Сравнение эффективности якорных белков ScAGα1p, KpCW51p, KpCW61p для поверхностного дисплея у дрожжей Komagataella phaffii

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Актуальность. Дрожжевой дисплей — эффективная технология выведения на поверхность клетки целевых белков посредством их слияния с белками клеточной стенки. Данная методика, в том числе, позволяет получать на основе дрожжей вакцинные препараты путем экспонирования на их клеточной поверхности белков-антигенов. Поиск и характеристика белков, позволяющих эффективно экспонировать целевые белки на поверхности клеток Komagataella phaffii, — актуальная задача.

Цель работы — сравнить эффективность белков клеточной стенки ScAGα1p, включая исследование нескольких вариантов кодирующей последовательности гена ScAGα1, а также KpCW51p, KpCW61p для экспонирования репортерного белка на поверхности клеток.

Материалы и методы. Изучаемые последовательности генов были проклонированы под контролем промотора гена АОХ1 в одной рамке считывания с геном репортерного белка eGFP и интегрированы в геном штамма Х-33 дрожжей K. phaffii.

Результаты. Иммуноцитохимический анализ и конфокальная микроскопия штаммов, экспонирующих на своей поверхности белок eGFP в условиях индукции промотора гена АОХ1, позволили выявить наиболее эффективный якорный белок. Наилучшие результаты были продемонстрированы при использовании белка ScAGα1 — альфа-агглютинина дрожжей Saccharomyces cerevisiae, структурный ген которого не содержал нативной 3'-некодирующей области.

Выводы. Полученные в работе плазмиды позволят получить штаммы дрожжей K. phaffii, эффективно экспонирующие на своей поверхности белки, в том числе антигены, которые можно будет использовать в качестве вакцинного препарата.

Об авторах

Михаил Александрович Цыганков

Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: mial.tsygankov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2513-6655
SPIN-код: 1098-0995
Scopus Author ID: 56252740000

инженер-исследователь, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Михайлович Румянцев

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: rumyantsev-am@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1744-3890
SPIN-код: 9335-1184
Scopus Author ID: 55370658800

канд. биол. наук, ст. научн. сотр., биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики

Россия, Санкт-Петербург

Анастасия Станиславовна Макеева

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: anastasimakeeva@mail.ru
SPIN-код: 1412-8449

инженер-исследователь, аспирантка, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики

Россия, Санкт-Петербург

Марина Владимировна Падкина

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: mpadkina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4051-4837
SPIN-код: 7709-0449
Scopus Author ID: 6602596755

