Сравнительное определение уровня экспрессии генов MxA, OAS1 и PKR в лейкоцитах пациентов с гриппозной и коронавирусной инфекцией

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Первой линией защиты хозяина против инвазии вирусных патогенов служит врожденный иммунный ответ, наиважнейшее звено которого — система интерферонов. Передача сигналов интерфероном индуцирует в клетке-мишени экспрессию широкого спектра специфических противовирусных белков, так называемых интерферон-стимулируемых генов. Наиболее эффективные интерферон-стимулируемые гены напрямую ингибируют репликацию вирусов РНК-центричным образом посредством деградации вирусной РНК, нарушения ее транспорта, ингибирования вирусной трансляции и т.п.

Цель — разработка количественной тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для оценки молекулярной регуляции интерферон-стимулируемых генов MxA, OAS1 и PKR человека, а также определение экспрессии этих генов в лейкоцитах крови в ответ на инфицирование РНК-содержащими вирусами.

Материалы и методы. Исследование проводили с использованием лейкоцитов, выделенных из крови пациентов с лабораторно подтвержденными заболеваниями грипп и COVID-19 на 3–4-й день после манифестации болезни. Для ex vivo индукции вирусного инфицирования использовали вирусы гриппа A/California/07/09pdm (H1N1pdm09), B/Malaysia/2506/04 (Викторианской генетической линии), штамм A2 респираторно-синцитиального вируса и вирус SARS-CoV-2 hCoV-19/Russia/SPE-RII-3524V/2020.

Результаты. Разработана мультиплексная тест-система на основе полимеразной цепной реакции для оценки экспрессии генов MxA, OAS1 и PKR, эффективность амплификации которых составила 101,9, 92,5 и 101,5 % соответственно. Разработанная тест-система была предложена для исследования молекулярной регуляции MxA, OAS1 и PKR в лейкоцитах при социально значимых заболеваниях, таких как грипп и COVID-19. Согласно полученным нами результатам у госпитализированных пациентов на 3–4-й день после появления симптомов заболевания уровни экспрессии генов MxA, OAS1 и PKR были значимо повышены на системном уровне в лейкоцитах крови. Показано, что стимуляция лейкоцитов, выделенных от здоровых волонтеров, вирусами гриппа А, B и респираторно-синцитиальным вирусом приводила к значимому увеличению уровней мРНК генов MxA, OAS1 и PKR через 24 ч после инфицирования. В то же время стимуляция лейкоцитов вирусом SARS-CoV-2 не приводила к изменению экспрессии этих генов.

Заключение. Разработанную тест-систему можно использовать для характеристики экспрессии противовирусных эффекторных интерферон-стимулируемых генов, что потенциально поможет в изучении эволюционно выбранных механизмов ускользания вирусов от врожденного иммунного ответа.

Об авторах

Сергей Анатольевич Клотченко

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России

Email: fosfatik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0289-6560
SPIN-код: 2632-6195

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории гриппозных вакцин

Россия, Санкт-Петербург

Екатерина Андреевна Романовская-Романько

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России

Email: ekaterina.romanovskaya@influenza.spb.ru
ORCID iD: 0000-0001-7560-398X
SPIN-код: 1012-8043

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории векторных вакцин

Россия, Санкт-Петербург

Вероника Андреевна Олейник

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России; Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)

Email: working.lyutik@gmail.com

лаборант-исследователь лаборатории гриппозных вакцин, студент

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Марья Алексеевна Егорова

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России

Email: sci-work_maria@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1408-8413
SPIN-код: 6055-1423

научный сотрудник лаборатории системной вирусологии

Россия, Санкт-Петербург

Варвара Сергеевна Монахова

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России

Email: varvara.bio@gmail.com
SPIN-код: 2111-8493

научный сотрудник лаборатории генной инженерии и экспрессии рекомбинантных белков

Россия, Санкт-Петербург

Евгений Валерьевич Венёв

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России; Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина

Email: imberbis@gmail.com

старший преподаватель, врач-инфекционист

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Марина Александровна Плотникова

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: biomalinka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8196-3156
SPIN-код: 2986-9850

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории векторных вакцин

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Yang E., Li M.M. All about the RNA: interferon-stimulated genes that interfere with viral RNA processes // Front. Immunol. 2020. Vol. 11. P. 605024. doi: 10.3389/fimmu.2020.605024
  2. Schneider W.M., Chevillotte M.D., Rice C.M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses // Annu. Rev. Immunol. 2014. Vol. 32. P. 513–545. doi: 10.1146/annurev-immunol-032713-120231
  3. Verhelst J., Hulpiau P., Saelens X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2013. Vol. 77, No. 4. P. 551–566. doi: 10.1128/MMBR.00024-13
  4. Al-khatib K., Williams B.R., Silverman R.H. et al. Distinctive roles for OAS and PKR in the in vivo anti-viral effect of an adenoviral vector expressing murine IFN-β // J. Immunol. 2004. Vol. 72, No. 9. P. 5638–5647. doi: 10.4049/jimmunol.172.9.5638
  5. Meurs E.F., Watanabe Y., Kadereit S. et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth // J. Virol. 1992. Vol. 66, No. 10. P. 5805–5814. doi: 10.1128/JVI.66.10.5805-5814.1992
  6. Williams B.R. Signal integration via PKR // Sci. STKE. 2001. No. 89. P. re2. doi: 10.1126/stke.2001.89.re2
  7. Wang S., Wu J., Wang F. et al. Expression pattern analysis of antiviral genes and inflammatory cytokines in PEDV-infected porcine intestinal epithelial cells // Front. Vet. Sci. 2020. Vol. 7. P. 75. doi: 10.3389/fvets.2020.00075
  8. Бахтеева Л.Б., Хайбуллина С.Ф., Ломбарди В.К. и др. Значение полиморфизма генов фермента 2’,5’-олигоаденилатсинтетазы в прогнозе ВИЧ-инфекции // Современные технологии в медицине. 2016. Т. 8, № 1. С. 99–105. doi: 10.17691/stm2016.8.1.13
  9. Knapp S., Yee L.J., Frodsham A.J. et al. Polymorphisms in interferon-induced genes and the outcome of hepatitis C virus infection: roles of MxA, OAS-1 and PKR // Genes Immun. 2003. Vol. 4, No. 6. P. 411–419. doi: 10.1038/sj.gene.6363984
  10. Lozhkov A.A., Plotnikova M.A., Egorova M.A. et al. Simultaneous detection of RIG-1, MDA5, and IFIT-1 expression is a convenient tool for evaluation of the interferon-mediated response // Viruses. 2022. Vol. 14, No. 10. P. 2090. doi: 10.3390/v14102090
  11. Sheppard P., Kindsvogel W., Xu W. et al. IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R // Nat. Immunol. 2003. Vol. 4, No. 1. P. 63–68. doi: 10.1038/ni873
  12. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R. et al. How cells respond to interferons // Annu. Rev. Biochem. 1998. Vol. 67, No. 1. P. 227–264. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.227
  13. Savvateeva E.N., Rubina A.Y., Gryadunov D.A. Biomarkers of community-acquired pneumonia: a key to disease diagnosis and management // Biomed. Res. Int. 2019. Vol. 2019. P. 1701276. doi: 10.1155/2019/1701276
  14. Blanco-Melo D., Nilsson-Payant B.E., Liu W. et al. Imbalanced host response to SARS-CoV-2 drives development of COVID-19 // Cell. 2020. Vol. 181, No. 5. P. 1036–1045.e9. doi: 10.1016/j.cell.2020.04.026
  15. Lei X., Dong X., Ma R. et al. Activation and evasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2 // Nat. Commun. 2020. Vol. 11, No. 1. P. 3810. doi: 10.1038/s41467-020-17665-9
  16. Kazmierski J., Friedmann K., Postmus D. et al. Nonproductive exposure of PBMCs to SARS-CoV-2 induces cell-intrinsic innate immune responses // Mol. Syst. Biol. 2022. Vol. 18, No. 8. P. e10961. doi: 10.15252/msb.202210961
  17. Hoffmann M., Kleine-Weber H., Schroeder S. et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor // Cell. 2020. Vol. 181, No. 2. P. 271–280.e8. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.052
  18. Song X., Hu W., Yu H. et al. Little to no expression of angiotensin-converting enzyme-2 on most human peripheral blood immune cells but highly expressed on tissue macrophages // Cytometry A. 2023. Vol. 103, No. 2. P. 136–145. doi: 10.1002/cyto.a.24285
  19. Xiong Y., Liu Y., Cao L. et al. Transcriptomic characteristics of bronchoalveolar lavage fluid and peripheral blood mononuclear cells in COVID-19 patients // Emerg. Microbes Infect. 2020. Vol. 9, No. 1. P. 761–770. doi: 10.1080/22221751.2020.1747363
  20. Faist A., Schloer S., Mecate-Zambrano A. et al. Inhibition of p38 signaling curtails the SARS-CoV-2 induced inflammatory response but retains the IFN-dependent antiviral defense of the lung epithelial barrier // Antiviral Res. 2023. Vol. 209. P. 105475. doi: 10.1016/j.antiviral.2022.105475

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Расчет эффективностей ПЦР в моноплексном и мультиплексном форматах: а — мультиплексная амплификация генов MxA, OAS1 и PKR (одновременная детекция в одной пробирке); b — разделение продуктов ПЦР в агарозном геле: 1 — OAS1, 2 — PKR, 3 — MxA, 4 — одновременная амплификация трех генов в мультиплексной ПЦР, 5 — маркер длин, 100 bp (Fermentas); c — стандартная калибровочная кривая, полученная для гена MxA в моноплексном формате ПЦР; d — стандартная калибровочная кривая, полученная для гена OAS1 в моноплексном формате ПЦР; e — стандартная калибровочная кривая, полученная для гена PKR в моноплексном формате ПЦР

Скачать (326KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Относительная экспрессия генов MxA, OAS1 и PKR в лейкоцитах пациентов с инфекцией вирусом гриппа А (ВГА), новой коронавирусной инфекцией (COVID-19) и у здоровых добровольцев (ЗД). Достоверность различий экспрессии у групп инфицированных людей по сравнению с группой здоровых добровольцев определяли с использованием непараметрического критерия Краскела – Уоллиса с поправкой Даннетта для множественного сравнения: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Скачать (177KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Изменение экспрессии генов MxA (a), OAS1 (b) и PKR (c) в лейкоцитах, полученных от здоровых добровольцев, в ответ на in vitro стимуляцию лейкоцитов вирусами гриппа А (ВГА), В (ВГВ), коронавирусом SARS-CoV-2 и респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ) по сравнению с неинфицированными клетками (КК). Достоверность различий в группах, стимулированных вирусами, относительно группы контрольных клеток определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для парных образцов с коррекцией Холма – Шидака: * — p < 0,05; ** — p < 0,01; *** — p < 0,001;**** — p < 0,0001; NS — non-significant, различия недостоверны

Скачать (190KB)
Метаданные
5. Рис. 1. Амплификация гена MxA при использовании разных флуорофоров и гасителей

Скачать (125KB)
Метаданные
6. Рис. 2. Кривые роста флуоресценции, полученные для линейки разведений образцов (от –9 до –2) при проведении ПЦР в режиме реального времени с детекцией на канале FAM для выявления MxA (a); ROX для выявления OAS1 (b); Cy5 для выявления PKR (c)

Скачать (320KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2023

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».