Optical photoluminescent properties of plant seeds when infected with mycopathogens

Mikhail V. Belyakov; Беляков Михаил Владимирович; Maksim N. Moskovskiy; Московский Максим Николаевич; Igor Yu. Efremenkov; Ефременков Игорь Юрьевич; Vasiliy S. Novikov; Новиков Василий Сергеевич; Sergey M. Kuznetsov; Кузнецов Сергей Михайлович; Andrey A. Boyko; Бойко Андрей Александрович; Stanislav M. Mikhailichenko; Михайличенко Станислав Михайлович

doi:10.15507/2658-4123.034.202402.281-294

Оптические фотолюминесцентные свойства семян растений при заражении микопатогенами

Авторы: Беляков М.В.¹, Московский М.Н.¹, Ефременков И.Ю.¹, Новиков В.С.¹, Кузнецов С.М.¹, Бойко А.А.², Михайличенко С.М.³
Учреждения:
1. Федеральный научный агроинженерный центр ВИМ
2. Донской государственный технический университет
3. Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К. А. Тимирязева
Выпуск: Том 34, № 2 (2024)
Страницы: 281-294
Раздел: Приборы и методы экспериментальной физики
Статья получена: 31.08.2024
Статья одобрена: 31.08.2024
Статья опубликована: 28.06.2024
URL: https://journals.rcsi.science/2658-4123/article/view/262772
DOI: https://doi.org/10.15507/2658-4123.034.202402.281-294
ID: 262772

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. Использование оптического мониторинга качества зерна позволит значительно снизить потери урожая зерновых, вызванные заражением микопатогенами.

Цель исследования. Изучение зависимости спектральных характеристик, параметров возбуждения и люминесценции семян зерновых при заражении микопатогенами с целью определения информативных спектральных диапазонов и последующей разработки методики контроля зараженности.

Материалы и методы. Для исследования были использованы инокулированные семена пшеницы и ячменя ряда Fusarium graminearum и Alternaria alternata. Спектры возбуждения и регистрации люминесценции измерялись с помощью дифракционного спектрофлуориметра СМ 2203 в диапазоне 230–600 нм. Интегральные и статистические параметры спектров вычислялись в программе Microcal Origin.

Результаты исследования. Удалось выяснить, что при заражении микопатогенами уменьшается спектральная поглощательная способность семян. Для пшеницы интегральные параметры поглощения существенно снижаются при заражении альтернарией. В случае с ячменем, наоборот, большее снижение происходит при заражении фузариозом. В области 230–310 нм у зараженных семян появляются новые максимумы возбуждения. При возбуждении излучением с длиной волны λ = 284 нм спектральные и интегральные характеристики и параметры зараженных семян превышают аналогичные для незараженных. При возбуждении излучением 424 нм и 485 нм количество здоровых семян пшеницы и ячменя превышает количество зараженных.

Обсуждение и заключение. Изменения в спектрах возбуждения и фотолюминесценции могут быть объяснены замещением полисахаридов и белков при поглощении и модификации микокультур. Для объективного контроля заражения семян микопатогенами целесообразно использовать диапазон фотолюминесценции 290–310 нм при возбуждении излучением около 284 нм. Для различения заражения фузариозом и альтернариозом следует использовать контроль фотолюминесценции в диапазоне 380–410 нм.

Ключевые слова

семена, микопатогены, оптические спектры, фотолюминесценция, альтернариоз, фузариоз, Fusarium graminearum, Alternaria alternata

Полный текст

Введение. Повышения производительности труда в сельском хозяйстве, снижения энергетических и материальных затрат, обеспечения экологической безопасности возможно добиться путем создания и внедрения средств автоматизации, роботизации и цифровых технологий [1]. Одним из основных факторов, влияющих на потери урожая зерновых культур, являются болезни растений. Ежегодно во всем мире теряется 15–50 % зерновых из-за заражения микопатогенами. Кроме того, 25 % сельскохозяйственных культур, используемых в пищу людьми и животными, заражены микотоксинами [2]. Поэтому необходимы более эффективные и устойчивые технологии для лучшего контроля состояния сельскохозяйственных культур.

Фузариозная гниль, вызываемая грибковым патогеном рода Fusarium, – хроническое заболевание зерновых во многих регионах земледелия. Среди зерновых культур мягкая и твердая пшеница восприимчивы к виду Fusarium pseudograminearum. Ячмень считается более толерантной культурой и демонстрирует ограниченные потери урожая при заражении. Fusarium pseudograminearum также может инфицировать овес, что приводит лишь к незначительному развитию симптомов заболевания или их отсутствию.

Получение чистых спектров симптомов болезней растений имеет важное значение для повышения надежности методов их защиты. Характеристики и параметры фотолюминесценции, полученные из чистых спектров, можно использовать в качестве ценных обучающих данных для разработки алгоритмов, предназначенных для обнаружения болезней растений оптическими методами.

Цель исследования заключается в изучении зависимости спектральных характеристик, параметров возбуждения и люминесценции семян пшеницы и ячменя при заражении микопатогенами Fusarium graminearum и Alternaria alternata для определения информативных спектральных диапазонов и последующей разработки методики контроля зараженности.

Обзор литературы. В настоящее время для диагностики популяции грибов рода Fusarium разработан количественный анализ методом ПЦР с использованием зондов [3]. Также имеются данные о применении метода анализа междоузлий, выполняемого с использованием интактных цветущих растений пшеницы, для точной идентификации процесса инфицирования тканей пшеницы микопатогеном Fusarium graminearum [4]. В том числе исследована жидкостная хроматография (гибридная масс-спектрометрия) для широкого анализа метаболических профилей и идентификации метаболитов сопротивления связанного Fusarium колоса ячменя [5]. Гистопатологическую оценку инфекции возбудителем гнили Fusarium pseudograminearum в тканях проростков пшеницы можно проводить и с помощью флуоресцентной микроскопии [6].

Выявлено спектральное различение симптомов листовой ржавчины, вызываемых двумя особыми формами грибов. Puccinia recondite f. sp. tritici ‒ на пшенице и Puccinia recondita f. sp. recondite ‒ на листовой чешуе ржи. Спектральные измерения проводились на спектрометре FieldSpec 3 в диапазоне длин волн 350–2500 нм [7].

Исследования зарубежных авторов показали, что пестрота, пигментный состав или светоотражающие свойства изменяют фотофизическое поведение листьев [8]. Для расчета коэффициентов поглощения и рассеяния ими были получены спектры отражения и пропускания в УФ-видимой и ближней ИК-области.

Широкий интерес для современной науки представляет гиперспектральная визуализация. Она возникла из дистанционного зондирования и объединяет области машинного зрения и точечной спектроскопии, обеспечивая превосходную сегментацию изображения для обнаружения дефектов [9‒11]. Благодаря достижениям в области оборудования и анализа данных за последние два десятилетия технология гиперспектральной визуализации превратилась в мощный инструмент неразрушающего контроля [12‒15].

К настоящему времени недостаточно изучен потенциал фотолюминесцентных методов диагностики заболеваний растений фузариозом в ультрафиолетовом и видимом диапазонах. Так, для спектроскопического исследования E-Z фотоизомеризации нового циретренилацилгидразона спектры поглощения в ультрафиолетовом диапазоне регистрировались на диодном спектрофотометре Agilent Cary 8454 в диапазоне 250‒600 нм. Спектры излучения были измерены на спектрофотометре Horiba Jobin Yvon FluoroMax-4 [16]. Использовались методы оптического поглощения и флуоресценции, чтобы сделать выводы о том, как артепиллин C бразильского зеленого прополиса взаимодействует с амфифильными агрегатами. Спектры оптического поглощения представляли состояние протонирования, продиктованное локальным pH на поверхности мицелл и липидных пузырьков [17].

Также исследователи, применяя pH-зависимую УФ-видимую спектроскопию и моделирование спектрального разложения, изучают взаимодействие между соседними аминокислотами и билином в семействе фитохромов [18]. Флуорометрический метод позволяет оценивать концентрацию хлорофилла a, вносимого отдельными группами водорослей в реальном образце, путем подгонки его спектра возбуждения флуоресценции к линейной комбинации нормальных спектров соответствующих групп водорослей [19]. В том числе получены полезные данные для оптимизации послеуборочных фотохимических протоколов с помощью неразрушающего оптического датчика [20].

Для оценки растительных кормов применяются переносные оптические приборы [21‒23].

Таким образом, фотолюминесцентный метод, наряду с оптическим, активно применяется для исследования биологических объектов и может быть использован для диагностики заражения семян микопатогенами.

Материалы и методы. Для измерений авторами были взяты образцы пшеницы «тимирязевская 150» и ячменя «богатырь». Процесс заражения семян микопатогенами происходил следующим образом. Зерна пшеницы и ячменя были взвешены и расфасованы в пакеты по 7,0–7,5 г, а затем обеззаражены. Далее их поместили в стерильные стеклянные чашки Петри, к которым отдельными чистыми пипетками Пастера добавили по 3 мл раствора со спорами Fusarium graminearum и Alternaria alternata. Таким образом, зерна каждой культуры были заражены отдельно двумя разными патогенами. После проделанных действий чашки Петри были запечатаны парафилмом, упакованы в герметичные пакеты и помещены на хранение в термостат при температуре 28 °С.

Измерения спектров возбуждения и люминесценции проводились на спектрофлуориметре СМ 2203 фирмы «Солар». Сначала измерялись характеристики возбуждения η_e(λ) в диапазоне от 230–600 нм по ранее разработанной методике [24]. На основе полученных результатов были измерены спектры фотолюминесценции φ_l(λ). По полученным спектральным хактеристикам вычислена интегральная поглощательная способность Η (в относительных единицах – о. е.) по формуле:

$H =_{λ_{1}}^{λ_{2}} η_{e} (λ) d λ$ , (1)

где η_e(λ) – спектральная характеристика возбуждения, о. е./нм; λ₁, λ₂ – границы спектрального диапазона возбуждения, нм.

Интегральные параметры спектров φ_l(λ) – потоки фотолюминесценции Φ (в относительных единицах) определяли по формуле:

$Φ =_{λ_{1}}^{λ_{2}} φ_{l} (λ) d λ$ , (2)

где φ_l(λ) – спектральная характеристика фотолюминесценции, о. е./нм; λ₁, λ₂ – границы спектрального диапазона фотолюминесценции, нм.

Все измерения проводились в двадцатикратной повторности так, чтобы погрешность определения интегральных параметров Η и Φ не превышала 10 % при доверительной вероятности 0,9. Кроме того, в программе Microcal Origin были рассчитаны статистические параметры спектров: математическое ожидание M_λ, дисперсия σ², асимметрия A_S и эксцесс E_X.

Результаты исследования. Спектральные характеристики возбуждения пшеницы, полученные при синхронном сканировании, представлены на рисунке 1, а интегральные параметры спектров, рассчитанные по формуле (1), – в таблице 1.

Р и с. 1. Спектральные характеристики возбуждения пшеницы: 1 – здоровой; 2 – зараженной Fusarium graminearum; 3 – зараженной Alternaria alternata

F i g. 1. Spectral characteristics of wheat excitation: 1 – disease-free; 2 – infected with Fusarium graminearum; 3 – infected with Alternaria alternata

Источник: здесь и далее в статье все рисунки составлены авторами.

Source: Hereinafter in this article all figures were drawn up by the authors.

Т а б л и ц а 1. Интегральные параметры спектров возбуждения пшеницы

T a b l e 1. Integral Parameters of Wheat Excitation Spectra

Вид семян / Type of seed	H, о. е. (для спектрального диапазона, нм) / H, r. u. (for the spectral range, nm)
Вид семян / Type of seed	230–310	310–380	380–470	470–540
Здоровые / Disease-free	0,29	3,17	9,06	1,72
Зараженные Fusarium graminearum / Infected with Fusarium graminearum	0,79	1,22	5,82	0,77
Зараженные Alternaria alternata / Infected with Alternaria alternata	0,92	1,09	3,06	0,64

Источник: здесь и далее в статье все таблицы составлены авторами.

Source: Hereinafter in this article all tables were drawn up by the authors.

На рисунках 2 и 3 отображены спектры фотолюминесценции пшеницы при возбуждении излучением 284 нм и 424 нм соответственно.

Интегральные параметры спектров фотолюминесценции пшеницы, рассчитанные по формуле (2), представлены в таблице 2.

Спектральные характеристики возбуждения ячменя, полученные при синхронном сканировании, показаны на рисунке 4, а интегральные параметры спектров – в таблице 3.

На рисунках 5 и 6 представлены спектры фотолюминесценции ячменя при возбуждении излучением 284 нм и 424 нм соответственно.

Р и с. 2. Спектральные характеристики люминесценции пшеницы при λ_в= 284 нм: 1 – здоровой; 2 – зараженной Fusarium graminearum; 3 – зараженной Alternaria alternata

F i g. 2. Spectral characteristics of wheat luminescence at λ_e = 284 nm: 1 – disease-free; 2 – infected with Fusarium graminearum; 3 – infected with Alternaria alternate

Р и с. 3. Спектральные характеристики люминесценции пшеницы при λ_в= 424 нм: 1 – здоровой; 2 – зараженной Fusarium graminearum; 3 – зараженной Alternaria alternata

F i g. 3. Spectral characteristics of wheat luminescence at λ_e = 424 nm: 1 – disease-free; 2 – infected with Fusarium graminearum; 3 – infected with Alternaria alternata

Т а б л и ц а 2. Интегральные параметры спектров люминесценции пшеницы

T a b l e 2. Integral Parameters of Wheat Luminescence Spectra

Вид семян / Type of seed	Ф₂₈₄, о. е. / Ф₂₈₄, r. u.	Ф₃₆₂, о. е. / Ф₃₆₂, r. u.	Ф₄₂₄, о. е. / Ф₄₂₄, r. u.	Ф₄₈₅, о. е. / Ф₄₈₅, r. u.
Disease-free / Healthy	0,61	33	43	18
Зараженные Fusarium graminearum / Infected with Fusarium graminearum	3,06	72	30	10
Зараженные Alternaria alternata / Infected with Alternaria alternata	2,19	66	19	9

Р и с. 4. Спектральные характеристики возбуждения ячменя: 1 – здорового; 2 – зараженного Fusarium graminearum; 3 – зараженного Alternaria alternata

F i g. 4. Spectral characteristics of barley excitation: 1 – disease-free; 2 – infected with Fusarium graminearum; 3 – infected with Alternaria alternata

Т а б л и ц а 3. Интегральные параметры спектров возбуждения ячменя

T a b l e 3. Integral Parameters of the Excitation Spectra of Barley

Вид семян / Type of seed	H, о. е. (для спектрального диапазона, нм) / H, r. u. (for the spectral range, nm)
Вид семян / Type of seed	230–310	310–380	380–470	470–540
Disease-free / Healthy	0,17	1,04	17,44	4,80
Зараженные Fusarium graminearum / Infected with Fusarium graminearum	0,80	1,00	2,10	0,53
Зараженные Alternaria alternata / Infected with Alternaria alternata	0,92	1,31	10,49	2,76

Р и с. 5. Спектральные характеристики люминесценции ячменя при λ_в= 284 нм: 1 – здорового; 2 – зараженного Fusarium graminearum; 3 – зараженного Alternaria alternata

F i g. 5. Spectral characteristics of the luminescence of barley at λ_e = 284 nm: 1 – disease-free; 2 – infected with Fusarium graminearum; 3 – infected with Alternaria alternate

Р и с. 6. Спектральные характеристики люминесценции ячменя при λ_в= 424 нм: 1 – здорового; 2 – зараженного Fusarium graminearum; 3 – зараженного Alternaria alternata

F i g. 6 Spectral characteristics of the luminescence of barley at λ_в = 424 nm: 1 – disease-free; 2 – infected with Fusarium graminearum; 3 – infected with Alternaria alternate

Интегральные параметры спектров фотолюминесценции ячменя показаны далее в таблице 4.

Т а б л и ц а 4. Интегральные параметры спектров люминесценции ячменя

T a b l e 4. Integral Parameters of Barley Luminescence Spectra

Вид семян / Type of seed	Ф₂₈₄, о. е. / Ф₂₈₄, r. u.	Ф₃₆₂, о. е. / Ф₃₆₂, r. u.	Ф₄₂₄, о. е. / Ф₄₂₄, r. u.	Ф₄₈₅, о. е. / Ф₄₈₅, r. u.
Здоровые / Disease-free	0,36	34	89	59
Зараженные Fusarium graminearum / Infected with Fusarium graminearum	1,80	143	14	8
Зараженные Alternaria alternata / Infected with Alternaria alternata	2,39	54	57	34

В таблице 5 представлены статистические параметры спектров возбуждения пшеницы и ячменя.

Т а б л и ц а 5. Статистические параметры спектров возбуждения пшеницы и ячменя

T a b l e 5. Statistical Parameters of the Excitation Spectra of Wheat and Barley

Вид семян / Type of seed	M_λ, нм / M_λ, nm	σ²	A_S	E_X
1	2	3	4	5
Пшеница здоровая / Disease-free wheat	417	2 897	0,34	6,99·10⁵
Пшеница зараженная Fusarium graminearum / Wheat infected with Fusarium graminearum	411	4 245	–0,13	2,89·10⁵
Пшеница зараженная Alternaria alternata / Wheat infected with Alternaria alternata	401	5 724	–0,11	2,52·10⁵
Ячмень здоровый / Disease-free barley	445	2 379	0,41	1,30·10⁶
Ячмень зараженный Fusarium graminearum / Barley infected with Fusarium graminearum	433	4 263	–0,18	3,36·10⁵
Ячмень зараженный Alternaria alternata / Barley infected with Alternaria alternata	397	6 174	0,07	2,29·10⁵

Обсуждение и заключение. Из рисунков 1 и 4 видна общая тенденция уменьшения спектральной поглощательной способности η при заражении микопатогенами. Однако для пшеницы заражение альтернарией существенно больше снижает поглощающие характеристики и параметры, примерно в 3 раза для Η_380–470 (табл. 1), а для ячменя, наоборот, большее снижение происходит при заражении фузариозом (в 3,8 раза для Η_380–470). В длинноволновой области все спектры сохраняют подобие, а в области 230–310 нм у зараженных семян появляются новые максимумы возбуждения. У пшеницы интегральный параметр Η_230–310в 2,7–3,2 раза для зараженных семян превышает аналогичный для незараженных, а для ячменя такое превышение составляет 4,7–5,4 раза.

Появление подобных пиков было отмечено исследователями ранее [24], но в более коротковолновой области (около 232 нм), что может быть связано со временем заражения растений с привязкой к фазе созревания семян. Это подтверждает исследование, где отмечалось относительное увеличение доли коротковолнового возбуждения у незрелых семян [25].

Подобная тенденция сохраняется и для спектров фотолюминесценции. При возбуждении излучением с длиной волны λ = 284 нм спектральные и интегральные характеристики и параметры зараженных семян превышают аналогичные для незараженных. Для пшеницы наибольший поток фотолюминесценции отмечается у семян, пораженных фузариозом, а для семян ячменя – альтернариозом (табл. 2, 4). При возбуждении длинноволновым излучением (λ = 424 нм и λ = 485 нм) потоки здоровых семян как пшеницы, так и ячменя превышают потоки зараженных (табл. 2, 4).

Из-за наличия максимумов в коротковолновой области (рис. 1, 4) математическое ожидание для зараженных семян уменьшается, особенно для ячменя инокулированного грибом Alternaria alternata. Качественно меняется величина асимметрии: меняется знак и уменьшается абсолютное значение. У зараженных семян эксцесс снижается в 2,4–2,8 раза для пшеницы и в 3,9–5,7 раза для ячменя.

Предположение о законе распределения можно проверить с помощью коэффициентов асимметрии и эксцесса. Выдвинув гипотезу о нормальном распределении зависимостей η_e(λ) для уровня значимости 0,05 из таблицы 5, мы видим, что нормальными можно считать только спектральные характеристики возбуждения для зараженных семян (по величине асимметрии). По критерию эксцесса все полученные зависимости не подчиняются нормальному закону распределения.

Изменения в спектрах возбуждения и фотолюминесценции могут быть объяснены изменениями структуры и химического состава поверхности зерна, а именно замещением полисахаридов и белков при поглощении и модификации микокультур Fusarium и Alternaria. Также из-за влияния на спектры пигментов этого возбудителя (фузарина) и микотоксинов (DON, ZEL, T-2 и NT-2) спектры будут приближаться к спектрам этих веществ.

Таким образом, для объективного контроля заражения семян микотоксинами целесообразно использовать диапазон коротковолновой фотолюминесценции 290–310 нм при возбуждении излучением около 284 нм. Для различения заражения фузариозом и альтернариозом возможно использовать контроль фотолюминесценции в диапазоне 380–410 нм при возбуждении излучением λ = 362 нм для пшеницы. Для ячменя целесообразно использовать отношение потоков фотолюминесценции при возбуждении 362 и 424 нм. Возбуждение излучением 485 нм использовать малоэффективно из-за сравнительно слабого фотолюминесцентного сигнала.