Aberrant repair of 8-oxoguanine in short DNA bulges

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The presence of DNA damage can increase the likelihood of DNA replication errors and promote mutations. In particular, pauses of DNA polymerase at the site of damage can lead to polymerase slippage and the formation of 1–2 nucleotide bulges. Repair of such structures using an undamaged DNA template leads to small deletions. One of the most abundant oxidative DNA lesions, 8-oxoguanine (oxoG), has been shown to induce small deletions but the mechanism of this phenomenon is currently unknown. We have studied the aberrant repair of oxoG, located in one- and two-nucleotide bulges, by the Escherichia coli and human base excision repair systems. Our results indicate that the repair in such substrates can serve as a mechanism for fixing small deletions in bacteria but not in humans.

Full Text

Ошибки ДНК-полимераз во время репликации могут приводить к образованию коротких выпетливаний длиной 1–2 нуклеотида в матричной или дочерней цепи ДНК. Неспаренные основания в них могут принимать как внутри-, так и внеспиральную конформацию [1–3] в зависимости от условий и нуклеотидного окружения. Такие структуры инициируют мутации со сдвигом рамки считывания – микроинсерции и микроделеции. Основной путь образования коротких выпетливаний – это проскальзывание ДНК-полимераз, что зачастую вызвано временными остановками фермента при наличии в ДНК повреждений [4]. Если ДНК-полимераза, сделав паузу в месте повреждения, включает dNMP, комплементарный первому или второму следующему по ходу нуклеотиду матрицы, возникает выпетливание. Если впоследствии оно удаляется системами репарации ДНК, происходит микроделеция (рис. 1а). Подобные события «аберрантной репарации», закрепляющие мутации, вносят заметный вклад в общую геномную нестабильность [5].

В число самых распространенных повреждений ДНК входит 8-оксогуанин (oxoG, рис. 1б) [6]. Он представляет собой предмутагенное повреждение, поскольку при репликации способен образовывать хугстеновскую пару oxoG:A. Однако спектр мутаций, вызванных oxoG, этим не ограничивается; среди продуктов репликации в клетках E. coli и человека наблюдается заметное число микроделеций в месте oxoG, что говорит об образовании выпетливаний при попытке ДНК-полимераз пройти повреждение [7–9].

 

Рис. 1. Схема образования микроделеций при проскальзывании ДНК-полимеразы (а); схема строения использованных в работе ДНК-субстратов (б); графики зависимости начальной скорости реакции от исходной концентрации субстрата [S] для фермента Fpg (4.2 нМ) (условия реакции: 25 мМ Трис–HCl pH 7.5, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 37 °C) (в); кинетические кривые расщепления субстратов ферментом OGG1 в том же буфере при [E]0 = 5 мкМ, [S]0 = 20 нМ (г) и [E]0 = 10 нМ, [S]0 = 100 нМ (д). Для субстратов X.2.1 и X.2.2 расщепления в (д) не наблюдалось. После реакции с OGG1 смеси прогревали со 100 мМ NaOH (5 мин, 95°C). Во всех случаях продукты реакции разделяли электрофорезом в 20%-ном полиакриламидном геле в присутствии 7 М мочевины и анализировали с помощью установки радиолюминесцентного сканирования Typhoon 9500 (GE Healthcare). На графиках приведены средние значения и стандартные отклонения по трем независимым экспериментам.

 

OxoG удаляется из ДНК по пути эксцизионной репарации оснований, который инициируется ДНК-гликозилазами Fpg (у бактерий) и OGG1 (у эукариот). Эти ферменты негомологичны и имеют совершенно разную третичную структуру. Тем не менее их субстратная специфичность практически идентична: оба они гидролизуют N-гликозидную связь oxoG в парах oxoG:C. Далее продукт реакции подвергается последовательно действию апурин-апиримидиновой эндонуклеазы (Xth или Nfo у E. coli, APE1 у человека), ДНК-полимеразы (ДНК-полимераза I у E. coli, ДНК-полимераза β у человека) и ДНК-лигазы, что восстанавливает целостность ДНК.

Несмотря на то что репарация oxoG изучена достаточно подробно, до сих пор практически не затрагивалась проблема его удаления из неканонических структур ДНК, в частности выпетливаний, что важно для понимания механизмов индукции микроделеций этим поврежденным основанием. В настоящей работе изучено удаление oxoG из выпетливаний ферментами Fpg и OGG1. Исследуемые субстраты представляют собой олигодезоксирибонуклеотидные дуплексы, в которых напротив oxoG расположен C или oxoG находится в составе одно- или двухнуклеотидного выпетливания; в последнем случае повреждение располагается в первой или второй позиции внеспирального участка (рис. 1б). Выпетливания снижали стабильность дуплекса, однако температура плавления всех субстратов оставалась заметно выше 37 °C (табл. 1; Tпл измеряли, регистрируя поглощение при 260 нм при помощи спектрофотометра Cary 300-Bio Melt, снабженного термостатным блоком). Цепь, содержащая oxoG, была помечена по 5′-концу 32P для экспериментов по связыванию и расщеплению ДНК-субстратов или флуорофором Cy3 для экспериментов по реконструкции репарации. Белки Fpg E. coli, OGG1, APE1 и ДНК-полимеразу β человека выделяли по описанным методикам [10–13].

 

Таблица 1. Кинетические и термодинамические параметры реакций расщепления ДНК-субстратов ферментами Fpg и OGG1

Субстрат

Tпл, °C

Фермент

Fpg

OGG1

KM, нМ

kcat, мин−1

kcat/KM, нМ−1 мин−1, ×102

Kd, нМ

k2, мин−1

k3, мин−1, ×104

Kd, нМ

X.0

70.7

35 ± 7

14 ± 1

41 ± 10

7.3 ± 1.6

22 ± 2

210 ± 60

94 ± 29

X.1

60.7

23 ± 8

11 ± 1

49 ± 22

6.7 ± 2.2

0.27 ± 0.03

–

54 ± 16

X.2.1

59.9

190 ± 50

4.3 ± 0.4

2.2 ± 0.7

24 ± 10

0.22 ± 0.09

–

420 ± 110

X.2.2

55.6

96 ± 32

2.6 ± 0.5

2.7 ± 1.5

11 ± 4

0.61 ± 0.12

–

230 ± 70

 

Кинетику реакции, катализируемой ферментом Fpg, можно описать стандартной схемой Михаэлиса – Ментен [14]. На рис. 1в приведены графики, отражающие расщепление исследованных субстратов ферментом Fpg. Зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата носила ожидаемый гиперболический характер. Полученные для разных субстратов значения константы Михаэлиса KM и каталитической константы kcat сведены в табл. 1. Как видно, для субстрата X.1, в котором oxoG находится в однонуклеотидном выпетливании, кинетика реакции не отличается от таковой для стандартной пары oxoG:C. Известно, что при узнавании oxoG фермент Fpg выворачивает его из спирали ДНК в свой активный центр, и вполне вероятно, что однонуклеотидное выпетливание может имитировать структуру ДНК в этом комплексе. Оба субстрата с двухнуклеотидным выпетливанием, X.2.1 и X.2.2, показывали повышение KM и снижение kcat в несколько раз, вследствие чего показатель специфичности kcat/KM был для них примерно в 20 раз ниже, чем для субстратов X.0 и X.1 (см. табл. 1). Очевидно, в этих случаях даже при внеспиральной локализации oxoG правильное размещение его в активном центре затруднено. Для всех изученных субстратов количество продукта не менялось при остановке реакции 0.1 М NaOH, который вызывает разрыв ДНК по АП-сайтам. Это свидетельствует о том, что снижение активности фермента Fpg по отношению к субстратам X.2.1 и X.2.2 происходит именно на уровне гидролиза N-гликозидной связи, а не последующих стадий реакции.

В отличие от Fpg, для фермента OGG1 скорость реакции лимитируется стадией высвобождения продукта [15], поэтому для канонического субстрата (oxoG:C) возможно отдельно измерить константу каталитической стадии (k2) и константу скорости высвобождения продукта (k3) в условиях кинетики одного оборота ([E]0 >> [S]0) и кинетики фазы всплеска ([E]0 << [S]0) соответственно. Даже в случае однонуклеотидного выпетливания каталитическая константа OGG1 была на 1.5–2.0 порядка ниже, чем для канонического субстрата (см. рис. 1г, табл. 1).

Такое снижение приводило к тому, что стадия высвобождения продукта переставала быть скоростьлимитирующей, на графике накопления продукта со временем отсутствовала характерная фаза всплеска (см. рис. 1д), и определить константу скорости высвобождения продукта было невозможно (см. табл. 1). Таким образом, OGG1 неэффективно использует oxoG в составе одно- и двухнуклеотидных выпетливаний как субстрат. Разница с ферментом Fpg, по-видимому, объясняется разницей в общей пространственной структуре и в архитектуре активного центра этих белков, которые принадлежат к разным структурным суперсемействам. Так, активный центр OGG1 более тесный по сравнению с активным центром Fpg; кроме того, оба белка по-разному взаимодействуют с фосфатами, окружающими поврежденный нуклеозид, для его выворачивания из ДНК [16, 17].