д-р биол. наук, профессор, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface // Science. 1985. Vol. 228, No. 4705. P. 1315–1317. doi: 10.1126/science.4001944
  2. Ueda M. Establishment of cell surface engineering and its development // Biosci Biotechnol Biochem. 2016. Vol. 80, No. 7. P. 1243–1253. doi: 10.1080/09168451.2016.1153953
  3. Schreuder M.P., Brekelmans S., van den Ende H., Klis F.M. Targeting of a heterologous protein to the cell wall of Saccharomyces cerevisiae // Yeast. 1993. Vol. 9, No. 4. P. 399–409. doi: 10.1002/yea.320090410
  4. Boder E.T., Wittrup K.D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries // Nat Biotechnol. 1997. Vol. 15, No. 6. P. 553–557. doi: 10.1038/nbt0697-553
  5. Kurtzman C.P. Biotechnological strains of Komagataella (Pichia) pastoris are Komagataella phaffii as determined from multigene sequence analysis // J Ind Microbiol Biotechnol. 2009. Vol. 36, No. 11. P. 1435–1438. doi: 10.1007/s10295-009-0638-4
  6. Kim S.-Y., Sohn J.-H., Pyun Y.-R., Choi E.-S. A cell surface display system using novel GPI-anchored proteins in Hansenula polymorpha // Yeast. 2002. Vol. 19, No. 13. P. 1153–1163. doi: 10.1002/yea.911
  7. Tanaka T., Yamada R., Ogino C., Kondo A. Recent developments in yeast cell surface display toward extended applications in biotechnology // Appl Microbiol Biotechnol. 2012. Vol. 95, No. 3. P. 577–591. doi: 10.1007/s00253-012-4175-0
  8. Bielen A., Tepariс R., Vujaklija D., Mrsa V. Microbial anchoring systems for cell-surface display of lipolytic enzymes // Food Technol Biotechnol. 2014. Vol. 52, No. 1. P. 16–34.
  9. Wasilenko J.L., Sarmento L., Spatz S., Pantin-Jackwood M. Cell surface display of highly pathogenic avian influenza virus hemagglutinin on the surface of Pichia pastoris cells using alpha-agglutinin for production of oral vaccines // Biotechnol Prog. 2010. Vol. 26, No. 2. P. 542–547. doi: 10.1002/btpr.343
  10. Lei H., Jin S., Karlsson E., et al. Yeast surface-displayed H5N1 avian influenza vaccines // J Immunol Res. 2016. Vol. 2016. ID4131324. doi: 10.1155/2016/4131324
  11. Angelini A., Chen T.F., de Picciotto S., et al. Protein Engineering and selection using yeast surface display // Methods Mol Biol. 2015. Vol. 1319. P. 3–36. doi: 10.1007/978-1-4939-2748-7_1
  12. Cherf G.M., Cochran J.R. Applications of yeast surface display for protein engineering // Methods Mol Biol. 2015. Vol. 1319. P. 155–175. doi: 10.1007/978-1-4939-2748-7_8
  13. Pack S.P., Park K., Yoo Y.J. Enhancement of β-glucosidase stability and cellobiose-usage using surface-engineered recombinant Saccharomyces cerevisiae in ethanol production // Biotechnology Letters. 2002. Vol. 24. P. 1919–1925. doi: 10.1023/A:1020908426815
  14. Andreu C., Del Olmo M.L. Yeast arming systems: pros and cons of different protein anchors and other elements required for display // Appl Microbiol Biotechnol. 2018. Vol. 102, No. 6. P. 2543–2561. doi: 10.1007/s00253-018-8827-6
  15. Mattanovich D., Callewaert N., Rouzé P., et al. Open access to sequence: browsing the Pichia pastoris genome // Microb Cell Fact. 2009. Vol. 8. ID53. doi: 10.1186/1475-2859-8-53
  16. Cereghino J.L., Cregg J.M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris // FEMS Microbiol Rev. 2000. Vol. 24, No. 1. P. 45–66. doi: 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x
  17. Падкина М.В., Самбук Е.В. Перспективы использования дрожжевого дисплея в биотехнологии и клеточной биологии (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2018. Т. 54, № 4. С. 337–351. doi: 10.7868/S0555109918040013
  18. Ahmad M., Hirz M., Pichler H., Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production // Appl Microbiol Biotechnol. 2014. Vol. 98, No. 12. P. 5301–5317. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5
  19. Prabhu A.A., Boro B., Bharali B., et al. Gene and process level modulation to overcome the bottlenecks of recombinant proteins expression in Pichia pastoris // Curr Pharm Biotechnol. 2017. Vol. 18, No. 15. P. 1200–1223. doi: 10.2174/1389201019666180329112827
  20. Cereghino G.P.L., Cereghino J.L., Ilgen C., Cregg J.M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris // Curr Opin Biotechnol. 2002. Vol. 13, No. 4. P. 329–332. doi: 10.1016/S0958-1669(02)00330-0
  21. Gaboardi G.C., Alves D., de los Santos D.G., et al. Influence of Pichia pastoris X-33 produced in industrial residues on productive performance, egg quality, immunity, and intestinal morphometry in quails // Sci Rep. 2019. Vol. 9, No. 1. ID 15372. doi: 10.1038/s41598-019-51908-0
  22. Mergler M., Wolf K., Zimmermann M. Development of a bisphenol A-adsorbing yeast by surface display of the Kluyveromyces yellow enzyme on Pichia pastoris // Appl Microbiol Biotechnol. 2004. Vol. 63, No. 4. P. 418–421. doi: 10.1007/s00253-003-1361-0
  23. Wang Q., Li L., Chen M., et al. Construction of a novel system for cell surface display of heterologous proteins on Pichia pastoris // Biotechnol Lett. 2007. Vol. 29, No. 10. P. 1561–1566. doi: 10.1007/s10529-007-9430-6
  24. Zhang L., Liang S., Zhou X., et al. Screening for glycosylphosphatidylinositol-modified cell wall proteins in Pichia pastoris and their recombinant expression on the cell surface // Appl Environ Microbiol. 2013. Vol. 79, No. 18. P. 5519–5526. doi: 10.1128/AEM.00824-13
  25. Yang J., Huang K., Xu X., et al. Cell Surface Display of Thermomyces lanuginosus Lipase in Pichia pastoris // Front Bioeng Biotechnol. 2020. Vol. 8. ID544058. doi: 10.3389/fbioe.2020.544058
  26. Matsuda T., Cepko C.L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro // PNAS USA. 2004. Vol. 101, No. 1. P. 16–22. doi: 10.1073/pnas.2235688100
  27. Wu S., Letchworth G.J. High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol // Biotechniques. 2004. Vol. 36, No. 1. P. 152–154. doi: 10.2144/04361DD02
  28. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984.
  29. graphpad.com [Электронный ресурс]. GraphPad Prism software [дата обращения: 2022 Oct 10]. Доступ по ссылке: https://www.graphpad.com/
  30. Lipke P.N., Kurjan J. Sexual agglutination in budding yeasts: structure, function, and regulation of adhesion glycoproteins // Microbiol Rev. 1992. Vol. 56, No. 1. P. 180–194. doi: 10.1128/mr.56.1.180-194.1992

