Белковые партнёры TRIM29 в культуре иммортализованных клеток нормального базального эпителия предстательной железы

Полный текст

Введение

TRIM29 — E3-убиквитин-лигаза, представлена преимущественно в базальном эпителии и является одним из эпигенетических модуляторов мастер-регулятора развития эпителия, транскрипционного фактора TP63 [1–3]. Кроме того, белок TRIM29 вовлечён во множество клеточных процессов, таких как ответ на вирусную инфекцию, ответ на повреждения ДНК, регуляция p53-зависимого апоптоза. TRIM29 участвует в онкогенезе и может проявлять как онкогенные, так и онкосупрессорные свойства при различных типах рака. При онкологических заболеваниях лёгких, поджелудочной железы, мочевого пузыря, желудка, печени, костей и прямой кишки отмечается значимое увеличение уровня экспрессии TRIM29 в опухолевой по сравнению со смежной неопухолевой тканью, что коррелирует с увеличением клеточной пролиферации [3–6]. TRIM29 часто регулирует эпителиально-мезенхимальный переход, способствуя увеличению подвижности и инвазии клеток, и, как следствие, обусловливает метастазирование опухолей [3–8]. В то же время для рака шейки матки, молочной железы, предстательной железы (ПЖ) и плоскоклеточного рака кожи TRIM29 может выступать как онкосупрессор. Что интересно, высокая инвазивность, метастазирование и плохой клинический прогноз в этих случаях связаны с низким уровнем экспрессии TRIM29. Регуляция экспрессии TRIM29 происходит на уровне метилирования гена [2, 3, 9, 10].

TRIM29 — неканонический белок семейства E3-убиквитин-лигаз TRIM с отсутствующим каталитическим RING-доменом. Белок TRIM29 человека имеет длину 588 аминокислот и состоит из трёх функциональных доменов: два B-Box-домена и Coiled-Coil-домен (рис. 1, а). В отличие от других членов белкового семейства TRIM, TRIM29 не содержит каталитический домен RING, однако было показано, что комбинация двух B-Box-доменов тоже обладает E3-убиквитин-лигазной активностью [11]. На С-конце TRIM29 специфических доменов не обнаружено, но определён мотив связывания белка MSH2, участвующего в репарации двухцепочечных разрывов ДНК [9]. Поскольку нарушения в экспрессионной программе TRIM29 ассоциированы с развитием опухоли [1, 3–6], экспрессию этого гена можно использовать в качестве прогностического маркёра. Сверхэкспрессия TRIM29 при онкологических заболеваниях органов пищеварительной системы ассоциирована с наиболее неблагоприятным прогнозом [3–6]. Нашей группой было показано, что в нормальном базальном эпителии ПЖ белок TRIM29 может локализоваться в ядре и взаимодействует с белками системы репарации ДНК, такими как MSH2, MSH6 [1, 9]. Показано также, что нокдаун TRIM29 значительно снижает количество фокусов фосфорилированной формы гистона H2AX, являющейся маркёром репарации двухцепочечных разрывов ДНК [1]. Однако информация о белках-партнёрах TRIM29 в других клеточных компартментах помимо ядра остаётся не до конца изученной. Кроме того, неизвестно влияние функциональных доменов TRIM29 на взаимодействие с его белками-партнёрами (интерактомом).

 

Рис. 1. Интерактом белков TRIM29-FLAG, dBB-TRIM29-FLAG и dCC-TRIM29-FLAG в клеточной линии RWPE-1 нормального базального эпителия предстательной железы: a — доменная структура белка TRIM29-FLAG и его усечённых форм; b — вестерн-блот-анализ, подтверждающий сверхэкспрессию TRIM29-FLAG и его усечённых форм в клеточной линии RWPE-1, а также результаты иммунопреципитации TRIM29-FLAG и его усечённых форм; красной стрелкой обозначен эндогенный TRIM29; c — схема эксперимента по исследованию интерактома белка TRIM29-FLAG и его усечённых форм; d — график, отображающий количество белков-партнёров TRIM29-FLAG и его усечённых форм; отображены как уникальные для каждой формы белки, так и общие при попарном сравнении, а также общие для всех трёх; вертикальные перемычки между точками под столбцевыми диаграммами отображают пересечение соответствующих множеств; ИП — анализируются элюаты эксперимента по иммунопреципитации, ИБ — иммуноблотинг, окрашивание мембраны антителами к белкам интереса, КЛ — клеточный лизат; GFP — зелёный флуоресцентный белок; ВЭЖХ-МС/МС — высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией.

