Роль микровезикул и нетоза при коагулопатиях у пациентов с COVID-19: рандомизированное клиническое исследование

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Высокая частота тромботических осложнений при COVID-19 существенно ухудшает прогноз заболевания. Ключевая проблема заключается в недостаточной изученности механизмов, связывающих системное воспаление и активацию нейтрофилов с образованием внеклеточных ловушек, а также нарушениями гемостаза, опосредованными микровезикулами.

Цель исследования. Изучить влияние микровезикул и нейтрофильных внеклеточных ловушек на развитие коагулопатий при COVID-19 в зависимости от тяжести течения, оценив их количественные и качественные характеристики.

Методы. В исследование включены 213 пациентов с COVID-19 (138 — среднетяжёлое течение, 75 — тяжёлое) и 20 здоровых доноров. Всем пациентам проведены биохимические, коагулометрические и гематологические исследования. Количественный анализ микровезикул выполняли методом проточной цитометрии с моноклональными антителами к поверхностным маркёрам (CD45, CD3, CD14, CD15, CD61). Взаимодействие микровезикул с нейтрофильными внеклеточными ловушками изучали методом конфокальной микроскопии (Leica TCS SP5) с применением флуоресцентных меток (DAPI, FITC, APC, PE) и последующей колокализацией в пакете Las AF. Статистический анализ выполнен с использованием критерия Стьюдента, коэффициента корреляции Спирмена и методов линейной регрессии.

Результаты. У пациентов со среднетяжёлым течением COVID-19 выявлена гиперкоагуляция (фибриноген 4,8 [4,00; 5,60] г/л; D-димер 0,78 [0,30; 1,28] мг/л) с повышенным уровнем микровезикул нейтрофильного (CD15⁺ 53,34±6,92%) и тромбоцитарного (CD61⁺ 59,74±11,22%) происхождения. Обнаружены нитеподобные структуры нейтрофильных внеклеточных ловушек с микровезикулами, ассоциированные с тканевым фактором (TF+). При тяжёлом течении зарегистрировано снижение микровезикул нейтрофильного (CD15⁺ 10,32±4,29%) и тромбоцитарного (CD61⁺ 20,9±6,01%) происхождения, тромбоцитопения (139,5 [104,25; 177,75]×10⁹/л) и гипокоагуляция (международное нормализованное отношение — 2,60 [2,32; 3,58]), а также агрегаты CD62⁺-позитивных микрочастиц.

Заключение. Микровезикулы и нейтрофильные внеклеточные ловушки играют ключевую роль в нарушении системы гемостаза при COVID-19: гиперкоагуляция на ранних стадиях опосредована их прокоагулянтной активностью, тогда как при тяжёлом течении снижение уровня циркулирующих в периферической крови микровезикул отражает коагулопатию потребления.

Об авторах

Елена Сегреевна Грачева

Казанский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: Gracheva020688@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8543-6529
SPIN-код: 3290-5459

аспирант, ассистент, каф. биохимии и клинической лабораторной диагностики

Россия, г. Казань

Ильшат Ганиевич Мустафин

Казанский государственный медицинский университет

Email: ilshat.mustafin@kazangmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-9683-3012
SPIN-код: 1588-6988

д-р мед. наук, профессор, заведующий, каф. биохимии и клинической лабораторной диагностики

Россия, г. Казань

Дмитрий Владимирович Самигуллин

Казанский институт биохимии и биофизики — Казанский научный центр Российской академии наук; Казанский национальный исследовательский технический университет им. А.Н. Туполева-КАИ

Email: samid75@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6019-5514
SPIN-код: 4751-7443

канд. биол. наук, заведующий, лаб. биофизики синаптических процессов

Россия, г. Казань; г. Казань

Диана Ильдаровна Абдулганиева

Казанский государственный медицинский университет

Email: diana-s@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7069-2725
SPIN-код: 6676-4270