Для анализа связывания Fpg и OGG1 с субстратной ДНК без ее расщепления методом сайт-направленного мутагенеза получили их каталитически неактивные варианты Fpg E2Q и OGG1 K249Q [16, 18]. Белки выделяли по тем же схемам, что и белки дикого типа. Связывание определяли по изменению подвижности комплекса в неденатурирующем геле; результаты эксперимента приведены в табл. 1. Образование выпетливаний лишь умеренно влияло на сродство обоих белков к ДНК: максимальное повышение Kd наблюдалось для субстрата X2.1 и составляло 3.3 раза для Fpg и 4.5 раз для OGG1. Интересно, что для субстрата X.1 сродство к ДНК-гликозилазам оставалось неизменным или даже несколько повышалось, что, возможно, отражает лучшее связывание ДНК с внеспиральным поврежденным нуклеотидом. Таким образом, ухудшение связывания ДНК не может полностью объяснить снижение активности Fpg и OGG1 на 1.5–2.0 порядка при наличии выпетливаний в ДНК.

Дальнейшие шаги репарации после действия ДНК-гликозилаз изучали при помощи реконструкции цикла репарации из очищенных рекомбинантных белков: Fpg, эндонуклеазы IV (Nfo) и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (дефицитного по 3′→5′-экзонуклеазной активности) для системы E. coli и OGG1, АП-эндонуклеазы APE1 и ДНК-полимеразы β для системы человека. Эффективность образования лигируемого разрыва оценивали с использованием ДНК-лигазы бактериофага T4. При наличии oxoG в дцДНК действие Fpg приводит к образованию 3′-концевого фосфата, который затем удаляется Nfo, вызывая снижение электрофоретической подвижности продукта из-за уменьшения общего заряда олигонуклеотидного фрагмента (рис. 2а, дорожки 1–3). ДНК-полимераза затем ведет синтез с вытеснением цепи (см. рис. 2а, дорожка 4) либо при наличии только dGTP в реакционной смеси включает его с образованием лигируемого разрыва (рис. 2, дорожка 14). Аналогичная картина наблюдалась и для субстрата X.1 с некоторым снижением эффективности всех стадий относительно дцДНК (см. рис. 2б). Однако субстраты X2.1 и X2.2 вели себя по-разному: в первом случае цикл репарации проходил до конца с еще более низкой эффективностью, чем для X.0 и X.1, а во втором ДНК-полимеразная реакция не протекала, и продукт имел ту же подвижность, что и после АП-эндонуклеазной реакции (см. рис. 2в, г). В системе репарации человека фермент OGG1 оставляет на 3′-конце α,β-ненасыщенный альдегид, который удаляется АП-эндонуклеазой APE1, однако подвижности продуктов при этом мало отличаются (рис. 2а, дорожки 7, 8, 17, 18). При этом в присутствии APE1 количество расщепленной ДНК возрастает, поскольку собственная АП-лиазная активность фермента OGG1 невысока по сравнению с его ДНК-гликозилазной активностью. В то время как oxoG в составе дцДНК полностью репарировался в системе, реконструированной из ферментов человека, АП-эндонуклеазная реакция проходила только в случае субстрата X.1, а образования разрывов с лигируемыми концами на субстратах с выпетливаниями практически не наблюдалось.

 

Рис. 2. Репрезентативные флуоресцентные снимки после электрофоретического разделения в денатурирующем 20%-ном полиакриламидном геле продуктов реакции в реконструированной системе репарации субстратов X.0 (а), X.1 (б), X.2.1 (в) и X.2.2 (г). Условия реакции: 50 мМ Трис–HCl (pH 7.5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ ATP, 25 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 50 нМ ДНК-субстрат, 0.5 ед. акт./мкл ДНК-лигазы, 200 нМ прочие ферменты, 250 мкМ dNTP, 30 мин при 37 °C. Структуры расщепляемой цепи ДНК и интермедиатов репарации обозначены римскими цифрами: (i) исходная поврежденная цепь ДНК, (iia) продукт расщепления ферментом Fpg, (iib) продукт расщепления ферментом OGG1, (iii) продукт расщепления АП-эндонуклеазами, (iv) продукт включения одного нуклеотида ДНК-полимеразами. X – oxoG, Y – C или T, B – C, G или T, звездочка обозначает 5′-концевую флуоресцентную метку (Cy3).

 

Таким образом, в работе показано, что репарация oxoG, находящегося в выпетливаниях длиной 1–2 нуклеотида, может служить механизмом фиксации микроделеций в ДНК E. coli и, вероятно, других бактерий. Однако система эксцизионной репарации оснований человека неэффективно узнает и процессирует подобные субстраты, и в клетках человека такой механизм маловероятен.

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

Секвенирование ДНК выполнялось сотрудниками Центра коллективного пользования «Геномика» СО РАН. Белок Nfo был любезно предоставлен А.А. Ищенко (Университет Париж-Саклэ, Франция).