Fig. 1. Interactome of TRIM29-FLAG, dBB-TRIM29-FLAG and dCC-TRIM29-FLAG proteins in the normal prostate basal epithelial cell line RWPE-1: a: Domain structure of the TRIM29-FLAG protein and its truncated forms; b: Western blot analysis confirming the overexpression of TRIM29-FLAG and its truncated forms in the RWPE-1 cell line, results of the immunoprecipitation of TRIM29-FLAG and its truncated forms; the red arrow indicates endogenous TRIM29; c: Design of experiment to evaluate the interactome of the TRIM29-FLAG protein and its truncated forms; d: A graph showing the number of protein partners of TRIM29-FLAG and its truncated forms; protein partners unique to each form of TRIM29 and protein partners common in pairwise comparisons between forms as well as protein partners common to all three forms are shown; vertical bars between points below the bar graphs indicate the intersection of the corresponding sets; IP, immunoprecipitation eluates are evaluated; IB, immunoblotting, membrane staining with antibodies against proteins of interest; CL, cell lysate; GFP, green fluorescent protein; HPLC-MS/MS, high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry.

 

В этом исследовании мы изучали белки-партнёры полноразмерного TRIM29 и влияние его функциональных доменов на его интерактом. Мы обнаружили, что Coiled-Coil-домен играет основную роль в формировании белок-белковых взаимодействий, в то время как B-Box-домен не имеет такого влияния на интерактом TRIM29. Удаление Coiled-Coil-домена нарушает связывание TRIM29 с ядерными белками и в особенности — с РНК-связывающими белками. Мы ещё раз подтвердили участие TRIM29 в ответе на генотоксический стресс. Кроме того, нами впервые показано, что TRIM29 может регулировать сплайсинг РНК. Таким образом, вовлечённость TRIM29 в широкий спектр биологических процессов делает его потенциальной целью для разработки нового типа противоопухолевой терапии.

Цель исследования — определение белков-партнёров TRIM29 и его усечённых форм с последующим исследованием ключевых молекулярных процессов, в которые он вовлечён, а также изучение влияния функциональных доменов TRIM29 на спектр его белковых партнёров.

Материалы и Методы

Культивирование клеток. В работе использовали клеточные линии RWPE-1 (CRL-3607; ATCC, США), Phoenix, HEK293, PC3 (получены от лаборатории клеточной биологии ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Лопухина ФМБА России). Клеточную линию RWPE-1 культивировали в среде Keratinocyte-SFM (Thermo Fisher Scientific, США). Клетки PC3, Phoenix, HEK293 растили в культуральной среде DMEM («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Все клеточные культуры культивировали в инкубаторе с температурой 37 °С и содержанием СО₂ 5%.

Клетки растили до конфлюентности 50% перед добавлением фактора некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor α, TNF-α) («ПанЭко», Россия), или H₂O₂ (589271809; Тульская фармацевтическая фабрика, Россия), или доксорубицина (D1515; Sigma-Aldrich, США) в концентрации 100 нг/мл, 0,1 мкрМ и 2 мкрМ соответственно и культивировали в инкубаторе в течение 48 ч после добавления действующего агента.

Используемые в работе антитела. Использовали первичные антитела: anti-p63-alpha (13109; Cell Signaling Technology, США); anti-TRIM29 (5182; Cell Signaling Technology, США); anti-DYKDDDDK (anti-FLAG, 14793; Cell Signaling Technology, США); anti-H1 (ab125027; Abcam, Великобритания); anti-gamma H2A.X (phospho S139) (#05-636; Sigma-Aldrich, США); anti-H3 (9715; Cell Signaling Technology, США).

Использовали вторичные антитела: Alexa Fluor 488-conjugated (#A-11008, #A-11001; Thermo Scientific, США); anti-mouse IgG HRP-conjugated (G-21040; Invitrogen, США); anti-rabbit IgG HRP-conjugated (G-21234; Invitrogen, США).

Использовали также магнитные частицы, конъюгированные с антителами, специфичными к FLAG: Anti-FLAG M2 Magnetic Beads (M8823; Sigma-Aldrich, США).

Получение генно-инженерных конструкций, кодирующих химерные белки TRIM29-FLAG, dBB-TRIM29-FLAG, dCC-TRIM29-FLAG, RFP-H1, GFP-TRIM29 (см. раздел «Результаты»). Полимеразная цепная реакция — амплификация фрагментов, кодирующих TRIM29-FLAG, dBB-TRIM29-FLAG, dCC-TRIM29-FLAG, TRIM29 и H1, осуществлялась при помощи праймеров, последовательности которых указаны в табл. 1. В качестве матрицы использовали комплементарную ДНК (MINT; «Евроген», Россия), которую получали из РНК, выделенной из клеточной линии RWPE-1 (TRIzol; Thermo Fisher Scientific, США). Полученные фрагменты TRIM29-FLAG, dBB-TRIM29-FLAG, dCC-TRIM29-FLAG были внедрены в LeGO-iG2 (addgene #27341) — лентивирусный вектор, в котором в качестве маркёра применяется зелёный флуоресцентный белок GFP (green fluorescent protein), по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI. Для исследования колокализации белков H1 и TRIM29 были использованы коммерческие векторы для временной трансфекции pTagGFP2-N и pTagRFP-N («Евроген», Россия), содержащие зелёный и красный (RFP, red fluorescent protein) флуоресцентные белки соответственно. Фрагменты, кодирующие белки TRIM29 и H1, были внедрены в конструкции по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI/XbaI соответственно таким образом, что TRIM29 и H1 находились в одной рамке считывания с последовательностями, кодирующими GFP или RFP.

 

Таблица 1. Олигонуклеотиды, использованные в работе

Table 1. Oligonucleotides used in the study

Название	Последовательность
TRIM29_BamHI_fwd	TTGGATCCATGGAAGCTGCAGATGCC
TRIM29_FLAG_EcoRI_rev	AAGAATTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTGGGGCTTCGTTGGAC
dBB_TRIM29_BamHI_fwd	TGGATCCATGTTCCGAGACCACCAGCT
dCC_TRIM29_fwd	CATCTGCTACCTTTGCATGATGGATGCTCTGGATGAG
dCC_TRIM29_rev	CTCATCCAGAGCATCCATCATGCAAAGGTAGCAGATG
TRIM29_EcoRI_rev	AAGAATTCTATGGGGCTTCGTTGGAC
H1_BamHI_fwd	TTGGATCCATGTCGGAAACCGCTCC
H1_XbaI_rev	TTTCTAGACTACTTCTTTTTGGCAGCCG

 

В работе была использована плазмида, кодирующая FLAG-убиквитин, предоставленная А.А. Кудряевой из лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Кроме того, применяли генно-инженерную конструкцию на базе вектора LeGO-iG2, кодирующую TRIM29, которая была получена нашей группой ранее [1].

Получение лентивирусных частиц. Накануне трансфекции клетки линии Phoenix были высеяны на культуральные чашки диаметром 10 см в количестве 700 тыс. клеток на чашку. Для трансфекции использовали вспомогательные плазмиды, содержащие гены Rev (15,3% от общего количества ДНК), RRE (29,8% от общего количества ДНК) и VSV-G (5,6% от общего количества ДНК), а также целевую плазмиду LeGO-iG2, в которой закодирован химерный белок TRIM29-FLAG или его усечённые формы dBB-TRIM29-FLAG и dCC-TRIM29-FLAG. Трансфекцию проводили с применением трансфицирующего агента TurboFect (Thermo Fisher Scientific, США) в соотношении 26,4 мкл на 13,2 мкг ДНК. Процедуру трансфекции осуществляли в соответствии с инструкцией производителя. Культуральную среду, содержащую вирусные частицы, собирали через 24, 48 и 72 ч после трансфекции, пропускали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и замораживали на –70 °С.

Получение клеточных культур со сверхэкспрессией TRIM29-FLAG, dBB-TRIM29-FLAG, dCC-TRIM29-FLAG. 100 тыс. клеток (RWPE-1 или PC3) на лунку высевали на 6-луночный планшет за два дня до трансдукции. Культуральную среду, содержащую вирусные частицы, добавляли к клеточной культуре в присутствии полибрена (8 мкг/мл) из расчёта 3–5 вирусных частиц на клетку. Через 24 ч проводили смену среды. Через 2 дня после инфекции клеточную популяцию, экспрессирующую GFP, отделяли на клеточном сортере (FACS BD Aria III; BD Biosciences, США).

Иммунопреципитация. Клеточный осадок ресуспендировали в охлаждённом буфере для лизиса клеток (50 мМ Tris-HCl; pH 7,4; 150 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА; 0,1% NP-40; 10% глицерин; ингибиторы протеаз). Лизат замораживали в жидком азоте и размораживали при комнатной температуре, затем центрифугировали при 16 000 g в течение 10 мин и отбирали надосадочную жидкость. Полученный клеточный лизат инкубировали в течение ночи при 4 °С на ротаторе с магнитными частицами (magnetic beads anti-flag), предварительно дважды промытыми TBS (tris-buffered saline, трис-буфер солевой): 150 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, pH 7,6. Магнитные частицы промывали 1 раз буфером для лизиса и 3 раза буфером TBS.

Элюцию белков с магнитных частиц осуществляли буфером для элюции (8 М мочевина, 2 М тиомочевина, 10 мМ Трис/HCl, pH 8,0) на шейкере при комнатной температуре в течение 2 ч. Магнитные частицы отделяли от элюата на магнитном штативе. Полученный элюат, содержащий белки-партнёры исследуемого белка, использовали либо для вестерн-блот-анализа, либо для масс-спектрометрического анализа.

