Binary proton therapy of Ehrlich carcinoma using targeted gold nanoparticles

M. V. Filimonova; Филимонова М. В.; D. D. Kolmanovich; Колманович Д. Д.; G. V. Tikhonowski; Тихоновский Г. В.; D. S. Petrunya; Петруня Д. С.; P. A. Kotelnikova; Котельникова П. А.; A. A. Shitova; Шитова А. А.; O. V. Soldatova; Солдатова О. В.; A. S. Filimonov; Филимонов А. С.; V. A. Rybachuk; Рыбачук В. А.; A. O. Kosachenko; Косаченко А. О.; K. A. Nikolaev; Николаев К. А.; G. A. Demyashkin; Демяшкин Г. А.; A. A. Popov; Попов А. А.; M. S. Savinov; Савинов М. С.; A. L. Popov; Попов А. Л.; I. V. Zelepukin; Зелепукин И. В.; A. A. Lipengolts; Липенгольц А. А.; K. E. Shpakova; Шпакова К. Е.; A. V. Kabashin; Кабашин А. В.; S. N. Koryakin; Корякин С. Н.; S. M. Deyev; Деев С. М.; I. N. Zavestovskaya; Завестовская И. Н.

doi:10.31857/S2686738924030104

Binary proton therapy of Ehrlich carcinoma using targeted gold nanoparticles

Authors: Filimonova M.V.¹^,2, Kolmanovich D.D.³^,4, Tikhonowski G.V.², Petrunya D.S.⁴^,2, Kotelnikova P.A.⁵, Shitova A.A.¹, Soldatova O.V.¹, Filimonov A.S.¹, Rybachuk V.A.¹, Kosachenko A.O.¹, Nikolaev K.A.¹, Demyashkin G.A.¹, Popov A.A.², Savinov M.S.², Popov A.L.³^,4, Zelepukin I.V.⁵, Lipengolts A.A.²^,6, Shpakova K.E.²^,6, Kabashin A.V.⁷, Koryakin S.N.¹^,2, Deyev S.M.⁵, Zavestovskaya I.N.⁴^,2
Affiliations:
1. National Medical Research Radiological Centre of the Ministry of Health of the Russian Federation
2. National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute)
3. Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences
4. P.N. Lebedev Physical Institute of the Russian Academy of Sciences
5. Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences
6. Institution N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of the Russian Federation
7. Aix-Marseille University
Issue: Vol 516, No 1 (2024)
Pages: 59-63
Section: Articles
URL: https://journals.rcsi.science/2686-7389/article/view/263918
DOI: https://doi.org/10.31857/S2686738924030104
EDN: https://elibrary.ru/VTOKHA
ID: 263918

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Proton therapy can treat tumors located in radiation-sensitive tissues. This article demonstrates the possibility of enhancing the proton therapy with targeted gold nanoparticles that selectively recognize tumor cells. Au-PEG nanoparticles at concentrations above 25 mg/L and 4 Gy proton dose caused complete death of EMT6/P cells in vitro. Binary proton therapy using targeted Au-PEG-FA nanoparticles caused an 80% tumor growth inhibition effect in vivo. The use of targeted gold nanoparticles is promising for enhancing the proton irradiation effect on tumor cells and requires further research to increase the therapeutic index of the approach.

Keywords

proton therapy, radiosensitizers, nanoparticles, gold, tumour therapy

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Протонная лучевая терапия является перспективным направлением в радиационной онкологии. Основными преимуществами протонной терапии является высвобождение большей части энергии протонов на конце их пути в пике Брэгга и прямолинейность траектории движения частиц в тканях человека [1]. Это выгодно отличает подход от фотонной лучевой терапии, в которой максимум радиоактивной дозы поглощается в начале пути в ткани. Бинарные подходы к протонной терапии с использованием наночастиц в качестве сенсибилизаторов способны повысить токсические эффекты за счет физических эффектов усиления дозы, а также биологических эффектов образования активных форм кислорода и радикалов [2, 3]. В частности, было показано, что облучение протонами наночастиц из элементов с высоким атомным номером (Z), таких как Au и Pt, вызывает высвобождение вторичных и оже-электронов и образование гидроксил-радикалов в растворе [4]. С другой стороны, даже легкие элементы, такие как бор [5] и титан [6], были способны усилить протонную терапию за счет каталитических процессов, происходящих на поверхности частиц.

Тем не менее, доставка наночастиц в опухолевую ткань перед лучевой терапией является самостоятельной сложной задачей. Активно делящиеся опухолевые клетки локализованы в большинстве случаев на периферии опухоли, а также рядом с кровеносными сосудами. В силу этого, внутриопухолевое введение частиц оказывается малоэффективным, так как их диффузия ограничена связыванием с межклеточным матриксом [7]. При использовании внутривенного введения требуется наличие нацеливающих векторов, способных селективно распознавать периферию опухолевой ткани и при связывании долговременно задерживать наночастицы в ткани-мишени [8]. Современные работы по созданию нацеленных частиц для протонной терапии ограничены in vitro уровнем [9, 10], хотя и демонстрируют высокую селективность осуществляемого воздействия.

Одной из перспективных мишеней для нацеливания является FRα изоформа фолатного рецептора. Данный белок представлен при большом количестве раковых заболеваний эпителиального происхождения, включая рак молочной железы, легких, почек и яичников [11] с уровнем экспрессии 1–10 миллионов белков на клетку, что в 100–300 раз выше, чем у здоровых тканей. В данной работе предложен фундаментальный подход к бинарной протонной терапии с использованием таргетных наночастиц золота, нацеленных на фолатный рецептор с использованием альбумина, конъюгированного с фолиевой кислотой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для демонстрации описанного подхода были получены наночастицы элементного золота методом импульсной лазерной абляции [12] в 1 мМ водного раствора NaCl. При облучении золотой мишени с помощью фемтосекундного Yb: KGW лазера (ТЕТА-10, длина волны 1030 нм, длительность импульса 270 фс, энергия импульса 50 мкДж, частота 200 кГц) образовывались наночастицы с размером менее 100 нм. Для in vitro и in vivo экспериментов наночастицы с размером менее 20 нм выделялись методом центрифугирования. В результате были получены сферические частицы с размером от 4 до 8 нм, что было подтверждено просвечивающей электронной микроскопией (рис. 1). Полученные наночастицы покрывались полиэтиленгликолем (5 кДа) c концевой тиольной группой за счет образования ковалентной Au-S связи [13], что обеспечивало им долговременную коллоидную стабильность в фосфатно-солевом буфере как минимум в течение 24 часов.

Рис. 1. Изображение наночастиц Au, полученное с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Для оценки возможности усиления протонной терапии с использованием полученных наночастиц цитотоксичность бинарного подхода была изучена на клетках карциномы молочной железы мыши (линия EMT6/P). Наночастицы золота вносились к клеткам и соинкубировались с ними в течение 16 часов, после чего производилось облучение клеток на комплексе протонной терапии “Прометеус” (Протвино, Россия). Энергия протонов в пучке составила 160.5 МэВ, и монослой клеток располагался в положении распределенного пика Брэгга. Гомогенность пучка составляла не менее 98% при уровне изодозы 95%. Оценка количества колоний с размером более 50 клеток через 8 дней после облучения показала существенное снижение клоногенной активности при бинарной терапии (рис. 2).

Рис. 2. Клоногенный анализ клеток аденокарциномы EMT6/P после облучения протонным пучком в присутствии наночастиц Au-PEG. * – p < 0.05, ** – p < 0.001, тест Стьюдента.

Важно отметить, что наночастицы Au-PEG в исследуемом диапазоне концентраций (от 10 до 50 мкг/мл) не вызывали снижение числа образовавшихся колоний клеток, что подтверждает их высокую биосовместимость. В то же время клетки демонстрировали дозозависимый ответ на облучение пучком протонов, что выражалось в снижении количества образующихся колоний на 25 и 50% для доз 2 и 4 Гр соответственно. Преинкубирование клеток с наночастицами Au-PEG в концентрации 50 мкг/мл с совместным облучением в дозе 2 Гр приводило к четырехкратному снижению числа колоний по сравнению с необлученной группой (рис. 2). Также преинкубирование клеток с наночастицами в концентрациях 25 мкг/мл и 50 мкг/мл и облучении в дозе 4 Гр приводило к полному исчезновению раковых колоний. Таким образом, наночастицы Au-PEG проявляли высокую биосовместимость и радиосенсибилизирующее действие при облучении пучком протонов в дозе 2–4 Гр in vitro.

Затем радиосенсибилизирующие свойства золота были исследованы in vivo. В качестве модели опухоли была выбрана солидная карцинома Эрлиха. Данные клетки гиперэкспрессируют фолатный рецептор альфа [14], поэтому существовала возможность осуществлять нацеливание внутривенно вводимых наночастиц с помощью таргетного модуля на основе фолиевой кислоты. Для демонстрации данного принципа нами были получены конъюгаты наночастиц Au-PEG с фолиевой кислотой, используя бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве промежуточного линкера (далее – Au-PEG-FA). Конъюгат с БСА получали методом карбодиимидной химии. Присоединение конъюгата к наночастицам было обусловлено образованием связи между SH-группами в альбумине и свободной поверхностью золотых НЧ. Эффективность прикрепления фолиевой кислоты к наночастицам было подтверждено UV–Vis оптической спектроскопией по интенсивности характерного пика поглощения фолиевой кислоты (363 нм) [15].

Клетки карциномы Эрлиха вводились самкам мышей F1 (CBA × C57BL6j) (возраст 8–10 недель, масса тела 22–24 г) подкожно в область латеральной поверхности правого бедра, и через 10 дней производилось облучение правого бедра протонным пучком с помощью комплекса «Прометеус», доза облучения составила 31 Гр. Для оценки бинарной терапии одной группе мышей за 24 часа до облучения вводили внутривенно в 0.2 мл PBS 20 мг наночастиц Au-PEG-FA с фолиевой кислотой на поверхности. Накопление наночастиц в опухолевом узле оценивали с помощью компьютерной томографии. Критерием наличия наночастиц в определенной области считали повышение рентгеноплотности по сравнению с нативными срезами (в мягкой ткани до введения наночастиц ~110–130 HU). После внутривенной инъекции наночастиц по данным КТ определялось негомогенное повышение рентгеноплотности ткани опухоли до ~210–240 HU в виде мелких множественных гиперденсивных включений, распределенных неравномерно по всему объему опухоли. Наиболее интенсивное контрастирование отмечалось в перитуморальной строме опухолевого узла, где ожидаемо находится наибольшее количество живых опухолевых клеток. Эти данные могут свидетельствовать об эффективности конъюгата с фолиевой кислотой в качестве опухолеспецифического вектора для солидной карциномы Эрлиха.

Динамику развития карциномы Эрлиха в экспериментальных группах оценивали морфометрически. Для этого через каждые 2–3 дня наблюдения проводили измерение линейных размеров опухолевых узлов у всех животных с помощью цифрового штангенциркуля ШЦЦ-1-125 (НПП ЧИЗ, РФ). Расчет объемов опухолевых узлов и индекса торможения роста опухоли (ТРО) на этапах наблюдения проводили по методике, ранее описанной в работе [16].

Использование наночастиц Au-PEG-FA в качестве радиосенсибилизатора при проведении протонной лучевой терапии значительно усиливало биологический ответ карциномы Эрлиха in vivo. При однократном локальном облучении протонами в дозе 31 Гр отмечалось выраженное торможение роста опухоли (ТРО = 55–60%). В то же время предварительное внутривенное введение наночастиц статистически значимо усиливало торможение роста опухоли на 15–25% на протяжении всего периода наблюдений, при этом показатель ТРО достигал 80% (рис. 3). При этом токсического (летального) действия протонной и бинарной терапии в опыте не наблюдалось.

Рис. 3. Показатели индекса торможения роста (ТРО) карциномы Эрлиха после воздействия протонами в дозе 31 Гр в присутствии и отсутствии наночастиц Au-PEG-FA. * – p < 0.05, тест Крускала–Уоллиса.

Эффект радиосенсибилизации также был подтвержден сравнительным анализом массы опухолевых узлов, выделенных на терминальном этапе опыта, где у мышей после бинарной терапии наблюдалась 2.2-кратно меньшая масса опухоли в сравнении с мышами без терапии и в 1.25 раз меньшая, чем у мышей, получавших только протонную терапию. В данном исследовании была проведена эвтаназия всех животных для терминального макроскопического исследования опухолевых узлов.

Таким образом, в данном исследовании мы показали перспективность использования адресных наночастиц золота, нацеленных на фолатный рецептор опухоли, в качестве сенсибилизаторов протонной терапии. Наночастицы вызывали полное ингибирование клоногенной активности аденокарциномы EMT6/P in vitro при концентрациях выше 25 мкг/мл и радиодозе 4 Гр. Также, предварительные результаты терапии показали существенное дополнительное замедление роста опухоли при бинарном воздействии наночастиц и протонов. Бинарная терапия с использованием адресных наночастиц золота требует дальнейшего изучения для определения токсичности подхода, детального определения биораспределения частиц и долговременных эффектов лечения опухолей.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа была поддержана грантом Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, № 075-15-2021-1347.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Протоколы с использованием животных были одобрены Комиссией по биоэтическому контролю за содержанием и использованием лабораторных животных в научных целях ФГБУ “НМИЦ радиологии” Минздрава России (номер заявки 1-Н-00053 от 12.09.2023).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

M. V. Filimonova

National Medical Research Radiological Centre of the Ministry of Health of the Russian Federation; National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute)

Email: d.petrunya@lebedev.ru

A. Tsyb Medical Radiological Research Centre, Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering

Russian Federation, Obninsk; Obninsk

D. D. Kolmanovich

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences; P.N. Lebedev Physical Institute of the Russian Academy of Sciences

Email: d.petrunya@lebedev.ru
Russian Federation, Pushchino; Moscow

G. V. Tikhonowski

National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute)

Email: d.petrunya@lebedev.ru
Russian Federation, Moscow

D. S. Petrunya

P.N. Lebedev Physical Institute of the Russian Academy of Sciences; National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute)

National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute)

Email: d.petrunya@lebedev.ru
Russian Federation, Moscow

M. S. Savinov

National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute)

Email: d.petrunya@lebedev.ru
Russian Federation, Moscow

A. L. Popov

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences; P.N. Lebedev Physical Institute of the Russian Academy of Sciences

Email: d.petrunya@lebedev.ru
Russian Federation, Pushchino; Moscow

I. V. Zelepukin

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: d.petrunya@lebedev.ru
Russian Federation, Moscow

A. A. Lipengolts

National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute); Institution N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: d.petrunya@lebedev.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow

K. E. Shpakova

Email: d.petrunya@lebedev.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow

A. V. Kabashin

Aix-Marseille University

Email: d.petrunya@lebedev.ru
France, Marseille

S. N. Koryakin

National Medical Research Radiological Centre of the Ministry of Health of the Russian Federation; National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute)

Email: d.petrunya@lebedev.ru

A. Tsyb Medical Radiological Research Centre, Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering

Russian Federation, Obninsk; Obninsk

S. M. Deyev

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: d.petrunya@lebedev.ru

Academician of the RAS

Russian Federation, Moscow

I. N. Zavestovskaya

P.N. Lebedev Physical Institute of the Russian Academy of Sciences; National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute)

Email: d.petrunya@lebedev.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Durante M., Loeffler J.S. Charged Particles in Radiation Oncology // Nat. Rev. Clin. Oncol. 2010. V. 7(1). P. 37–43. https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2009.183
Lo C.Y., Tsai S.W., Niu H., et al. Gold-nanoparticles-enhanced Production of Reactive Oxygen Species in Cells at Spread-out Bragg Peak under Proton Beam Radiation // ACS Omega. 2023. V. 8(20). P. 17922–17931.
Martínez‐Rovira I., Prezado Y. Evaluation of the Local Dose Enhancement in the Combination of Proton Therapy and Nanoparticles // Med. Phys. 2015. V. 42(11). P. 6703–6710.
Zwiehoff S., Johny J., Behrends C., et al. Enhancement of Proton Therapy Efficiency by Noble Metal Nanoparticles is Driven by the Number and Chemical Activity of Surface Atoms // Small. 2022. V. 18(9). P. e2106383.
Zavestovskaya I.N., Popov A.L., Kolmanovich D.D., et al. Boron Nanoparticle-enhanced Proton Therapy for Cancer Treatment // Nanomaterials (Basel). 2023. V. 13(15). P. 2167.
Gerken L.R.H., Gogos A., Starsich F.H.L., et al. Catalytic Activity Imperative for Nanoparticle Dose Enhancement in Photon and Proton Therapy // Nat. Commun. 2022. V. 13(1). 3248.
Zelepukin I.V., Griaznova O.Yu., Shevchenko K.G., et al. Flash Drug Release from Nanoparticles Accumulated in the Targeted Blood Vessels facilitates the Tumour Treatment // Nat. Commun. 2022. V. 13(1). 6910.
Tolmachev V.M., Chernov V.I., Deyev S.M. Targeted Nuclear Medicine. Seek and Destroy // Russ. Chem. Rev. 2022. V. 91(3). RCR5034.
Li S., Bouchy S., Penninckx S., Marega R., et al. Antibody-functionalized Gold Nanoparticles as Tumor Targeting Radiosensitizers for Proton Therapy // Nanomedicine. 2019. V. 14(3). P. 317–333.
Kang S.H., Hong S.P., Kang B.S. Targeting Chemo-proton Therapy on C6 Cell Line Using Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugated with Folate and Paclitaxel // International Journal of Radiation Biology. 2018. V. 94(11). P. 1006–1016.
Siwowska K., Haller S., Bortoli F., et al. Preclinical Comparison of Albumin-binding Radiofolates: Impact of Linker Entities on the in Vitro and in Vivo Properties // Mol. Pharm. 2017. V. 14(2). P. 523–532.
Popov A.A., Swiatkowska-Warkocka Z., Marszalek M., et al. Laser-ablative Synthesis of Ultrapure Magneto-plasmonic Core-satellite Nanocomposites for Biomedical Applications // Nanomaterials (Basel). 2022. V. 12(4). 649.
Gao J., Huang X., Liu H., Zan F., Ren J. Colloidal Stability of Gold Nanoparticles Modified with Thiol Compounds: Bioconjugation and Application in Cancer Cell Imaging // Langmuir. 2012. V. 28(9). P. 4464–4471.
R S., M Joseph M., Sen A., K R.P., Bs U., Tt S. Galactomannan Armed Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles as a Folate Receptor Targeted Multi-functional Theranostic Agent in the Management of Cancer // Int. J. Biol. Macromol. 2022. V. 219. P. 740–753.
Baibarac M., Smaranda I., Nila A., Serbschi C. Optical Properties of Folic Acid in Phosphate Buffer Solutions: The Influence of pH and UV Irradiation on the UV–VIS Absorption Spectra and Photoluminescence // Sci. Rep. 2019. V. 9(1). 14278.
Filimonova M., Shitova A., Soldatova O., et al. Combination of NOS- and PDK-Inhibitory Activity: Possible Way to Enhance Antitumor Effects // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. 730.

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Transmission electron microscopy image of Au nanoparticles.

Download (318KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Clonogenic analysis of EMT6/P adenocarcinoma cells after proton beam irradiation in the presence of Au-PEG nanoparticles. * – p < 0.05, ** – p < 0.001, Student’s t-test.

Download (255KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Growth inhibition index (GI) values of Ehrlich carcinoma after proton irradiation at a dose of 31 Gy in the presence and absence of Au-PEG-FA nanoparticles. * – p < 0.05, Kruskal–Wallis test.

Download (112KB)

Indexing metadata

Username
Password
Remember me

Forgot password?	Register

Username
Password
Remember me

Forgot password?	Register