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема плазмид, полученных в работе: a — плазмида с репортерным геном eGFP; b — полученные плазмиды с геном eGFP и генами белков клеточной стенки. 5'AOX1 — промотор гена AOX1, α-factor — альфа-фактор дрожжей; PTEF1 — дрожжевой промотор гена TEF1; PEM7 — бактериальный промотор; CYC1 TT — терминаторная область дрожжевого гена CYC1; Zeocin — ген устойчивости к зеоцину; pUC ori — ориджин-репликации; AOX1 TT — область терминации транскрипции гена AOX1; eGFP — ген репортерного белка; ScAGα1l (long), ScAGα1, KpCW51, KpCW61 — белки клеточной стенки; XhoI, XbaI, AgeI — сайты узнавания рестриктаз

Скачать (171KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами к генам ScAGα1long, ScAGα1, KpCW51, KpCW61. М — маркер NL001 (Евроген, Россия); 1 — ScAGα1long (ожидаемый фрагмент — 1421 п.н.), 2 — ScAGα1 (ожидаемый фрагмент — 985 п.н.), 3 — KpCW51 (ожидаемый фрагмент — 612 п.н.), 4 — KpCW61 (ожидаемый фрагмент — 171 п.н.)

Скачать (237KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР на матрице хромосомной ДНК дрожжевых трансформантов с генами ScAGα1long, ScAGα1, KpCW51, KpCW61 в одной рамке считывания с геном репортерного белка eGFP с использованием обратных праймеров к соответствующим генам белков клеточной стенки и прямым праймером к гену белка eGFP (1–3) или праймером к фрагменту гена AOX1 (4). М — маркер NL001 (Евроген, Россия); K+ — положительные контроли (плазмиды, которыми трансформировали исходный дрожжевой штамм); K– — отрицательные контроли (ПЦР реакционные смеси не содержащие матриц ДНК); 1 — ScAGα1long (ожидаемый фрагмент — 2158 п.н.); 2 — ScAGα1 (ожидаемый фрагмент — 1717 п.н.); 3 — KpCW51 (ожидаемый фрагмент — 1344 п.н.), 4 — KpCW61 (ожидаемый фрагмент — 1225 п.н.)

Скачать (256KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Конфокальная микроскопия полученных штаммов с репортерным белком eGFP. В качестве контрольного варианта (K–) использовали клетки исходного штамма K. phaffii X-33

Скачать (219KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Флуоресценция клеток с белком eGFP (a) и меченых красителем Cy3-антител к белку eGFP (b). Данные представлены со стандартной ошибкой среднего. K– — исходный штамм X-33

Скачать (84KB)
Метаданные

© Цыганков М.А., Румянцев А.М., Макеева А.С., Падкина М.В., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
 


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах