Выявление популяции клеток купфера в печени крысы с использованием моноклональных и поликлональных антител к микроглиальному маркеру Iba-1

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Использование современных методов иммуногистохимии — необходимый атрибут любого исследования, касающегося клеточной биологии различных структурных компонентов органов пищеварительного тракта. Одним из наиболее трудновизуализируемых объектов среди них являются клетки Купфера — резидентные макрофаги печени, что определяет высокую актуальность разработки надежных методов их выявления.

Цель — разработать протокол иммуногистохимического исследования клеток Купфера в печени крысы с использованием двух первичных антител против Iba-1 (поликлональных козьих и моноклональных кроличьих) и проанализировать преимущества и недостатки используемого метода с учетом применения цинк-этанол-формальдегида в качестве фиксатора.

Материалы и методы. Исследование проводили в образцах печени половозрелых крыс (n = 5). Поликлональные козьи антитела к Iba-1 в разведении 1 : 1000 (ab5076, Abcam, Великобритания) и моноклональные кроличьи антитела к Iba-1 в разведении 1 : 800 (ET1705-78, HuaBio, Китай) использовали для светооптического исследования резидентных макрофагов печени.

Результаты. Протокол с использованием поликлональных козьих антител и специфических блокаторов позволил обнаружить клетки Купфера в исследованных образцах, но также давал неспецифическое фоновое окрашивание. Протокол с использованием моноклональных кроличьих антител позволил выявить клетки Купфера в образцах печени крысы с большой специфичностью и минимальным фоновым окрашиванием тканей печени. При использовании протокола с применением моноклональных кроличьих антител было выявлено больше Iba-1-иммунопозитивных структур (большее количество клеток на единицу площади при исследовании одного и того же участка печени для каждого случая), чем при использовании протокола с поликлональными козьими антителами. Фиксация с использованием цинк-этанол-формальдегида позволила выявить Iba-1-иммунопозитивные клетки во всех образцах печени крыс.

Заключение. На основании полученных данных был сделан вывод, что фиксация цинк-этанол-формальдегидом сохраняет антигенные свойства тканей, позволяя эффективно использовать различные антитела. Из рассмотренных протоколов иммуногистохимического окрашивания наиболее оптимальным является протокол с использованием моноклональных кроличьих антител.

Об авторах

Инга Александровна Никитина

Институт экспериментальной медицины

Email: inga06819@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной гистологии и конфокальной микроскопии отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Валерия Алексеевна Разенкова

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: valeriya.raz@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3997-2232
SPIN-код: 8877-8902
Scopus Author ID: 57219609984
ResearcherId: AAH-1333-2021

аспирант, младший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Ольга Викторовна Кирик

Институт экспериментальной медицины

Email: olga_kirik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6113-3948
SPIN-код: 5725-8742
Scopus Author ID: 27171304100
ResearcherId: A-8710-2012

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Институт экспериментальной медицины

Email: DEK2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-код: 3252-3029
Scopus Author ID: 12770589000
ResearcherId: C-2206-2012

