Разработка подходов для геномного редактирования растений гороха с использованием технологии CRISPR/Cas9

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Митоген-активируемые протеинкиназы (МАРК) являются важными внутриклеточными регуляторами сигнальных путей у растений. Установлено, что некоторые МАРК активируются в корнях бобовых растений при симбиозе с азотфиксирующими бактериями — ризобиями. Один из таких сигнальных регуляторов — MAPK6, которая участвует в развитии симбиоза растений гороха посевного Pisum sativum L. с ризобиями. С использованием генно-инженерных подходов была осуществлена сверхэкспрессия гена PsMAPK6 в трансгенных корнях гороха, что привело к увеличению количества клубеньков и биомассы растений. Мы разработали новые подходы для редактирования генома гороха с использованием технологии CRISPR/Cas9 первичного редактирования (prime editing), когда в качестве мишени использовали ген PsMAPK6. При анализе трансгенных корней гороха в геноме трансформантов был выявлен ген, кодирующий последовательность направляющей РНК Cas9 (pegRNA, от англ. prime-editing guide RNA). Возможность использования методов генной инженерии для получения растений с повышенной эффективностью симбиоза является перспективной для дальнейших экспериментов.

Об авторах

Елизавета Степановна Канцурова

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

Email: rudaya.s.e@gmail.com
SPIN-код: 4752-1910

младший научный сотрудник лаборатории регулирования сигналов

Россия, 196608, Пушкин-8, Санкт-Петербург, шоссе Подбельского, д. 3

Николай Вадимович Козлов

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

Email: bionkbio@gmail.com
Россия, 196608, Пушкин-8, Санкт-Петербург, шоссе Подбельского, д. 3

Елена Анатольевна Долгих

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

Автор, ответственный за переписку.
Email: dol2helen@yahoo.com
SPIN-код: 4453-2060

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной и клеточной биологии

Россия, 196608, Пушкин-8, Санкт-Петербург, шоссе Подбельского, д. 3

Список литературы

  1. Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product // J Bacteriol. 1987. Vol. 169, N. 12. P. 5429–5433. doi: 10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987
  2. Feng Z., Zhang B., Ding W., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system // Cell Res. 2013. Vol. 23, N. 10. P. 1229–1232. doi: 10.1038/cr.2013.114
  3. Shen B., Zhang W., Zhang J., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects // Nat Methods. 2014. Vol. 11, N. 4. P. 399–402. doi: 10.1038/nmeth.2857
  4. Wang Y., Cheng X., Shan Q., et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew // Nat Biotechnol. 2014. Vol. 32, N. 9. P. 947–951. doi: 10.1038/nbt.2969
  5. Wang L., Chen L., Li R., et al. Reduced drought tolerance by CRISPR/Cas9-mediated SlMAPK3 mutagenesis in tomato plants // J Agric Food Chem. 2017. Vol. 65, N. 39. P. 8674–8682. doi: 10.1021/acs.jafc.7b02745
  6. Zhou J., Peng Z., Long J., et al. Gene targeting by the TAL effector PthXo2 reveals cryptic resistance gene for bacterial blight of rice // Plant J. 2015. Vol. 82, N. 4. P. 632–643. doi: 10.1111/tpj.12838
  7. Liu W., Zhu X., Lei M., et al. A detailed procedure for CRISPR/Cas9-mediated gene editing in Arabidopsis thaliana // Sci Bull. 2015. Vol. 60, N. 15. P. 1332–1347. doi: 10.1007/s11434-015-0848-2
  8. Mercx S., Tollet J., Magy B., et al. Gene Inactivation by CRISPR-Cas9 in Nicotiana tabacum BY-2 suspension cells // Front Plant Sci. 2016. Vol. 7. ID 40. doi: 10.3389/fpls.2016.00040
  9. Weiss T., Wang C., Kang X., et al. Optimization of multiplexed CRISPR/Cas9 system for highly efficient genome editing in Setaria viridis // Plant J. 2020. Vol. 104, N. 3. P. 828–838. doi: 10.1111/tpj.14949
  10. An Y., Geng Y., Yao J., et al. Efficient genome editing in populus using CRISPR/Cas12a // Front Plant Sci. 2020. Vol. 11. ID 593938. doi: 10.3389/fpls.2020.593938
  11. Wang L., Wang L., Tan Q., et al. Efficient inactivation of symbiotic nitrogen fixation related genes in Lotus japonicus using CRISPR-Cas9 // Front Plant Sci. 2016. Vol. 7. ID 1333. doi: 10.3389/fpls.2016.01333
  12. Wang L., Rubio M.C., Xin X., et al. CRISPR/Cas9 knockout of leghemoglobin genes in Lotus japonicus uncovers their synergistic roles in symbiotic nitrogen fixation // New Phytol. 2019. Vol. 224, N. 2. P. 818–832. doi: 10.1111/nph.16077
  13. Michno J.-M., Wang X., Liu J., et al. CRISPR/Cas mutagenesis of soybean and Medicago truncatula using a new web-tool and a modified Cas9 enzyme // GM Crops Food. 2015. Vol. 6, N. 4. P. 243–252. doi: 10.1080/21645698.2015.1106063
  14. Feng C., Yuan J., Wang R., et al. Efficient targeted genome modification in maize using CRISPR/Cas9 system // J Genet Genomics. 2016. Vol. 43, N. 1. P. 37–43. doi: 10.1016/j.jgg.2015.10.002
  15. Lee K., Eggenberger A.L., Banakar R., et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted T-DNA integration in rice // Plant Mol Biol. 2019. Vol. 99, N. 4–5. P. 317–328. doi: 10.1007/s11103-018-00819-1
  16. Alam M.S., Kong J., Tao R., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of the OsbHLH024 transcription factor improves salt stress resistance in rice (Oryza sativa L.) // Plants. 2022. Vol. 11, N. 9. ID 1184. doi: 10.3390/plants11091184
  17. Jacobs T.B., LaFayette P.R., Schmitz R.J., Parrott W.A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9 // BMC Biotechnol. 2015. Vol. 15, N. 1. ID 16. doi: 10.1186/s12896-015-0131-2
  18. Makhotenko A.V., Khromov A.V., Snigir E.A., et al. Functional analysis of coilin in virus resistance and stress tolerance of potato Solanum tuberosum using CRISPR-Cas9 editing // Biochem Biophys Mol Biol. 2019. Vol. 484, N. 1. P. 88–91. doi: 10.1134/S1607672919010241
  19. Dinkins R.D., Hancock J., Coe B.L., et al. Isoflavone levels, nodulation and gene expression profiles of a CRISPR/Cas9 deletion mutant in the isoflavone synthase gene of red clover // Plant Cell Rep. 2021. Vol. 40, N. 3. P. 517–528. doi: 10.1007/s00299-020-02647-4
  20. Gasparis S., Kala M., Przyborowski M., et al. A simple and efficient CRISPR/Cas9 platform for induction of single and multiple, heritable mutations in barley (Hordeum vulgare L.) // Plant Methods. 2018. Vol. 14, N. 1. ID 111. doi: 10.1186/s13007-018-0382-8
  21. Ren C., Liu X., Zhang Z., et al. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in Chardonnay (Vitis vinifera L.) // Sci Rep. 2016. Vol. 6, N. 1. ID 32289. doi: 10.1038/srep32289
  22. Tanaka J., Minkenberg B., Poddar S., et al. Improvement of gene delivery and mutation efficiency in the CRISPR-Cas9 Wheat (Triticum aestivum L.) Genomics System via Biolistics // Genes (Basel). 2022. Vol. 13, N. 7. ID 1180. doi: 10.3390/genes13071180
  23. Xie Y., Ul Haq S.I., Jiang X., et al. Plant genome editing: CRISPR, base editing, prime editing, and beyond // Grassl Res. 2022. Vol. 1, N. 4. P. 234–243. doi: 10.1002/glr2.12034
  24. Komor A.C., Kim Y.B., Packer M.S., et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage // Nature. 2016. Vol. 533, N. 7603. P. 420–424. doi: 10.1038/nature17946
  25. Mishra R., Joshi R.K., Zhao K. Base editing in crops: current advances, limitations and future implications // Plant Biotechnol J. 2020. Vol. 18, N. 1. P. 20–31. doi: 10.1111/pbi.13225
  26. Li C., Zong Y., Wang Y., et al. Expanded base editing in rice and wheat using a Cas9-adenosine deaminase fusion // Genome Biol. 2018. Vol. 19, N. 1. ID 59. doi: 10.1186/s13059-018-1443-z
  27. Yan D., Ren B., Liu L., et al. High-efficiency and multiplex adenine base editing in plants using new TadA variants // Mol Plant. 2021. Vol. 14, N. 5. P. 722–731. doi: 10.1016/j.molp.2021.02.007
  28. Zhang R., Liu J., Chai Z., et al. Generation of herbicide tolerance traits and a new selectable marker in wheat using base editing // Nat Plants. 2019. Vol. 5, N. 5. P. 480–485. doi: 10.1038/s41477-019-0405-0
  29. Li Y., Zhu Z., Wu H., et al. Precise base editing of non-allelic acetolactate synthase genes confers sulfonylurea herbicide resistance in maize // Crop J. 2020. Vol. 8, N. 3. P. 449–456. doi: 10.1016/j.cj.2019.10.001
  30. Veillet F., Perrot L., Chauvin L., et al. Transgene-free genome editing in tomato and potato plants using agrobacterium-mediated delivery of a CRISPR/Cas9 cytidine base editor // Int J Mol Sci. 2019. Vol. 20, N. 2. ID 402. doi: 10.3390/ijms20020402
  31. Butt H., Rao G.S., Sedeek K., et al. Engineering herbicide resistance via prime editing in rice // Plant Biotechnol J. 2020. Vol. 18, N. 12. P. 2370–2372. doi: 10.1111/pbi.13399
  32. Tang X., Sretenovic S., Ren Q., et al. Plant prime editors enable precise gene editing in rice cells // Mol Plant. 2020. Vol. 13, N. 5. P. 667–670. doi: 10.1016/j.molp.2020.03.010
  33. Li X., Zhou L., Gao B.-Q., et al. Highly efficient prime editing by introducing same-sense mutations in pegRNA or stabilizing its structure // Nat Commun. 2022. Vol. 13, N. 1. ID 1669. doi: 10.1038/s41467-022-29339-9
  34. Zong Y., Liu Y., Xue C., et al. An engineered prime editor with enhanced editing efficiency in plants // Nat Biotechnol. 2022. Vol. 40, N. 9. P. 1394–1402. doi: 10.1038/s41587-022-01254-w
  35. Hassan M., Yuan G., Chen J.-G., et al. Prime editing technology and its prospects for future applications in plant biology research // BioDesign Res. 2020. Vol. 2020. ID 9350905. doi: 10.34133/2020/9350905
  36. Lin Q., Zong Y., Xue C., et al. Prime genome editing in rice and wheat // Nat Biotechnol. 2020. Vol. 38, N. 5. P. 582–585. doi: 10.1038/s41587-020-0455-x
  37. Wada N., Ueta R., Osakabe Y., Osakabe K. Precision genome editing in plants: state-of-the-art in CRISPR/Cas9-based genome engineering // BMC Plant Biol. 2020. Vol. 20, N. 1. ID 234. doi: 10.1186/s12870-020-02385-5
  38. Yin J., Guan X., Zhang Z., et al. An MAP kinase interacts with LHK1 and regulates nodule organogenesis in Lotus japonicus // Sci China Life Sci. 2019. Vol. 62, N. 9. P. 1203–1217. doi: 10.1007/s11427-018-9444-9
  39. Hrbáčková M., Luptovčiak I., Hlaváčková K., et al. Overexpression of alfalfa SIMK promotes root hair growth, nodule clustering and shoot biomass production // Plant Biotechnol J. 2021. Vol. 19, N. 4. P. 767–784. doi: 10.1111/pbi.13503
  40. Bovin A.D., Dolgikh A.V., Dymo A.M., et al. Genetically modified legume plants as a basis for studying the signal regulation of symbiosis with nodule bacteria. Horticulturae. 2024. Vol. 10, N. 1. P. 9. doi: 10.3390/horticulturae10010009
  41. Bekešová S., Komis G., Krenek P., et al. Monitoring protein phosphorylation by acrylamide pendant Phos-TagTM in various plants // Front Plant Sci. 2015. Vol. 6. ID 339. doi: 10.3389/fpls.2015.00336
  42. Orosz L., Svab Z., Kondorosi A., Sik T. Genetic studies on rhizobiophage 16–3 // Mol Gen Genet. 1973. Vol. 125, N. 4. P. 341–350. doi: 10.1007/BF00276589
  43. Krall L., Wiedemann U., Unsin G., et al. Detergent extraction identifies different VirB protein subassemblies of the type IV secretion machinery in the membranes of Agrobacterium tumefaciens // PNAS. 2002. Vol. 99, N. 17. P. 11405–11410. doi: 10.1073/pnas.172390699
  44. van Brussel A.A., Tak T., Wetselaar A., et al. Small leguminosae as test plants for nodulation of Rhizobium leguminosarum and other rhizobia and agrobacteria harbouring a leguminosarum sym-plasmid // Plant Sci Lett. 1982. Vol. 27, N. 3. P. 317–325. doi: 10.1016/0304-4211(82)90134-1
  45. Kreplak J., Madoui M.-A., Capal P., et al. A reference genome for pea provides insight into legume genome evolution // Nat Genet. 2019. Vol. 51, N. 9. P. 1411–1422. doi: 10.1038/s41588-019-0480-1
  46. Concordet J.-P., Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens // Nucleic Acids Res. 2018. Vol. 46, N. W1. P. W242–W245. doi: 10.1093/nar/gky354
  47. Bae S., Park J., Kim J.-S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases // Bioinformatics. 2014. Vol. 30, N. 10. P. 1473–1475. doi: 10.1093/bioinformatics/btu048
  48. Decaestecker W., Buono R.A., Pfeiffer M.L., et al. CRISPR-Tsko: A technique for efficient mutagenesis in specific cell types, tissues, or organs in Arabidopsis // Plant Cell. 2019. Vol. 31, N. 12. P. 2868–2887. doi: 10.1105/tpc.19.00454
  49. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: A Laboratory manual. 3rd Edition. United States: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. 435 p.
  50. Афонин А.М., Леппянен И.В., Кулаева О.А., и др. Референсный транскриптом микоризованных корней гороха посевного (Pisum sativum L.) с высоким покрытием // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2020. Т. 24, № 4. С. 331–339. EDN ZWFVZW doi: 10.18699/VJ20.625
  51. Alves-Carvalho S., Aubert G., Carrere S., et al. Full-length de novo assembly of RNA-seq data in pea (Pisum sativum L.) provides a gene expression atlas and gives insights into root nodulation in this species // Plant J. 2015. Vol. 84, N. 1. P. 1–19. doi: 10.1111/tpj.12967
  52. Schiessl K., Lilley J.S.L., Lee T., et al. NODULE INCEPTION recruits the lateral root developmental program for symbiotic nodule organogenesis in Medicago truncatula // Curr Biol. 2019. Vol. 29, N. 21. P. 3657–3668.e5. doi: 10.1016/j.cub.2019.09.005
  53. Ichimura K., Shinozaki K., Mundy J., et al. Mitogen-activated protein kinase cascades in plants: a new nomenclature // Trends Plant Sci. 2002. Vol. 7, N. 7. P. 301–308. doi: 10.1016/S1360-1385(02)02302-6

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схематическое изображение структуры гена MAPK6 и сайта-мишени TXY для первичного редактирования с помощью CRISPR/Cas9: а — структура гена MAPK6; b — белок MAPK6 и сайт замены аминокислотных остатков TXY на DXD; c — расположение pegRNA, включая направляющую РНК (gRNA), РНК-шпильку (RNA scaffold) и матрицу для обратной транскриптазы (RT template), а также сайт PAM для Cas9

Скачать (352KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Схема, иллюстрирующая строение вектора pGGK-AG для редактирования генома с помощью технологии CRISPR/Cas9. Вектор pGG-C-D содержит последовательность, кодирующую никазу Cas9 (H840A) и обратную транскриптазу вируса мышиного лейкоза (с оптимизированными кодонами для синтеза белка в растениях). Клонирование направляющей РНК (gRNA) на направляющую РНК для первичного редактирования (pegRNA) проводили в векторе pGG-F-G. Модифицированная последовательность состоит из направляющей РНК (gRNA), РНК-шпильки (RNA scaffold) и матрицы для обратной транскриптазы (RT template) с заменами в гене, кодирующем MAPK6. тРНК — РНК-мишень

Скачать (253KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Схема, иллюстрирующая проведенные замены в векторе pGG-C-D (а) и векторе pGG-F-G (b), использованных для создания генетической конструкции в конечном векторе pGGK-AG для редактирования генома с использованием CRISPR/Cas9. тРНК — РНК-мишень

Скачать (246KB)
Метаданные
5. Рис. 4. ПЦР-анализ трансгенных корней гороха у композитных растений сорта Frisson, полученных при трансформации Agrobacterium rhizogenes. ДНК выделяли из корней трансформантов (Т). В качестве контроля использовали растения, трансформированные конструкцией с геном, кодирующим бактериальную β-глюкуронидазу (GUS): а — анализ выявил наличие гена Cas9 в геноме трансформантов (Т), но не у GUS-контрольных растений. Использованы праймеры к промотору pPcUBI (F) и гену Cas9 (R); b — наличие последовательности pegRNA было показано в геноме трансформантов, но не у GUS-контрольных растений. Были использованы праймеры к промотору pAtU6 (F) и gRNA-MAPK6 (R)

Скачать (152KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2024


 


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах