Получение рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 и его действие на клетки нейробластомы in vitro

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Цели настоящего исследования — разработка метода получения рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 человека на основе прокариотической системы экспрессии и характеристика полученного высокоочищенного белка.

Для достижения цели исследования были использованы следующие методы: автоматизированный химический синтез ДНК, конструирование экспрессионной плазмиды, получение клеток Escherichia coli — продуцента рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 человека, культивирование полученных клеток-продуцентов с индукцией синтеза рекомбинантного белка изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом и лактозой, очистка полученного рекомбинантного белка с применением методов аффинной и катионообменной хроматографии, а также изучение биологической активности полученного белка инсулиноподобного фактора роста-1 на культуре клеток нейробластомы Neuro 2a.

Показано, что при индукции экспрессии в клетках Escherichia coli BL21, содержащих плазмиду pET28-IGF-1, синтезируется рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста-1 человека, который образует тельца включения. Был получен препарат очищенного рекомбинантного белка с чистотой 98 % с использованием методов аффинной и катионообменной хроматографии. Выход белка составил 6 мг рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 человека с 1 г сырой биомассы штамма-продуцента. Полученный белок обладает способностью к защите клеток нейробластомы Neuro 2a от гибели, вызванной депривацией сыворотки в культуральной среде, и стимулирует дифференцировку клеток в нейроны.

Таким образом, получен высокоочищенный рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста-1 человека, обладающий биологической активностью, пригодный для проведения доклинических исследований.

Об авторах

Сергей Александрович Ищук

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Автор, ответственный за переписку.
Email: s.ischuk.spb@gmail.com

аспирант отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12

Елена Григорьевна Богомолова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»; ООО «Биохимический агент»

Email: bogomolovaele@inbox.ru

аспирант отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии ; заместитель директора по науке

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12; Санкт-Петербург

Ольга Андреевна Добровольская

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: dobrovolskaya-oly@yandex.ru

научный сотрудник отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12

Алёна Олеговна Ахметшина

ООО «Биохимический агент»

Email: akhmetshinaalena@gmail.com

научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Дарья Сергеевна Краснощек

ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова»

Email: dkrasnoshchek@list.ru

студент 6-го курса

Россия, 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6-8

Анна Алексеевна Луковенко

ООО «Биохимический агент»

Email: a.lukovenko@yahoo.com

младший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Е А Федорова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: science.eaf@yandex.ru

научный сотрудник отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12

А М Кляус

ООО «Инффарм Консалтинг»

Email: Inffarmcon@gmail.com

генеральный директор

Россия, Санкт-Петербург

Николай Николаевич Колмаков

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: ashvin.nick@gmail.com

научный сотрудник отдела молекулярной генетики

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12

Юлия Владиславовна Жеребцова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: juliazh@yandex.ru

младший научный сотрудник отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12

Илья Владимирович Духовлинов

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: dukhovlinov@gmail.com

канд. биол. наук, заведующий лабораторией генной инженерии белков отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12

Николай Анатольевич Климов

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: nklimov@mail.ru

канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной биотехнологии и иммунофармакологии

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12

Андрей Семенович Симбирцев

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: simbas@mail.ru

д-р биол. наук, член-корр. РАН, заведующий отделом медицинской биотехнологии и иммунофармакологии