д-р мед. наук, профессор, заведующий, каф. госпитальной терапии

Россия, г. Казань

Список литературы

  1. Tang N, Li D, Wang X, et al. Abnormal coagulation parameters are associated with poor prognosis in patients with novel coronavirus pneumonia. J Thromb Haemost. 2020;18(4):844–847. doi: 10.1111/jth.14768 EDN: NCKJIC
  2. Allegra A, Innao V, Allegra AG, et al. Coagulopathy and thromboembolic events in patients with SARS-CoV-2 infection: Pathogenesis and management strategies. Ann Hematol. 2020;99:1953–1965. doi: 10.1007/s00277-020-04182-4 EDN: DZOFFV
  3. Chowdary P. COVID-19 coagulopathy — what should we treat? Exp Physiol. 2022;107(7):749–758. doi: 10.1113/EP089404 EDN: NMZUHM
  4. Yavelov IS, Drapkina OM. COVID-19: Hemostasis system status and features of antithrombotic therapy. Cardiovascular Therapy and Prevention. 2020;19(3):2571. doi: 10.15829/1728-8800-2020-2571 EDN: DHVKSZ
  5. Matvienko OYu, Korsakova NE, Lerner AA, et al. Plasma hemostasis status in patients with SARS-CoV-2 coronavirus infection. Thrombosis, Hemostasis and Rheology. 2020;4:52–56. doi: 10.25555/THR.2020.4.0946 EDN: CKIYWV
  6. Sirotkina OV, Ermakov AI, Gaikovaya LV, et al. Blood cell microparticles in COVID-19 patients as a marker of hemostasis system activation. Thrombosis, Hemostasis and Rheology. 2020;4:35–40. doi: 10.25555/THR.2020.4.0943 EDN: FJTTAY
  7. Urban CF, Ermert D, Schmid M, et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 2009;5(10):e1000639. doi: 10.1371/journal.ppat.1000639
  8. Khandpur R, Carmona-Rivera C, Vivekanandan-Giri A, et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 2013;5(178):178ra40. doi: 10.1126/scitranslmed.3005580
  9. Mitsios A, Arampatzioglou A, Arelaki S, et al. NETopathies? Unraveling the dark side of old diseases through neutrophils. Front Immunol. 2016;7:678. doi: 10.3389/fimmu.2016.00678 EDN: YZXGND
  10. Kelly EJ, Oliver MA, Carney BC, et al. Neutrophil extracellular traps are induced by coronavirus 2019 disease-positive patient plasma and persist longitudinally: A possible link to endothelial dysfunction as measured by syndecan-1. Surg Infect. 2023;24(10):887–896. doi: 10.1089/sur.2023.156 EDN: XLYUTF
  11. Datla US, Vundurthy B, Hook JS, et al. Quantifying neutrophil extracellular trap release in a combined infection-inflammation NET-array device. Lab Chip. 2024;24(3):615–628. doi: 10.1039/d3lc00648d EDN: IJJQDP
  12. Martinod K, Wagner DD. Thrombosis: Tangled up in NETs. Blood. 2014;123(18):2768–2776. doi: 10.1182/blood-2013-10-463646
  13. Budnik I, Brill A. Immune factors in deep vein thrombosis initiation. Trends in Immunology. 2018;39(8):610–623. doi: 10.1016/j.it.2018.04.010 EDN: ZXCACX
  14. Brill A, Fuchs TA, Savchenko AS, et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemostasis. 2012;10(1):136–144. doi: 10.1111/j.1538-7836.2011.04544.x
  15. Savchenko AS, Martinod K, Seidman MA, et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. J Thromb Haemostasis. 2014;12(6):860–870. doi: 10.1111/jth.12571
  16. Mangold A, Alias S, Scherz T, et al. Coronary neutrophil extracellular trap burden and deoxyribonuclease activity in ST-elevation acute coronary syndrome are predictors of ST-segment resolution and infarct size. Circ Res. 2015;116(7):1182–1192. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.304944
  17. Ducroux C, Di Meglio L, Loyau S, et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tPA-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 2018;49(3):754–757. doi: 10.1161/STROKEAHA.117.019896
  18. Farkas AZ, Farkas VJ, Gubucz I, et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thromb Res. 2019;175:46–52. doi: 10.1016/j.thromres.2019.01.006
  19. Jing H, Zuo N, Novakovic VA, et al. The central role of extracellular vesicles in the mechanisms of thrombosis in COVID-19 patients with cancer and therapeutic strategies. Front Cell Dev Biol. 2022;9:792335. doi: 10.3389/fcell.2021.792335 EDN: GWLUZA
  20. Wang C, Yu C, Novakovic VA, et al. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Front Cell Dev Biol. 2022;9:784505. doi: 10.3389/fcell.2021.784505 EDN: AEYCNI
  21. Zubairov DM, Andrushko IA, Storozhev AL. The role of cell membrane fragments in blood coagulation processes. Kardiologiia. 1974;14(11):75–80. (In Russ.)
  22. Matvienko OYu, Smirnova OA, Golovina OG. The role of blood plasma microparticles in the development of procoagulant changes in patients after COVID-19. Thrombosis, Hemostasis and Rheology. 2024;2:48–53. doi: 10.25555/THR.2024.2.1098 EDN: FCELLB
  23. Ebeyer-Masotta M, Eichhorn T, Weiss R, et al. Activated platelets and platelet-derived extracellular vesicles mediate COVID-19-associated immunothrombosis. Front Cell Dev Biol. 2022;10:914891. doi: 10.3389/fcell.2022.914891 EDN: CULBCA
  24. Krishnamachary B, Cook C, Kumar A, et al. Extracellular vesicle-mediated endothelial apoptosis and EV-associated proteins correlate with COVID-19 disease severity. J Extracell Vesicl. 2021;10(9):e12117. doi: 10.1002/jev2.12117 EDN: RNERFQ
  25. Liao T-L, Liu H-J, Tang K-T, et al. SARS-CoV-2 primed platelets-derived microRNAs enhance NETs formation by extracellular vesicle transmission and TLR7/8 activation. Cell Commun Signal. 2023;21(1):304. doi: 10.1186/s12964-023-01345-4
  26. Gao X, Zhao X, Li J, et al. Neutrophil extracellular traps mediated by platelet microvesicles promote thrombosis and brain injury in acute ischemic stroke. Cell Commun Signal. 2024;22:50. doi: 10.1186/s12964-023-01379-8 EDN: CYVKPF
  27. Ducroux C, Di Meglio L, Loyau S, et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tPA-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 2018;49(3):754–757. doi: 10.1161/STROKEAHA.117.019896
  28. Khaertynov KhS, Boichuk SV, Anokhin VA, et al. Lymphocyte apoptosis in patients with COVID-19 coronavirus infection. Kazan Medical Journal. 2024;105(6):926–935. doi: 10.17816/KMJ633257 EDN: GCAXMM
  29. Nabiullina RM, Mukhitov AR, Litvinov RI, Zubairova LD. Binding of cellular microvesicles with fibrin during blood clotting. I.M. Sechenov Russian Journal of Physiology. 2016;102(5):597–605. EDN: VVWNFR
  30. Alekseeva EI, Tepaev RF, Shil'krot IYu, et al. COVID-19-induced "cytokine storm" — a special form of macrophage activation syndrome. Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2021;76(1):51–66. doi: 10.15690/vramn1410 EDN: NFDLWC

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Точечные диаграммы, типичные для каждой из исследуемых групп: a — среднее течение COVID-19; b — тяжёлое течение COVID-19; c — контроль.

Скачать (55KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Точечные диаграммы (a, e) и цитофлюорограммы микровезикул, экспрессирующих CD15 (b), CD45 (c), CD61 (d), CD14 (f), CD4 (g), CD3 (h), типичные для пациентов с COVID-19 среднетяжёлой степени тяжести. Анализ выполнен в пределах гейта, характерного для микровезикул при COVID-19.

Скачать (183KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Точечные диаграммы (a, e) и цитофлюорограммы микровезикул, экспрессирующих CD15 (b), CD45 (c), CD61 (d), CD14 (f), CD4 (g), CD3 (h), типичные для пациентов с COVID-19 тяжёлого течения. Анализ выполнен в пределах гейта, характерного для микровезикул при COVID-19.

Скачать (178KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Флуоресценция фрагментов ДНК и микровезикул в бестромбоцитарной плазме крови пациентов со среднетяжёлым течением COVID-19: a — фрагменты ДНК, окрашенные DAPI; b — моноклональные антитела к CD15; меченные флуорохромом FITC; c — CD13, меченные флуорохромом PE; d — скопление микрочастиц, позитивных по CD62, меченные флуорохромом APC; e — наложение четырёх каналов красителей.

Скачать (45KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Флуоресценция фрагментов ДНК и агрегатов микровезикул в бестромбоцитарной плазме крови пациентов со среднетяжёлым течением COVID-19: a — фрагменты ДНК, окрашенные DAPI; b — моноклональные антитела к CD15; меченные флуорохромом FITC; c — CD13, меченные флуорохромом PE; d — скопление микрочастиц, позитивных по CD62, меченные флуорохромом APC; e — наложение четырёх каналов красителей.

Скачать (58KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Флуоресценция фрагментов ДНК и микровезикул в бестромбоцитарной плазме крови пациентов со среднетяжёлым течением COVID-19: a — фрагменты ДНК, окрашенные DAPI; b — микровезикулы, позитивные по CD61, меченные флуорохромом FITC; c — TF, меченные флуорохромом PE; d — микровезикулы, позитивные по CD15, меченные флуорохромом APC; e — наложение четырёх каналов красителей.

Скачать (40KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Флуоресценция фрагментов ДНК и микровезикул в бестромбоцитарной плазме крови пациентов с тяжёлым течением COVID-19: a — фрагменты ДНК, окрашенные DAPI; b — моноклональные антитела к CD15, меченные флуорохромом FITC; c — CD13, меченные флуорохромом PE; d — скопление микрочастиц, позитивных по CD62, меченные флуорохромом APC; e — наложение четырёх каналов красителей.

Скачать (34KB)
Метаданные

© 2025 Эко-Вектор



Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».