Method of Determining Seed Germination by Using Membrane Potential of Wheat Seeds

Full Text

Введение

Зерна пшеницы представляют собой основу сельскохозяйственной промышленности в России и во всем мире. Жизнеспособность семян является основным критерием диагностики качества, тесно связанным с процентом всхожести¹. Известно, что для оценки качества семян определяют их всхожесть [1].

Этот показатель представляет собой количественную характеристику и выражается в процентах. Общепринятая градация всхожести варьируется до 100 % с шагом в 1 % [2].

Проблема диагностики всхожести семян пшеницы заключается в том, что она изменяется в процессе хранения [3]. Сельскохозяйственные предприятия, фермерские хозяйства должны в кратчайшие сроки получать достоверный результат для расчета и корректировки объема семян для высева. Мониторинг их состояния во время хранения важен для обеспечения сохранности высококачественных коллекций [4].

Оценка физиологического потенциала семян является основным компонентом контроля их качества.

Цель работы – исследовать зависимость мембранного потенциала от качества семян и разработать метод определения всхожести семян пшеницы на основе их мембранных потенциалов.

Обзор литературы

Традиционные методы диагностики качества семян пшеницы в соответствии с правилами Международной ассоциации по контролю качества семян (ISTA) включают лабораторные методы с использованием регуляторов роста [5], методы окрашивания тетразолием²[6; 7], тесты жизнеспособности [2; 8]. Однако это трудоемкие, затратные по времени процессы [9].

В настоящее время существует ряд других методов оценки качества семян пшеницы. Эти методы основаны на обнаружении различных физических свойств, которые хорошо коррелируют с определенными факторами качества. Многие методы основаны на одном из следующих свойств: плотность, твердость, колебательные характеристики, передача рентгеновских лучей и гамма-лучей, оптическое отражение, электрические свойства и ядерный магнитный резонанс [10]. В оптических методах используют оптическое оборудование и компьютеризированную обработку данных, которые способны обеспечить высокоскоростную оценку качества и сортировку нескольких продуктов с высокой степенью точности [2].

Использование различных современных технологий получения изображений, таких как твердотельная телевизионная камера, камера линейного сканирования, рентгеновское сканирование, ультразвуковое сканирование и визуализация, в сочетании с технологиями обработки изображений открыли новые возможности для исследователей при разработке новых и усовершенствовании существующих методов неразрушающей оценки качества сельскохозяйственной продукции [10]. Однако эти методы требуют дорогостоящего оборудования, высокой квалификации и соответствующей подготовки специалистов.

Многие методы позволяют получить статус прорастания в градации: положительный (семена проросли), отрицательный (семена не проросли) [2; 11].

В приведенной классификации методов оценки качества семян отсутствуют методы, основанные на измерении биоэлектрических сигналов непосредственно с зерен пшеницы. В данном случае исключаются методы электрической диагностики, основанные, например, на измерении тока, пропускаемого через зерно, или измерении его сопротивления.

Известно, что генерация биоэлектрических сигналов играет важную роль в жизни растений, так как характеризует их физиологическое состояние [2; 3; 5; 7]. Все высшие растения могут использовать биоэлектрические сигналы для регулирования различных физиологических функций [3], поэтому анализ природы и закономерностей электрических сигналов [12] у растений представляется весьма актуальным³.

Функциональная роль биоэлектрических сигналов [2; 3; 13; 14] в высших растительных организмах привлекает пристальное внимание исследователей [15; 16; 23; 24].

Так, роль мембранных потенциалов была изучена наиболее тщательно для относительно небольшой группы так называемых «подвижных» растений, которые используют потенциал действия для быстрого локомоторного ответа под действием неблагоприятных факторов [3]. В настоящее время установлено, что мембранный потенциал представляет собой сигнал, который вызывает кратковременные переходные изменения во многих жизненно важных процессах (дыхание, фотосинтез, рост и т. д.) на этапе их распространения [13; 14; 16; 24].

Согласно теории Гольдмана – Ходжкина – Катца (GHK) мембранный потенциал определяется коэффициентами проницаемости для ионов K⁺, Na⁺, Cl^‒ и концентрациями ионов на внешней и внутренней сторонах мембраны:

 

$E=\frac{\text{RT}}{\text{F}}\text{ln}\frac{{\text{P}}_{\text{K}}{\left[{\text{K}}^{+}\right]}_{\text{out}}+{\text{P}}_{\text{Na}}{\left[{\text{Na}}^{+}\right]}_{\text{out}}+{\text{P}}_{\text{Cl}}{\left[{\text{Cl}}^{-}\right]}_{\text{in}}}{{\text{P}}_{\text{K}}{\left[{\text{K}}^{+}\right]}_{\text{in}}+{\text{P}}_{\text{Na}}{\left[{\text{Na}}^{+}\right]}_{\text{in}}+{\text{P}}_{\text{Cl}}{\left[{\text{Cl}}^{-}\right]}_{\text{out}}},$ (1)

где R – универсальная газовая постоянная, равная 8,31 Дж/(моль·K); T – абсолютная температура; F – постоянная Фарадея, равная 96485,35 Кл/моль⁻¹; P_K, P_Na, P_Cl – коэффициенты проницаемости для ионов K⁺, Na⁺, Cl^‒; [K⁺]_out, [Na⁺]_out, [Cl^‒]_out – концентрация ионов K⁺, Na⁺, Cl^‒ на внешней стороне мембраны; [K⁺]_in, [Na⁺]_in, [Cl^‒]_in – концентрация ионов K⁺, Na⁺, Cl^‒ на внутренней стороне мембраны.

Предположим, что оболочка зерна представляет собой мембрану. Тогда, при условии проращивания семян в воде, на внутренней стороне оболочки образуется определенная концентрация ионов K⁺, Na⁺, Cl^–. Проницаемость мембраны и внутренние ионные процессы обеспечивают выход ионов наружу. Таким образом, на мембране возникает мембранный потенциал E, который подчиняется уравнению (1). Поскольку качество семян определяется проницаемостью их оболочек и концентрацией ионов, то мембранный потенциал может выступать как параметр, обеспечивающий количественную оценку всхожести семян.

Обзор значимых независимых переменных в уравнении (1) показал, что основными факторами, влияющими на изменение мембранного потенциала семян, являются температура, внутренняя и внешняя концентрация ионов.

Основываясь на уравнении (1), температура напрямую воздействует на значение мембранного потенциала. Поэтому для проведения исследования необходимо стабилизировать температуру. Для исключения влияния внешней концентрации при проращивании семян пшеницы необходимо использовать дистиллированную воду.

Дополнительные факторы воздействия:

– наличие механических повреждений. Механические повреждения оболочки зерна могут вызвать искажение результатов исследования, что снизит достоверность;

– время хранения до определения мембранного потенциала (старение семян). Установлено, что жизнеспособность семян изменяется со временем, а следовательно, изменяется и всхожесть семян. Этот фактор необходимо брать во внимание [17; 18].

Из уравнения (1) следует, что основные факторы воздействия на мембранный потенциал – это концентрация ионов и проницаемость мембраны (оболочки).

Определив явные факторы влияния на мембранный потенциал, представим вид регрессионной модели:

$E_i=C_0\ln \left(G_i\right)+C_1,$             (2)

где i – значение всхожести; C₀ – константа, равная $\frac{RT}{F}$ (температура не изменяется в процессе исследования);  G_i – всхожесть семян, которая определяется согласно уравнению (1) как: $\frac{{\text{P}}_{\text{K}}{\left[{\text{K}}^{+}\right]}_{\text{out}}+{\text{P}}_{\text{Na}}{\left[{\text{Na}}^{+}\right]}_{\text{out}}+{\text{P}}_{\text{Cl}}{\left[{\text{Cl}}^{-}\right]}_{\text{in}}}{{\text{P}}_{\text{K}}{\left[{\text{K}}^{+}\right]}_{\text{in}}+{\text{P}}_{\text{Na}}{\left[{\text{Na}}^{+}\right]}_{\text{in}}+{\text{P}}_{\text{Cl}}{\left[{\text{Cl}}^{-}\right]}_{\text{out}}}$ .

Материалы и методы

Для экспериментальных исследований были предоставлены семена яровой пшеницы сорта «Зимушка» Алтайским отделением Россельхозцентра (Россия, Сибирский Федеральный округ, Барнаул). Было отобрано в общей сложности 7 образцов с разной всхожестью. Всхожесть отмечена в процентах. Для исследования предоставлены семена с процентом всхожести 87 %, 89 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 99 %.

Предварительный контроль прорастания семян по методам ISTA

Перед проведением измерения мембранного потенциала был проведен контрольный тест всхожести по методам ISTA. Из партии образцов часть семян отправили на прорастание для проверки и установления их всхожести [24] в соответствии с правилами, установленными Международной ассоциацией по контролю качества семян (ISTA) [1]. Семена помещались на двух слоях фильтровальной бумаги в чашках Петри. Бумага предварительно смачивалась водой. Через семь дней при 20 ± 1 °C были проведены подсчеты проросших семян. В соответствии с количеством проросших семян установлен процент всхожести. Были получены идентичные проценты всхожести в лаборатории Россельхозцентра.

Подготовка к измерению мембранного потенциала

Перед измерением мембранного потенциала отобранные из партии образцы с разным процентом всхожести прошли дополнительную подготовку. Подготовка семян заключается в следующем. Вначале все семена просматривались на наличие поврежденных, пустотелых, которые исключались из дальнейшего процесса исследований.

Затем зерна устанавливали на поролоновую форму внутри пластиковой коробки (300 мм × 120 мм × 50 мм) на расстоянии 5 мм друг от друга. Форма увлажняется дистиллированной водой (100 мл). Были установлены три пластиковые коробки с поролоновыми формами. Использование дистиллированной воды позволяет исключить влияние внешней концентрации ионов на результат измерения мембранного потенциала зерна пшеницы (исключается следующий фактор).

Пластиковые коробки помещаются на 12 часов в термокамеру (рис. 1). Термокамера содержит датчики, которые контролируют изменение температуры, установленной на уровне 20 °С. После стабилизации температуры исключается еще один фактор влияния на мембранный потенциал.

 

 

 

 

Рис. 1. Система диагностики, термокамера

Fig. 1. A diagnostic system and a thermal camera

 

Далее запускаются вентиляторы для конвекции воздуха внутри камеры. Камера плотно закрывается на 12 часов. После извлекается по одной форме и измеряется мембранный потенциал семян.

Калибровка устройства LA 50 USB

Перед измерением проводилась калибровка АЦП ЛА-50 USB с помощью магазина сопротивлений (производство Германия), источника постоянного тока и измерительных электродов. Магазин сопротивлений позволил смоделировать выходное значение в диапазоне от –200 мВ до –55 мВ.

Процесс измерения

В процессе измерения каждое семя пшеницы помещалось в электрод и протыкалось вторым электродом. Регистрация сигнала происходила с помощью устройства LA 50 USB. Запись сигнала во времени осуществлялась на протяжении 10 с. На рисунке 2 представлена схема подключения электродов.

 

 

 

Риc. 2. Схема подключения электродов

Fig. 2. Electrodes connection diagram

 

 

При получении данных в лаборатории относительная влажность составляла 30 %, а температура составляла 19 °С.

Для измерения мембранного потенциала зерна использовалась измерительная система со следующей структурной схемой (рис. 3).

 

 

 

Риc. 3. Обобщенная структурная схема: 1 – измерительное устройство; 2 – аналого-цифровой
преобразователь; 3 – подсистема обработки информации; 4 – потребитель информации

Fig. 3. Generalized structural diagram: 1 – measuring device; 2 – analog-to-digital converter;
3 – information processing subsystem; 4 – consumer information

 

Узлы измерительного устройства и аналого-цифрового преобразования формируют напряжение для передачи его в ПК с последующей обработкой фиксируемого сигнала. Узел подсистемы обработки информации включает в себя модели и алгоритмы, на основе которых происходит анализ полученной в результате измерений информации.

Обмен данными аналого-цифрового преобразования между ПК и устройством осуществляется через интерфейс USB. ПК при помощи специальной программы, входящей в комплект поставки, осуществляет обработку поступающих от устройства данных аналого-цифрового преобразования и управление устройством через интерфейс USB.

Для измерения биоэлектрических сигналов семян пшеницы применялась система диагностики, представленная на рисунке 1.

Система состояла из платы сбора данных (ЛА-50USB, Россия), электродов, компьютера.

Результаты исследования

Обработка результатов. Метод скользящей средней

После сбора данных все сигналы представляют аддитивную смесь «сигнал + шум». Информация о помехах уменьшает отношение сигнал/шум и снижает полезность данных. Повысить достоверность информации возможно путем применения методов предварительной обработки [19; 20]. В настоящее время существуют различные методы предварительной обработки [21]. Как показал анализ полученной смеси, на полезный сигнал накладывается высокочастотный шум. Следовательно, целесообразно применить метод низкочастотной фильтрации, или метод скользящей средней [22]. Для примера на рисунке 4 показан результат усреднения. Информативным параметром является значение напряжения E в точке t = 0 c. В данной точке мембранный потенциал удовлетворяет уравнению (1). Дальнейшие изменения мембранного потенциала – это уже потенциал действия.

