Нарушение экспрессии протеинкиназ в нейронах коры мозга с делецией транскрипционного фактора Satb1 вызывает гипервозбуждение нейрональной сети и определяет чувствительность к гипоксии
- Авторы: Целис Суэскун Х.К.1, Гавриш М.С.1, Туровский Е.А.1,2, Варламова Е.Г.2
-
Учреждения:
- Научно-исследовательский институт нейронаук, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
- Институт биофизики клетки Российской академии наук «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»
- Выпуск: Том 18, № 4 (2023)
- Страницы: 456-459
- Раздел: Материалы конференции
- URL: https://journals.rcsi.science/2313-1829/article/view/256242
- DOI: https://doi.org/10.17816/gc623236
- ID: 256242
Цитировать
Открытый доступ
Доступ предоставлен
Только для подписчиков
Аннотация
Нейрональные факторы транскрипции регулируют экспрессию многих рецепторов и внутриклеточных сигнальных молекул, участвующих в возбуждающей нейротрансмиссии. Большое внимание уделяется транскрипционному фактору Satb1 с точки зрения его вклада в регуляцию роста и развития различных типов нейронов головного мозга как в эмбриональном, так и в постнатальном периодах. Изменение уровня экспрессии и активности таких белков, как рецепторы глутамата, протеинкиназы и регуляторы жизнеспособности клеток, при делеции фактора транскрипции Satb1 можно считать одним из ключевых фундаментальных механизмов, определяющих запуск нейронной сети в состояние гипервозбуждения. Несмотря на достаточное количество работ, посвящённых роли Satb1 в нейрогенезе, отсутствуют исследования, демонстрирующие изменения внутриклеточной передачи сигналов кальция и уровня экспрессии белков при его делеции в нейронах.
В исследовании использовали мышей с полной (Satb1-null) и частичной (Satb1-deficient) делецией транскрипционного фактора Satb1. Нейроглиальные культуры коры мозга получали из новорожденных мышей и культивировали в течение 10 суток in vitro. Далее клетки загружали кальций-чувствительным флуоресцентным зондом Fura-2 и с помощью флуоресцентного микроскопа регистрировали динамику цитозольного Са2+ ([Ca2+]i). В клеточных культурах регистрировали спонтанную Са2+-активность, а также моделировали эпилептиформную активность с помощью общепринятых методов — исключение магния из среды (безмагниевая модель) и добавление 10 мкМ бикукулина (бикукулиновая модель). Группой сравнения были клетки коры мозга, полученные из контрольных мышей. Для анализа паттернов экспрессии генов, кодирующих киназы, выделяли тотальную РНК из клеточных культур и проводили ПЦР-анализ в реальном времени.
Оказалось, что полная и неполная делеция транскрипционного фактора Satb1 по-разному влияли на экспрессию протеинкиназ и генов-регуляторов жизнеспособности клеток. В нейронах с дефицитом Satb1 происходило повышение экспрессии генов, кодирующих фосфоинозитид-3-киназу, протеинкиназу С, протеинкиназу В, митоген-активируемую протеинкиназу, а также гены Bcl-2, Creb, Nf-kB. Тогда как полная делеция Satb1 в корковых нейронах вызывала повышение экспрессии только фосфоинозитид-3-киназы, экспрессия всех остальных исследованных протеинкиназ снижалась на фоне повышения провоспалительных факторов Nf-kB, Caspase-3 и Tnfα.
На уровне нейротрансмиссии, полная делеция Satb1 приводила к повышенной спонатнной Са2+-активности нейронов, а также большим частотам и амплитудам Са2+-осцилляций при моделировании эпилептиформной активности. Поскольку симптом гипервозбуждения сети показан в нейрональных сетях при гипоксии и реакции нейронов на гипоксию зависят от активности исследованных нами киназ, были проведены эксперименты по моделированию гипоксии в нейронах, полученных из мышей с делецией транскрипционного фактора Satb1. Одновременно с регистрацией [Ca2+]i производилось измерение парциального давления кислорода (рO2) c помощью соматического оксиметра. Пороговым значением уменьшения рO2 считали начало генерации Са2+-ответов в нейронах. Появление первых Са2+-ответов на гипоксию в WT-нейронах происходило в 8–10% клеток, когда парциальное давление кислорода снижалось до 40 мм рт.ст, при этом остальные клетки в поле зрения микроскопа не реагировали. Satb1-null нейроны начинали реагировать на гипоксию при 60 мм рт.ст, причем Са2+-ответы имели вид высокоамплитудных Са2+-осцилляций, регистрируемых в более чем 15% клеток. При этом Satb1-null нейроны реагировали появлением высокочастотных Са2+-осцилляций с выходом базового уровня [Ca2+]i на новый стационарный уровень уже при снижении рO2 до 75–80 мм рт.ст, а с учётом высокого процента (более 20%) отвечающих нейронов, можно говорить о повышенной чувствительности Satb1-null нейронов к гипоксии.
Ключевые слова
Полный текст
Нейрональные факторы транскрипции регулируют экспрессию многих рецепторов и внутриклеточных сигнальных молекул, участвующих в возбуждающей нейротрансмиссии. Большое внимание уделяется транскрипционному фактору Satb1 с точки зрения его вклада в регуляцию роста и развития различных типов нейронов головного мозга как в эмбриональном, так и в постнатальном периодах. Изменение уровня экспрессии и активности таких белков, как рецепторы глутамата, протеинкиназы и регуляторы жизнеспособности клеток, при делеции фактора транскрипции Satb1 можно считать одним из ключевых фундаментальных механизмов, определяющих запуск нейронной сети в состояние гипервозбуждения. Несмотря на достаточное количество работ, посвящённых роли Satb1 в нейрогенезе, отсутствуют исследования, демонстрирующие изменения внутриклеточной передачи сигналов кальция и уровня экспрессии белков при его делеции в нейронах.
В исследовании использовали мышей с полной (Satb1-null) и частичной (Satb1-deficient) делецией транскрипционного фактора Satb1. Нейроглиальные культуры коры мозга получали из новорожденных мышей и культивировали в течение 10 суток in vitro. Далее клетки загружали кальций-чувствительным флуоресцентным зондом Fura-2 и с помощью флуоресцентного микроскопа регистрировали динамику цитозольного Са2+ ([Ca2+]i). В клеточных культурах регистрировали спонтанную Са2+-активность, а также моделировали эпилептиформную активность с помощью общепринятых методов — исключение магния из среды (безмагниевая модель) и добавление 10 мкМ бикукулина (бикукулиновая модель). Группой сравнения были клетки коры мозга, полученные из контрольных мышей. Для анализа паттернов экспрессии генов, кодирующих киназы, выделяли тотальную РНК из клеточных культур и проводили ПЦР-анализ в реальном времени.
Оказалось, что полная и неполная делеция транскрипционного фактора Satb1 по-разному влияли на экспрессию протеинкиназ и генов-регуляторов жизнеспособности клеток. В нейронах с дефицитом Satb1 происходило повышение экспрессии генов, кодирующих фосфоинозитид-3-киназу, протеинкиназу С, протеинкиназу В, митоген-активируемую протеинкиназу, а также гены Bcl-2, Creb, Nf-kB. Тогда как полная делеция Satb1 в корковых нейронах вызывала повышение экспрессии только фосфоинозитид-3-киназы, экспрессия всех остальных исследованных протеинкиназ снижалась на фоне повышения провоспалительных факторов Nf-kB, Caspase-3 и Tnfα.
На уровне нейротрансмиссии, полная делеция Satb1 приводила к повышенной спонатнной Са2+-активности нейронов, а также большим частотам и амплитудам Са2+-осцилляций при моделировании эпилептиформной активности. Поскольку симптом гипервозбуждения сети показан в нейрональных сетях при гипоксии и реакции нейронов на гипоксию зависят от активности исследованных нами киназ, были проведены эксперименты по моделированию гипоксии в нейронах, полученных из мышей с делецией транскрипционного фактора Satb1. Одновременно с регистрацией [Ca2+]i производилось измерение парциального давления кислорода (рO2) c помощью соматического оксиметра. Пороговым значением уменьшения рO2 считали начало генерации Са2+-ответов в нейронах. Появление первых Са2+-ответов на гипоксию в WT-нейронах происходило в 8–10% клеток, когда парциальное давление кислорода снижалось до 40 мм рт.ст, при этом остальные клетки в поле зрения микроскопа не реагировали. Satb1-null нейроны начинали реагировать на гипоксию при 60 мм рт.ст, причем Са2+-ответы имели вид высокоамплитудных Са2+-осцилляций, регистрируемых в более чем 15% клеток. При этом Satb1-null нейроны реагировали появлением высокочастотных Са2+-осцилляций с выходом базового уровня [Ca2+]i на новый стационарный уровень уже при снижении рO2 до 75–80 мм рт.ст, а с учётом высокого процента (более 20%) отвечающих нейронов, можно говорить о повышенной чувствительности Satb1-null нейронов к гипоксии.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 22-24-00712.
Об авторах
Х. К. Целис Суэскун
Научно-исследовательский институт нейронаук, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
Автор, ответственный за переписку.
Email: juancamilo1297@gmail.com
Россия, Нижний Новгород
М. С. Гавриш
Научно-исследовательский институт нейронаук, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
Email: juancamilo1297@gmail.com
Россия, Нижний Новгород
Е. А. Туровский
Научно-исследовательский институт нейронаук, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Институт биофизики клетки Российской академии наук «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»
Email: juancamilo1297@gmail.com
Россия, Нижний Новгород; Пущино
Е. Г. Варламова
Институт биофизики клетки Российской академии наук «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»
Email: juancamilo1297@gmail.com
Россия, Пущино
Список литературы
Дополнительные файлы