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований 21-54-12025 ННИО_а.

Соблюдение этических норм и стандартов

Соблюдение этических стандартов: в данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

×

About the authors

D. A. Eroshenko

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS; Novosibirsk State University

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

E. A. Diatlova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Russian Federation, Novosibirsk

V. M. Golyshev

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Russian Federation, Novosibirsk

A. V. Endutkin

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Russian Federation, Novosibirsk

D. O. Zharkov

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS; Novosibirsk State University

Author for correspondence.
Email: dzharkov@niboch.nsc.ru

Corresponding Member

Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

References

  1. Joshua-Tor L., Frolow F., Appella E., et al. // J. Mol. Biol. 1992. V. 225. № 2. P. 397–431.
  2. Jiao Y., Stringfellow S., Yu H. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2002. V. 19. № 5. P. 929–934.
  3. Shi X., Beauchamp K.A., Harbury P.ЙB., Herschlag D. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 2014. V. 111. № 15. P. E1473–E1480.
  4. Kunkel T.A., Bebenek K. // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. P. 497–529.
  5. Talhaoui I., Matkarimov B.T., Tchenio T., et al. // Free Radic. Biol. Med. 2017. V. 107. P. 266–277.
  6. Fleming A.M., Burrows C.J. // DNA Repair. 2017. V. 56. P. 75–83.
  7. Moriya M., Ou C., Bodepudi V., et al. // Mutat. Res. 1991. V. 254. № 3. P. 281–288.
  8. Markkanen E., Castrec B., Villani G., Hübscher U. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 2012. V. 109. № 50. P. 20401–20406.
  9. Pande P., Haraguchi K., Jiang Y.-L., et al. // Biochemistry. 2015. V. 54. № 10. P. 1859–1862.
  10. Gilboa R., Zharkov D.O., Golan G., et al. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 22. P. 19811–19816.
  11. Kuznetsov N.A., Koval V. V., Zharkov D.O., et al. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 12. P. 3919–3931.
  12. Sidorenko V.S., Nevinsky G.A., Zharkov D. O. // DNA Repair. 2007. V. 6. № 3. P. 317–328.
  13. Endutkin A.V., Yudkina A.V ., Zharkov T.D., et al. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. № 21. 13353.
  14. Tchou J., Bodepudi V., Shibutani S., et al. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. № 21. P. 15318–15324.
  15. Zharkov D.O., Rosenquist T.A., Gerchman S.E., Grollman A. P. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 37. P. 28607–28617.
  16. Bruner S.D., Norman D.P.G., Verdine G.L. // Nature. 2000. V. 403. № 6772. P. 859–866.
  17. Fromme J.C., Verdine G.L. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 51. P. 51543–51548.
  18. Lavrukhin O.V., Lloyd R.S. // Biochemistry. 2000. V. 39. № 49. P. 15266–15271.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Scheme of the formation of microdeletions during DNA polymerase slippage (a); diagram of the structure of the DNA substrates used in the work (b); graphs of the dependence of the initial reaction rate on the initial substrate concentration [S] for the enzyme Fpg (4.2 nM) (reaction conditions: 25 mM Tris–HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 37 °C) (c) ; kinetic curves of substrate cleavage by the OGG1 enzyme in the same buffer at [E]0 = 5 µM, [S]0 = 20 nM (d) and [E]0 = 10 nM, [S]0 = 100 nM (d). For substrates X.2.1 and X.2.2, the splitting in (e) is not observed. After reaction with OGG1, the mixtures were heated with 100 mM NaOH (5 min, 95°C). In all cases, reaction products were separated by electrophoresis on a 20% polyacrylamide gel in the presence of 7 M urea and analyzed using a Typhoon 9500 radioluminescence scanning unit (GE Healthcare). The graphs show the means and standard deviations from three independent experiments.

Download (209KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Representative fluorescent images after electrophoretic separation in a denaturing 20% polyacrylamide gel of reaction products in the reconstructed system for the repair of substrates X.0 (a), X.1 (b), X.2.1 (c) and X.2.2 (d) . Reaction conditions: 50 mM Tris–HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml bovine serum albumin, 50 nM DNA substrate, 0.5 units. act./μl DNA ligase, 200 nM other enzymes, 250 μM dNTP, 30 min at 37 °C. The structures of the cleaved DNA strand and repair intermediates are indicated in Roman numerals: (i) the original damaged DNA strand, (iia) the product of cleavage by the Fpg enzyme, (iib) the product of cleavage by the OGG1 enzyme, (iii) the product of cleavage by AP endonucleases, (iv) the product of the incorporation of a single nucleotide by DNA polymerases. X – oxoG, Y – C or T, B – C, G or T, asterisk indicates 5′-terminal fluorescent tag (Cy3).

Download (301KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».