 

 

 

Рис. 4. Результаты исследования до сглаживания и после (окно в 50 значений)

Fig. 4. Results of the study before and after smoothing (a window of 50 values)

 

 

При статистической обработке группы результатов прямых многократных независимых измерений проводилась оценка измеряемой величины, за которую принималось среднее арифметическое значение исправленных результатов измерений.

Далее вычисляли среднее квадратическое отклонение результатов измерений (табл. 1).

 

Таблица 1 Результаты статистической обработки данных

Table 1 Results of statistical processing

Температура, К /Temperature, K	Всхожесть, % / Germination, %	E1, mV	E2, mV	E3, mV	…	En, mV	Среднее значение, мВ / Average value, mV	Cреднее квадратическое отклонение (S) / Average square deviation (S)
293	87 %	–185,69	–190,27	–186,70	…	–186,05	–186,99	8,53
293	89 %	–139,37	–139,21	–140,02	…	–134,50	–142,05	5,24
293	90 %	–123,17	–125,05	–125,85	…	–127,48	–125,92	6,46
293	92 %	–106,45	–105,02	–105,9	…	–102,41	–104,94	6,51
293	95 %	–74,86	–75,60	–75,31	…	–77,08	–76,41	4,06
293	97 %	–63,21	–64,04	–63,1	…	–64,74	–64,17	3,51
293	99 %	–52,63	–55,30	–56,47	…	–55,1	–54,97	5,01

 

 

После осуществлялась проверка на грубые погрешности. Для исключения грубых погрешностей из результатов исследований был применен критерий Граббса. Согласно данному критерию группа результатов измерений должна принадлежать нормальному распределению, что и подтверждено результатами статистической обработки данных. Наблюдаемые значения статистики Пирсона не попадают в критическую область (К_набл < K_kp), поэтому нет оснований отвергать основную гипотезу, выборки имеют нормальное распределение.

Для исключения погрешностей были определены G₁ и G₂, предполагая, что наибольший x_max или наименьший x_min результат измерений вызван грубыми погрешностями:

$G_1=\frac{\left|x_{max}-\overline{x}\right|}{\text{S}}$ , $G_2=\frac{\left|\overline{x}-x_{min}\right|}{\text{S}}$ ,   (3)

где x_max – наибольший результата измерения; x_min – наименьший результат измерений; ̅x – среднее значение; S – среднее квадратическое отклонение.

Сравнивались G₁ и G₂ c теоретическим значением G_T критерия Граббса при выбранном уровне значимости q. Если G₁ > G_T, то x_max исключается как маловероятное значение. Если G₁ > G_T, то x_min исключается как маловероятное значение.

Если G₁ ≤ G_T, то x_max не считается промахом и показатель сохраняется в ряду результатов измерений. Если G₂ ≤ G_T, то x_min не считается промахом и показатель сохраняется в ряду результатов измерений. В таблице 2 представлены результаты статистической обработки.

 

Таблица 2 Погрешность экспериментального исследования

Table 2 Experimental error

Всхожесть, % / Germination, %	Среднее значение, мВ / Average value, mV	Доверительный интервал / Confidence interval		Ɛα=0,95, мВ / Ɛα=0,95, mV	Ɛ, %
87 %	–186,99	–190,23	–183,76	–3,23	1,73 %
89 %	–142,05	–144,04	–140,06	–1,99	1,40 %
90 %	–125,92	–128,37	–123,48	–2,45	1,94 %
92 %	–104,94	–107,41	–102,47	–2,47	2,35 %
95 %	–76,41	–77,95	–74,87	–1,54	2,01 %
97 %	–64,17	–65,51	–62,84	–1,33	2,08 %
99 %	–54,97	–56,88	–53,08	–1,89	3,45 %

 

После статистической обработки данных был проведен дисперсионный анализ с целью поиска зависимостей в экспериментальных данных. В качестве типа дисперсионного анализа выбран одномерный однофакторный анализ для двух независимых групп данных. В данном случае группы объединены по одному признаку.

В процессе проведения анализа осуществлена проверка нулевой гипотезы о равенстве средних. Поскольку анализируются две группы, применялся двухвыборочный t-критерий Стьюдента для независимых выборок.

По результатам анализа, если средние значения двух выборок исследуемой величины одинаковы, то оценки факторной и остаточной дисперсий представляют собой несмещенную оценку генеральной дисперсии и различаются несущественно.

Таким образом, сопоставление оценок этих дисперсий по критерию Фишера демонстрирует, что нулевую гипотезу о равенстве факторной и остаточной дисперсий нельзя отклонять. В таблице 3 представлены результаты проверки нулевой гипотезы.

