Разработка микрофлюидной тест-системы на основе флюоресцентных микросфер для обнаружения иммуноглобулинов класса G к SARS-CoV-2

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Обоснование. С 2019 года весь мир охватила пандемия новой коронавирусной инфекции COVID-19, которая продолжается по сей день. За эти годы возбудитель SARS-CoV-2 претерпел ряд мутационных изменений в геноме, что повлекло распространение различных генетических вариантов вируса. Между тем для диагностики этиологического агента, установления стадии заболевания и оценки иммунитета используются методы, неспецифичные в отношении различных вариантов SARS-CoV-2 и требующие значительных временных затрат. Таким образом, актуальным направлением является разработка новых методов диагностики COVID-19, а также внедрение данных разработок в практику. Широкие возможности в этом направлении открывают системы на основе химически модифицированных флюоресцентных микросфер с возможностью мультиплексного анализа целевых белковых молекул.

Цель исследования — разработка микрофлюидной тест-системы на основе флюоресцентных микросфер для специфического обнаружения иммуноглобулинов класса G (IgG) к SARS-CoV-2.

Методы. Формирование охарактеризованной коллекции образцов сыворотки крови человека с использованием иммуноферментного анализа и коммерчески доступных наборов реагентов. Обнаружение IgG к SARS-CoV-2 в сыворотке крови человека, содержащей известный уровень антител, разработанным иммунофлюоресцентным методом с использованием микросфер, на поверхности которых химическим путем был иммобилизован RBD-фрагмент S-белка вируса SARS-CoV-2, вариант Каппа.

Результаты. Согласно данным иммуноферментного анализа, уровень IgG в сыворотке крови добровольцев в группе, перенесших коронавирусную инфекцию, в 9–300 раз превышал таковой в группе условно здоровых добровольцев, не болевших COVID-19. Получены конъюгаты флюоресцентных микросфер с RBD-фрагментом S-белка, способные специфически связывать IgG из сыворотки крови. Образование иммунных комплексов подтверждено данными флюоресцентной микроскопии: интенсивность флюоресценции вторичных антител в иммунных комплексах при их образовании на поверхности флюоресцентных микросфер прямо пропорциональна содержанию IgG (r=0,963). Тест-система обладает хорошей прогностической значимостью (AUC 70,3%).

Заключение. Разработана тест-система на основе флюоресцентных микросфер, содержащих иммобилизованный RBD-фрагмент S-белка SARS-CoV-2, для иммунофлюоресцентного выявления IgG в сыворотке крови человека. При апробации системы на образцах сыворотки крови добровольцев с различным уровнем IgG к SARS-CoV-2 показана ее прогностическая ценность, что позволяет позиционировать представленную тест-систему как метод оценки содержания иммуноглобулинов к SARS-CoV-2 в сыворотке крови человека с перспективой внедрения в клиническую практику. Представленная тест-система может быть использована также для интеграции в различные микрофлюидные системы и создания чипов и приборов «прикроватной диагностики».

Об авторах

Руслан Ильдарович Шакуров

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина

Автор, ответственный за переписку.
Email: ruslan.shakurov@rcpcm.org
ORCID iD: 0000-0002-5986-0676
SPIN-код: 9576-8093

м.н.с.

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1А

Ярослав Дмитриевич Шанский

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина

Email: yar.shansky@rcpcm.org
ORCID iD: 0000-0003-4672-2474
SPIN-код: 7640-5940

к.б.н., н.с.

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1А

Кирилл Александрович Прусаков

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина

Email: k.prusakov@rcpcm.org
ORCID iD: 0000-0002-7244-5741
SPIN-код: 9244-6581

н.с.

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1А

Светлана Викторовна Сизова

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Email: sv.sizova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0846-4670
SPIN-код: 4322-1945

к.х.н., н.с.

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1А; Москва

Степан Павлович Дудик

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина

Email: stepan.dudik@rcpcm.org
ORCID iD: 0000-0002-3157-5902
SPIN-код: 8007-1870
Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1А

Людмила Валерьевна Плотникова

Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева

Email: ntmdfs@gmail.com
Россия, Москва

Валентин Александрович Манувера

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина

Email: vmanuvera@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2471-0563
SPIN-код: 9010-4521

к.б.н., с.н.с.

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1А

Дмитрий Владимирович Клинов

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина

Email: klinov.dmitry@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8288-2198
SPIN-код: 9830-8561

к.ф.-м.н.

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1А

Василий Николаевич Лазарев

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина

Email: lazar0@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0042-966X
SPIN-код: 1578-8932

д.б.н.

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1А

Юлия Андреевна Беспятых

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина; Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева

Email: JuliaBes@rcpcm.org
ORCID iD: 0000-0002-4408-503X
SPIN-код: 6003-9246

к.б.н.