д-р мед. наук, профессор РАН, заведующий лабораторией функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Baeck C., Wei X., Bartneck M. et al. Pharmacological inhibition of the chemokine C-C motif chemokine ligand 2 (monocyte chemoattractant protein 1) accelerates liver fibrosis regression by suppressing Ly-6C+ macrophage infiltration in mice // Hepatology. 2014. Vol. 59, No. 3. P. 1060–1072. doi: 10.1002/hep.26783
  2. Tsuji Y., Kuramochi M., Golbar H.M. et al. Acetaminophen-induced rat hepatotoxicity based on M1/M2-macrophage polarization, in possible relation to damage-associated molecular patterns and autophagy // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21, No. 23. P. 8998. doi: 10.3390/ijms21238998
  3. Purhonen J., Rajendran J., Mörgelin M. et al. Ketogenic diet attenuates hepatopathy in mouse model of respiratory chain complex III deficiency caused by a Bcs1l mutation // Sci. Rep. 2017. Vol. 7. P. 1–16. doi: 10.1038/s41598-017-01109-4
  4. Mossanen J.C., Krenkel O., Ergen C. et al. Chemokine (C-C motif) receptor 2–positive monocytes aggravate the early phase of acetaminophen-induced acute liver injury // Hepatology. 2016. Vol. 64, No. 5. P. 1667–1682. doi: 10.1002/hep.28682
  5. Zhao Q., Sheng M.F., Wang Y.Y. et al. LncRNA Gm26917 regulates inflammatory response in macrophages by enhancing Annexin A1 ubiquitination in LPS-induced acute liver injury // Front. Pharmacol. 2022. Vol. 13. P. 975250. doi: 10.3389/fphar.2022.975250
  6. Nuovo G. False-positive results in diagnostic immunohistochemistry are related to horseradish peroxidase conjugates in commercially available assays // Ann. Diagn. Pathol. 2016. Vol. 25. P. 54–59. doi: 10.1016/j.anndiagpath.2016.09.010
  7. Hammond M.E.H., Hayes D.F., Dowsett M. et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version) // Arch. Pathol. Lab. Med. 2010. Vol. 134, No. 7. P. e48–e72. doi: 10.5858/134.7.e48
  8. Bordeaux J., Welsh A., Agarwal S. et al. Antibody validation // BioTechniques. 2010. Vol. 48, No. 3. P. 197–209. doi: 10.2144/000113382
  9. Коржевский Д.Э., Отеллин В.А., Григорьев И.П. и др. Иммуноцитохимическое выявления нейрональной NO-синтазы в клетках головного мозга крысы // Морфология. 2007. Т. 132, № 4. С. 77–80.
  10. Jiang Y., Tang Y., Hoover C. et al. Kupffer cell receptor CLEC4F is important for the destruction of desialylated platelets in mice // Cell Death Differ. 2021. Vol. 28, No. 11. P. 3009–3021. doi: 10.1038/s41418-021-00797-w
  11. Chen B., Li R., Kubota A. et al. Identification of macrophages in normal and injured mouse tissues using reporter lines and antibodies // Sci. Rep. 2022. Vol. 12, No. 1. P. 4542. doi: 10.1038/s41598-022-08278-x
  12. Ait Ahmed Y., Fu Y., Rodrigues R.M. et al. Kupffer cell restoration after partial hepatectomy is mainly driven by local cell proliferation in IL-6-dependent autocrine and paracrine manners // Cell. Mol. Immunol. 2021. Vol. 18, No. 9. P. 2165–2176. doi: 10.1038/s41423-021-00731-7
  13. Miyagawa S., Miwa S., Soeda J. et al. Morphometric analysis of liver macrophages in patients with colorectal liver metastasis // Clin. Exp. Metastasis. 2002. Vol. 19, No. 2. P. 119–125. doi: 10.1023/a:1014571013978
  14. Nishikawa K., Iwaya K., Kinoshita M. et al. Resveratrol increases CD68+ Kupffer cells colocalized with adipose differentiation-related protein and ameliorates high-fat-diet-induced fatty liver in mice // Mol. Nutr. Food Res. 2015. Vol. 59, No. 6. P. 1155–1170. doi: 10.1002/mnfr.201400564
  15. Ananiev J., Penkova M., Tchernev G. et al. Macrophages and dendritic cells in the development of liver injury leading to liver failure // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 2014. Vol. 28, No. 4. P. 789–794.
  16. Guillot A., Buch C., Jourdan T. Kupffer Cell and monocyte-derived macrophage identification by immunofluorescence on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) mouse liver sections // Methods Mol. Biol. 2020. Vol. 2164. P. 45–53. doi: 10.1007/978-1-0716-0704-6_6
  17. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Сырцова М.А. Микроглия черного вещества головного мозга человека // Медицинский академический журнал. 2014. Т. 14, № 4. С. 68–72.
  18. Hopperton K.E., Mohammad D., Trépanier M.O. et al. Markers of microglia in post-mortem brain samples from patients with Alzheimer’s disease: a systematic review // Mol. Psychiatry. 2018. Vol. 23, No. 2. P. 177–198. doi: 10.1038/mp.2017.246
  19. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Алексеева О.С., и др. Внутриядерное накопление белка IBA-1 в микроглиоцитах головного мозга человека // Морфология. 2016. Т. 149, № 2. С. 73–76.
  20. Saper C.B. A guide to the perplexed on the specificity of antibodies // J. Histochem. Cytochem. 2009. Vol. 57, No. 1. P. 1–5. doi: 10.1369/jhc.2008.952770
  21. Sasaki Y., Ohsawa K., Kanazawa H. et al. Iba1 is an actin-cross-linking protein in macrophages/microglia // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 286, No. 2. P. 292–297. doi: 10.1006/bbrc.2001.5388
  22. Nguyen T.T.H., Lee J.S., Shim H. Construction of rabbit immune antibody libraries // Methods Mol. Biol. 2018. Vol. 1701. P. 133–146. doi: 10.1007/978-1-4939-7447-4_7
  23. Rashidian J., Lloyd J. Single B Cell cloning and production of rabbit monoclonal antibodies // Methods Mol. Biol. 2020. Vol. 2070. P. 423–441. doi: 10.1007/978-1-4939-9853-1_23
  24. Григорьев И.П., Коржевский Д.Э. Современные технологии фиксации биологического материала, применяемые при проведении иммуногистохимических исследований (обзор) // Современные технологии в медицине. 2018. Т. 10, № 2. С. 156. doi: 10.17691/stm2018.10.2.19
  25. Патент RU2719163C1/ 17.04.2020. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Алексеева О.С. Способ демаскирования антигенов при проведении иммуноцитохимических реакций.
  26. Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, No. 7. P. 676–682. doi: 10.1038/nmeth.2019
  27. Pervin M., Hasan I., Kobir M.A. et al. Immunophenotypic analysis of the distribution of hepatic macrophages, lymphocytes and hepatic stellate cells in the adult rat liver // Anat. Histol. Embryol. 2021. Vol. 50, No. 4. P. 736–745. doi: 10.1111/ahe.12718
  28. Lefkowitch J.H., Haythe J.H., Regent N. Kupffer Cell aggregation and perivenular distribution in steatohepatitis // Mod. Pathol. 2002. Vol. 15, No. 7. P. 699–704. doi: 10.1097/01.MP.0000019579.30842.96
  29. Lee W.B., Erm S.K., Kim K.Y., Becker R.P. Emperipolesis of erythroblasts within Kupffer cells during hepatic hemopoiesis in human fetus // Anat. Rec. 1999. Vol. 256, No. 2. P. 158–164. doi: 10.1002/(SICI)1097-0185(19991001)256:2<158::AID-AR6>3.0.CO;2-0
  30. Urushihara N., Iwagaki H., Yagi T. et al. Elevation of serum interleukin-18 levels and activation of Kupffer cells in biliary atresia // J. Pediatr. Surg. 2000. Vol. 35, No. 3. P. 446–449. doi: 10.1016/s0022-3468(00)90211-2
  31. Brown K.E., Brunt E.M., Heinecke J.W. Immunohistochemical detection of myeloperoxidase and its oxidation products in Kupffer cells of human liver // Am. J. Pathol. 2001. Vol. 159, No. 6. P. 2081–2088. doi: 10.1016/S0002-9440(10)63059-3
  32. Domínguez-Soto A., Aragoneses-Fenoll L., Gómez-Aguado F. et al. The pathogen receptor liver and lymph node sinusoidal endotelial cell C-type lectin is expressed in human Kupffer cells and regulated by PU.1 // Hepatology. 2009. Vol. 49, No. 1. P. 287–296. doi: 10.1002/hep.22678
  33. Abdel Hafez S.M.N., Rifaai R.A., Bayoumi A.M.A. Impact of renal ischemia/reperfusion injury on the rat Kupffer cell as a remote cell: A biochemical, histological, immunohistochemical, and electron microscopic study // Acta Histochem. 2019. Vol. 121, No. 5. P. 575–583. doi: 10.1016/j.acthis.2019.04.008
  34. Haralanova-Ilieva B., Ramadori G., Armbrust T. Expression of osteoactivin in rat and human liver and isolated rat liver cells // J. Hepatol. 2005. Vol. 42, No. 4. P. 565–572. doi: 10.1016/j.jhep.2004.12.021
  35. Monnier J., Piquet-Pellorce C., Feige J.J. et al. Prokineticin 2/Bv8 is expressed in Kupffer cells in liver and is down regulated in human hepatocellular carcinoma // World J. Gastroenterol. 2008. Vol. 14, No. 8. P. 1182–1191. doi: 10.3748/wjg.14.1182
  36. Dong W., Lu A., Zhao J. et al. An efficient and simple co-culture method for isolating primary human hepatic cells: Potential application for tumor microenvironment research // Oncol. Rep. 2016. Vol. 36, No. 4. P. 2126–2134. doi: 10.3892/or.2016.4979

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Iba-1-иммунопозитивные клетки в препаратах печени крысы: a, с — с использованием поликлональных козьих антител; b, d — с использованием моноклональных кроличьих антител; а, b — с подкраской ядер гепатоцитов квасцовым гематоксилином, увеличение микроскопа ×40; c, d — увеличение микроскопа ×10. Звездочка — центральная вена

Скачать (530KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Результат цифрового преобразования изображений с демонстрацией кластеризации Iba-1-иммунопозитивных клеток в препаратах печени крысы. Алгоритм DBSCAN, значение параметров ε = 50, minDensity = 5 объектов: a — с использованием поликлональных козьих антител; b — с использованием моноклональных кроличьих антителозаглавлен

Скачать (439KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Площадь, занимаемая Iba-1-положительными структурами: a — попарное сравнение общей площади окрашивания Iba-1-иммунопозитивных клеток при использовании поликлональных козьих и моноклональных кроличьих антител; * р < 0,05; b — результат статистического сравнения площади окрашивания Iba-1-иммунопозитивных клеток для всех пар случаев (n = 5; N1–N5) для поликлональных козьих и моноклональных кроличьих антител. На оси Y слева на каждом графике расположена масштабно-инвариантная проекция шкалы оси Y справа (мкм2) на участок от [0, 1]; * р < 0,05, ** р < 0,01

Скачать (168KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2023



Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».