 

Таблица 3 Результаты проверки нулевой гипотезы

Table 3 Results of testing the null hypothesis

Всхожесть, % /Germination, %	Эксперимент № 1.  Среднее значение, мВ / Experiment No. 1. The average value, mV	Эксперимент № 2. Среднее значение, мВ / Experiment No. 2. The average value, mV	fнабл /fobservable	fкр /fcritical	Комментарий / Comment
87 %	–186,99	–187,2	0,01	3,92	fнабл < fкр
89 %	–142,05	–143,53	2,40	3,92	fнабл < fкр
90 %	–125,92	–126,49	0,28	3,92	fнабл < fкр
92 %	–104,94	–105,20	0,05	3,92	fнабл < fкр
95 %	–76,41	–77,29	1,14	3,92	fнабл < fкр
97 %	–64,17	–65,63	3,90	3,92	fнабл < fкр
99 %	–54,97	–53,4	2,81	3,92	fнабл < fкр

 

Для уровня значимости α = 0,05 был определен f_кр из таблицы распределения Фишера – Снедекора. В связи с тем, что f_набл < f_кр, нулевая гипотеза о существенном влиянии фактора на результаты экспериментов отклоняется (нулевая гипотеза о равенстве групповых средних принимается). Другими словами, средние значения двух групп в целом различаются несущественно.

На рисунке 5 представлены результаты измерения семян пшеницы разной всхожести. Очевидные различия значений наблюдались между семенами с высокой всхожестью и низкой.

 

 

 

Рис. 5. Среднее значение потенциала в начальный отрезок времени (t = 0 с) для семян разного процента всхожести.

Fig. 5. Average value of the potential in the initial period of time (t = 0 sec) for seeds of different germination percentages

 

Результаты исследований показали, что разность потенциалов между внутренней и внешней оболочкой семян пшеницы зависит от их всхожести, а следовательно, значение может быть использовано в качестве параметра оценки качества. Так, начальное значение потенциала (в нулевой отрезок времени) составило для семян со всхожестью 99 % – 55 мВ, для семян низкой всхожести (87 %) – 187 мВ при условии, что температура в период набухания зерен составляла 20 °C.

В процессе экспериментального исследования выявлена оптимальная температура для проведения эксперимента: 20 – 22 °C.

На основе уравнения GHK и экспериментальных исследований научно доказано, что проращивание семян пшеницы при температуре 20 °С обеспечивает достоверную всхожесть семян. Полученный результат не противоречит диапазону температур, рекомендованному стандартом [1].

Обсуждение и заключение

Разработана методология определения всхожести семян пшеницы на основе мембранных потенциалов, которая существенно отличается от известных методик. Разработана экспериментальная установка, способная обеспечить все необходимые условия для исследований. Определены требования и оптимальные условия проведения экспериментов. На основе экспериментальных исследований установлена зависимость мембранного потенциала семян пшеницы от их всхожести.

Задачи, решенные в данной статье, могут быть использованы для экспресс-оценки качества семян пшеницы на любой технологической стадии (на этапе уборки, хранения, высева).

Планируется проведение практической проверки полученных результатов в сельскохозяйственном производстве. Предполагается продолжить исследования в данном направлении для семян пшеницы разных сортов, имеющих различный химический состав, учитывая влияющие внешние факторы.

 

 

¹           Hampton J. G., TeKrony D. M. Handbook of Vigour Test Methods. Zurich: ISTA, 1995. 117 p. URL: https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19960707176 (дата обращения: 01.06.2019).

²           Peters J., Lanham B. Tetrazolium Testing Handbook: Contribution no. 29 to the Handbook on Seed Testing. Lincoln, Neb.: The Association, 2000. URL: https://www.worldcat.org/title/tetrazolium-testing-handbook-contribution-no-29-to-the-handbook-on-seed-testing/oclc/49853771#relatedsubjects (дата обращения: 01.06.2019).

³           Hlavachova Z. Electrical Properties of Agricultural Products // Encyclopedia of Agrophysics. 2011. DOI: https://doi.org/10.1007/978-90-481-3585-1_47

About the authors

Nadezhda N. Barysheva

Polzunov Altai State Technical University

Author for correspondence.
Email: mnn-t@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1338-9740
ResearcherId: C-9650-2019

Associate Professor of Chair of Information Systems in Economy, Ph.D. (Engineering)

Russian Federation, 46 Lenina, Barnaul 656038

Sergey P. Pronin

Altai State Technical University

Email: sppronin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5066-2609

Doctor of Technical Sciences, Professor of the Department of Information Technology

Russian Federation, 46 Lenina, Barnaul 656038

References

Supplementary files