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12

Список литературы

  1. Laviola L, Natalicchio A, Perrini S, Giorgino F. Abnormalities of IGF-I signaling in the pathogenesis of diseases of the bone, brain, and fetoplacental unit in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2008;295(5):E991-999. https://doi.org/10.1152/ajpendo.90452.2008.
  2. Dyer AH, Vahdatpour C, Sanfeliu A, Tropea D. The role of Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF-1) in brain development, maturation and neuroplasticity. Neuroscience. 2016;325:89-99. https://doi.org/10.1016/ j.neuroscience.2016.03.056.
  3. O’Kusky J, Ye P. Neurodevelopmental effects of insulin-like growth factor signaling. Front Neuroendocrinol. 2012;33(3):230-251. https://doi.org/10.1016/j.yfrne.2012.06.002.
  4. Yamada M, Tanabe K, Wada K, et al. Differences in survival-promoting effects and intracellular signaling properties of BDNF and IGF-1 in cultured cerebral cortical neurons. J Neurochem. 2001;78(5):940-951. https://doi.org/10.1046/j.1471-4159.2001.00497.x.
  5. Lindholm D, Carroll P, Tzimagiorgis G, Thoenen H. Autocrine-paracrine Regulation of Hippocampal Neuron Survival by IGF-1 and the Neurotrophins BDNF, NT-3 and NT-4. Eur J Neurosci. 1996;8(7):1452-1460. https://doi.org/10.1111/j.1460-9568.1996.tb01607.x.
  6. Fernandez M, Sanchez-Franco F, Palacios N, et al. IGF-I inhibits apoptosis through the activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in pituitary cells. J Mol Endocrinol. 2004:155-163. https://doi.org/10.1677/jme.0.0330155.
  7. Reinhardt RR. Insulin-like growth factors cross the blood-brain barrier. Endocrinology. 1994;135(5):1753-1761. https://doi.org/10.1210/endo.135.5.7525251.
  8. Nishijima T, Piriz J, Duflot S, et al. Neuronal activity drives localized blood-brain-barrier transport of serum insulin-like growth factor-I into the CNS. Neuron. 2010;67(5):834-846. https://doi.org/10.1016/ j.neuron.2010.08.007.
  9. Thorne RG, Pronk GJ, Padmanabhan V, Frey WH, 2nd. Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration. Neuroscience. 2004;127(2):481-496. https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2004.05.029.
  10. Expasy.org [Internet]. ExPASy. Bioinformatics Resource Portal [cited 2018 Feb 17]. Avaliable from: https://www.expasy.org/.
  11. Bake S, Selvamani A, Cherry J, Sohrabji F. Blood brain barrier and neuroinflammation are critical targets of IGF-1-mediated neuroprotection in stroke for middle-aged female rats. PLoS One. 2014;9(3):e91427. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091427.
  12. Kooijman R, Sarre S, Michotte Y, De Keyser J. Insulin-like growth factor I: a potential neuroprotective compound for the treatment of acute ischemic stroke? Stroke. 2009;40(4):e83-88. https://doi.org/10.1161/STROKEAHA.108.528356.
  13. Liu X-F, Fawcett JR, Thorne RG, Frey Ii WH. Non-invasive intranasal insulin-like growth factor-I reduces infarct volume and improves neurologic function in rats following middle cerebral artery occlusion. Neurosci Lett. 2001;308(2):91-94. https://doi.org/10.1016/s0304-3940(01)01982-6.
  14. Majumder K. Ligation-free gene synthesis by PCR: synthesis and mutagenesis at multiple loci of a chimeric gene encoding OmpA signal peptide and hirudin. Gene. 1992;110(1):89-94. https://doi.org/10.1016/0378-1119(92)90448-x.
  15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. [Maniatis T, Fritsch E, Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Moscow: Mir; 1984. (In Russ.)]
  16. Studier FW. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 2014;1091:17-32. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-691-7_2.
  17. Shunyan J, Shuqin L, Chunjiang Z, Changxin W. Developing Protocols of Tricine-SDS-PAGE for Separation of Polypeptides in the Mass Range 1-30 kDa with Minigel Electrophoresis System. Int J Electrochem Sci. 2016;11:640-649.
  18. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193(1):265-275.
  19. Rotwein P. Two insulin-like growth factor I messenger RNAs are expressed in human liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1986;83(1):77-81. https://doi.org/10.1073/pnas.83.1.77.
  20. Codon usage database. URL: http://www.kazusa.or.jp/codon.
  21. Vincent AM, Mobley BC, Hiller A, Feldman EL. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol Dis. 2004;16(2):407-416. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2004.03.001.
  22. Tang Y, Zhang W, Tang H, Li P. Protective effects of IGF-1 on neurons under condition of hypoxia and the role of PI3K signal pathway. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2011;36(1):21-26. https://doi.org/10.3969/j.issn.1672-7347.2011.01.004.
  23. Духовлинов И.В., Богомолова Е.Г., Добровольская О.А., и др. Продукция in vivo инсулиноподобного фактора роста-1 (ИФР-1), кодируемого плазмидной ДНК // Медицинский академический журнал. - 2017. - Т. 17. - № 3. - С. 47-52. [Dukhovlinov IV, Bogomolova EG, Dobrovolskaya OV, et al. In vivo production of insulin-like growth factor coded by plasmid DNA. Med Akad Z. 2017;17(3):47-52. (In Russ.)]
  24. Han IK, Kim MY, Byun HM, et al. Enhanced brain targeting efficiency of intranasally administered plasmid DNA: an alternative route for brain gene therapy. J Mol Med (Berl). 2007;85(1):75-83. https://doi.org/10.1007/s00109-006-0114-9.
  25. Lin S, Fan LW, Rhodes PG, Cai Z. Intranasal administration of IGF-1 attenuates hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats. Exp Neurol. 2009;217(2):361-370. https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2009.03.021.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Электрофореграмма белков, полученных из лизатов клеток E. coli BL21 (pET28-IGF-1) после индукции синтеза рекомбинантного ИФР-1 человека: 1 — маркер молекулярного веса Thermo Fisher Scientific; 2 — контроль (ночная культура без индуктора); 3 — индукция 1 мМ ИПТГ, 5 часов; 4 — индукция 0,2 % лактозой по методу Штудиера, 18 часов

Скачать (155KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Очистка рекомбинантного ИФР-1 человека методом металлохелатной хроматографии. Нанесено 80 мг белка. На хроматограмме: линия [1] — оптическая плотность при длине волны 280 нм; линия [2] — градиент имидазола

Скачать (130KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофорез в 12,5 % ПААГ очищенного рекомбинантного ИФР-1 человека: 1 — маркеры молекулярной массы Thermo Fisher Scientific; 2 — 5 мкг рекомбинантного белка ИФР-1, очищенного на колонке с SP-сефарозой

Скачать (54KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Влияние рекомбинантного ИФР-1 на дифференцировку клеток Neuro 2a in vitro: а — клетки Neuro 2a выращенные в бессывороточной среде в течение 48 часов (×100); б — клетки Neuro 2a выращенные аналогично (а) с добавлением 100 нг/мл ИФР-1 (×100); в — клетки Neuro 2a выращенные в бессывороточной среде в течение 3 часов с последующим возвратом в ростовую среду (положительный контроль дифференцировки) (×100)

Скачать (451KB)
Метаданные

© Ищук С.А., Богомолова Е.Г., Добровольская О.А., Ахметшина А.О., Краснощек Д.С., Луковенко А.А., Федорова Е.А., Кляус А.М., Колмаков Н.Н., Жеребцова Ю.В., Духовлинов И.В., Климов Н.А., Симбирцев А.С., 2018

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».