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1А; Москва

Дмитрий Викторович Басманов

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина

Email: dmitry.basmanov@rcpcm.org
ORCID iD: 0000-0001-6620-7360
SPIN-код: 1801-6408

научный сотрудник

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1А

Список литературы

  1. World Health Organization. Tracking SARS-CoV-2 variants [cited 2023 February, 20]. Режим доступа: https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/. Дата обращения: 20.02.2023.
  2. Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Бычинин М.В., и др. Рациональная стратегия поддержания противовирусного иммунитета к новым вариантам SARS-CoV-2 // Клиническая практика. 2022. Т. 13, № 3. С. 43–55. [Baklaushev VP, Yusubalieva GM, Bychinin MV, et al. A rational strategy for the maintenance of antiviral immunity to new SARS-CoV-2 strains. Journal of Clinical Practice. 2022;13(3):43–55. (In Russ).] doi: 10.17816/clinpract111120
  3. Fernandes RS, de Oliveira Silva J, Gomes KB, et al. Recent advances in point of care testing for COVID-19 detection. Biomed Pharmacother 2022;153:113538. doi: 10.1016/J.BIOPHA.2022.113538
  4. Filchakova O, Dossym D, Ilyas A, et al. Review of COVID-19 testing and diagnostic methods. Talanta 2022;244:123409. doi: 10.1016/J.TALANTA.2022.123409
  5. Farmer S, Razin V, Peagler AF, et al. Don’t forget about human factors: Lessons learned from COVID-19 point-of-care testing. Cell Reports Methods 2022;2:100222. doi: 10.1016/J.CRMETH.2022.100222
  6. Zhong Z, Wang J, He S, et al. An encodable multiplex microsphere-phase amplification sensing platform detects SARS-CoV-2 mutations. Biosens Bioelectron. 2022;203:114032.
  7. Патент РФ № RU 200301 U1/2020.10.15. Прусаков К.А., Басманов Д.В., Алдаров К.Г., и др. Микрофлюидный чип для проведения многопараметрического иммуноанализа. [Patent RUS № RU 200301 U1/2020.10.15. Prusakov KA, Basmanov DV, Aldarov KG, et al. Microfluidic chip for multiparametric immunoassay. (In Russ).] Режим доступа: https://yandex.ru/patents/doc/RU200301U1_20201015. Дата обращения: 20.02.2023.
  8. Yuan H, Chen P, Wan C, et al. Merging microfluidics with luminescence immunoassays for urgent point-of-care diagnostics of COVID-19. TrAC Trends Anal Chem 2022; 157:116814. doi: 10.1016/J.TRAC.2022.116814
  9. Sheridan C. Fast, portable tests come online to curb coronavirus pandemic. Nat Biotechnol 2020;38:515–518. doi: 10.1038/D41587-020-00010-2
  10. Drain PK, Ampajwala M, Chappel C, et al. A rapid, high-sensitivity SARS-CoV-2 nucleocapsid immunoassay to aid diagnosis of acute COVID-19 at the point of care: A clinical performance study. Infect Dis Ther. 2021;10:753–761. doi: 10.1007/S40121-021-00413-X/FIGURES/2
  11. Chen R, Ren C, Liu M, et al. Early detection of SARS-CoV-2 seroconversion in humans with aggregation-induced near-infrared emission nanoparticle-labeled lateral flow immunoassay. ACS Nano. 2021;15:8996–9004. doi: 10.1021/ACSNANO.1C01932
  12. Zhou Y, Chen Y, Liu W, et al. Development of a rapid and sensitive quantum dot nanobead-based double-antigen sandwich lateral flow immunoassay and its clinical performance for the detection of SARS-CoV-2 total antibodies. Sensors Actuators B Chem 2021;343:130139. doi: 10.1016/J.SNB.2021.130139
  13. Hajazadeh F, Khanizadeh S, Khodadadi H, et al. SARS-COV-2 RBD (Receptor binding domain) mutations and variants (A sectional-analytical study). Microb Pathog 2022;168:105595. doi: 10.1016/J.MICPATH.2022.105595
  14. Heggestad JT, Kinnamon DS, Olson LB, et al. Multiplexed, quantitative serological profiling of COVID-19 from blood by a point-of-care test. Sci Adv 2021;7:4901–4926. doi: 10.1126/SCIADV.ABG4901/SUPPL_FILE/ABG4901_SOURCE_DATA.XLSX
  15. Gan HH, Zinno J, Piano F, Gunsalus KC. Omicron spike protein has a positive electrostatic surface that promotes ACE2 recognition and antibody escape. Front Virol 2022;2:43. doi: 10.3389/FVIRO.2022.894531

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
2. Рис. 1. Многослойный микрофлюидный чип: послойная модель (а), фото (б) и схематическая модель (в).

3. Рис. 2. Сравнение коэффициента позитивности для IgG в образцах сыворотки крови в исследуемых группах. Примечание. Точки — исходные данные, ящичная диаграмма — медиана, Q1–Q3 и интервал без выбросов.

4. Рис. 3. Изображение реакционной мембраны микрофлюидного чипа с проявленными флюоресцентными микросферами; в выноске — фрагмент мембраны с дополнительным увеличением (×4). Изображение получено в паспортном канале микросфер.

5. Рис. 4. Сравнение интенсивности флюоресценции вторичных антител anti-IgG в составе иммунных комплексов при образовании последних на поверхности микросфер в группах с низкими (IgG-) и высокими (IgG+) значениями коэффициента позитивности IgG. Примечание. Точки — исходные данные, ящичная диаграмма — медиана, Q1–Q3 и интервал без выбросов.

6. Рис. 5. ROC-кривая для тест-системы.


© Шакуров Р.И., Шанский Я.Д., Прусаков К.А., Сизова С.В., Дудик С.П., Плотникова Л.В., Манувера В.А., Клинов Д.В., Лазарев В.Н., Беспятых Ю.А., Басманов Д.В., 2023

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах