьшились, по сравнению с этими параметрами у животных гипогонадной группы без лечения, и оказались близкими по значению с параметрами у интактных крыс (р > 0,05). Терапия тестостероном значительно не изменила глиоцито-нейрональный индекс, который у животных обеих экспериментальных групп оказался значительно выше, чем у контрольных животных (р > 0,05). Обсуждение полученных результатов Наличие в медиальном аркуатном ядре интактных крыс наряду с незмененными нейронами определенного числа измененных клеток может свидетельствовать о незавершенности процесса программированной гибели нейронов у молодых взрослых крыс. Эти данные согласуются с результатами исследований различных отделов мезокортиколимбической дофаминергической системы и неокортекса здоровых людей и крыс разного возраста [1, 2]. Комплекс признаков дегенеративных изменений нейронов медиального аркуатного ядра, установленный в условиях устойчивого дефицита тестостерона у крыс пубертатного возраста, по-видимому, обусловлен значительным ослаблением синтетических процессов. В этом убеждают недавно полученные экспериментальные доказательства. Оказалось, в частности, что тестостерон после связывания с рецепторами различных тканевых клеток способствует раскрытию ионных каналов клеточных мембран, увеличению их электрического потенциала [8], усиливает синтез ДНК и рибосомальной РНК [10]. Многократное увеличение числа сморщенных гиперхромных нейронов, уменьшение площади тел малоизмененных клеток могут быть обусловлены сгущением органелл и структурных компонентов ядра. Эти признаки обычно сочетаются с разрастанием сети промежуточных филаментов скелета и являются необратимыми признаками атрофии (склероза) клетки [4]. Также многократно увеличенным оказалось удельное количество гибнущих и погибших нейронов (клетки-«тени»). Значительное увеличение доли гипохромных нейронов может свидетельствовать об их возросшей функциональной нагрузке [4]. Обычно этот фенотип нейронов при патологических состояниях относят к обратимым проявлениям дистрофии [1, 4]. Рост числа групп нейронов и глиоцито-нейронального индекса, по-видимому, следует расценивать как неспецифическую компенсаторно-приспособительную реакцию этих клеток в ответ на их дегенеративные изменения, обусловленные снижением концентрации тестостерона. Известно, что глиоциты и нейроны способны обмениваться рядом жизненно важных микро- и макромолекул, таких как глюкоза, РНК [7], нейронотрофического глиального фактора [18], при этом объединяясь в группы [1, 2, 3]. Тысячи ассоциативных нейронов обонятельной булавы в головном мозге взрослых крыс, например, изменяют свои пространственные взаимоотношения ежесуточно [13]. Механизмом перегруппировки этих клеток авторы считают перестройку множества синаптических связей в результате гибели, поступления новой генерации нейронов из субвентрикулярной зоны и установления новых контактов клеток in situ. Компенсаторно-приспособительные и многие дегенеративные изменения нейронов при моделировании недостаточности тестостерона были устранены в результате компенсации этой недостаточности. Причина сохранения высокого процента клеток-«теней» в аркуатном ядре при терапии тестостероном гипогонадного состояния не вполне понятна. Однако она может свидетельствовать о высокой чувствительности процесса программированной гибели нейронов к колебаниям концентрации этого гормона. Заключение Таким образом, после экспериментального угнетения продукции тестостерона у новорожденных самцов крыс в медиальном аркуатном гипоталамическом ядре крыс пубертатного возраста развиваются дегенеративные (дистрофические, атрофические) и компенсаторно-приспособительные изменения. Первые выражаются сокращением доли и уменьшением площади малоизмененных нейронов, сморщиванием, гиперхромией, гипохромией, ростом удельного количества теневидных нейронов. Вторые выражаются признаками активации глио-нейрональных и межнейрональных взаимоотношений. Многие реактивные изменения клеток подвержены компенсационной коррекции в периоде половой зрелости. Патологически измененные нейроны аркуатного ядра, в свою очередь, могут изменять свое гормональное влияние на тканевые системы гонад и других органов, которое в данной экспериментальной модели не исследовано.

About the authors

Yulia Nikolaevna Khodulaeva

North-West Federal Medical Research Center

Email: dom-j@mail.ru
Junior researcher, Research laboratory of pediatric endocrinology

Zakhar Petrovich Asaulenko

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: Droblenkov_a@mail.ru
Student, Department of Histology and Embryology

Alekber Azizovoch Baymarov

North-West Federal Medical Research Center

Email: alekber@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Head, Research Laboratory of Pediatric Endocrinology

Irina Leorovna Nikitina

North-West Federal Medical Research Center

Email: nikitina0901@gmail.com
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Head, Research Laboratory of Pediatric Endocrinology

Andreiy Vsevolodovich Droblenkov

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: Droblenkov_a@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Associate Professor, Department of Histology and Embryology

References

Supplementary files