Вестерн-блотинг. Клеточный осадок ресуспендировали в буфере Лэммли и прогревали на 95 °С в течение 5 мин, после чего выполняли электрофоретическое разделение белков в камере Mini-Protean (Bio-Rad, США), в 10% акриламидном геле в буферной системе Трис-глицин-SDS. Перенос белков проводили полусухим методом в камере Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, США) на PVDF-мембрану (Bio-Rad, США). Мембрана затем инкубировалась в блокирующем растворе: PBSТ (phosphate-buffered ssaline) + 0,1% Tween-20 + 5% обезжиренное сухое молоко (Bio-Rad, США), после чего происходили инкубация с первичными антителами ночью при +4 °С, последующее промывание мембраны от первичных антител в PBSТ и инкубация с раствором вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, в течение 1 ч при комнатной температуре или при +4 °С в течение ночи. Для визуализации белков использовали Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific, США) и систему визуализации ChemiDoc (Bio-Rad, США).

Подготовка проб для масс-спектрометрии и хроматомасс-спектрометрический анализ триптических пептидов. Подготовка проб для масс-спектрометрии и последующий хроматомасс-спектрометрический анализ триптических пептидов осуществляли по протоколу, описанному в [1]. Для этого при подготовке образцов к масс-спектрометрии после иммунопреципитации к элюатам добавляли ДТТ (дитиотреитол) для восстановления дисульфидных связей, затем алкилировали тиольные группы цистеина йодацетамидом. Затем проводили трипсинолиз с последующими нейтрализацией и обессоливанием образцов. Образцы концентрировали и повторно растворяли для дальнейшего анализа. После этого пептидные фракции подвергали хроматографическому разделению и анализу на масс-спектрометре.

Пептидные фракции после трипсинолиза наносили на колонку (диаметр — 75 мкм, длина — 50 см) с сорбентом Aeris Peptide XB-C18 2,6 мкрМ (Phenomenex, США) в водном растворе, содержащем 3% ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты. Разделение пептидов проводили при помощи хроматографической системы Ultimate 3000 Nano LC (Thermo Fisher Scientific, США), сопряжённой с масс-спектрометром Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific, США) посредством наноэлектроспрея (Thermo Fisher Scientific, США). Пептиды загружали на термостатируемую при 40 °С колонку в буфере А, представляющем собой 0,2% муравьиную кислоту в воде, и элюировали с неё линейным (120 мин) градиентом 4>55% буфера Б, состоящего из 0,1% муравьиной кислоты, 19,9% воды и 80% ацетонитрила, в буфер А при скорости потока 350 нл/мин. Перед каждой новой загрузкой колонку промывали 95% буфером Б в А в течение 5 мин и уравновешивали буфером А в течение 5 мин.

Масс-спектрометрические данные сохраняли при автоматическом переключении между MS1-сканированием и вплоть до 15 MS/MS-сканирований (метод topN). Целевое значение для MS1-сканирования было выставлено 3×106 в диапазоне 300−1200 m/z (отношение массы иона к его заряду) с максимальным временем инжектирования ионов 60 мс и разрешением 60 000. Изолирование ионов-прекурсоров осуществляли при ширине окна 1,4 m/z и фиксированной первой массе 100,0 m/z. Ионы-прекурсоры фрагментировали методом высокоэнергетической диссоциации в ловушке C-trap c нормализованной энергией столкновения 28 эВ. MS/MS-сканы сохраняли c разрешением 15 000 при 400 m/z и при значении 1×105 для целевых ионов в диапазоне 200–2000 m/z с максимальным временем инжекции ионов 30 мс.

Для идентификации и количественного анализа белковых партнёров была использована программа MaxQuant v. 1.5.3.30 с алгоритмом Andromeda против белковой базы данных UniProt Knowledgebase (UniProtKB), таксон human со следующими параметрами: точность определения родительского и дочернего ионов — 20 и 50 ppm (миллионных доль) соответственно, протеаза — трипсин, возможность единственного пропуска сайта трипсинолиза на пептид, возможная модификация окисления метионина, обязательная модификация — карбамидометилирование цистеина. Достоверность идентификации и пептидов, и белков лимитировалась 1% FDR (false discovery rate, ожидаемая доля ложных отклонений) методом Бенджамина–Хохберга, который определяли по подходу target decoy. Для количественного безметочного анализа в программе MaxQuant рассчитывали значения LFQ (label free quantitation, количественная оценка без меток).

Белок считали партнёром TRIM29 или его усечённых форм, если он имеет больше двух пептидов, идентифицированных программой MaxQuant, и отношение количества пептидов в экспериментальном образце к контрольному больше двух. Биологические процессы, в которые были вовлечены белки-партнёры TRIM29 и его усечённых форм, определяли при помощи программы clusterProfiler языка программирования R [12]. Анализ обогащения белков-партнёров белками клеточных компартментов проводили при помощи программы SubcellulaRVis языка программирования R [13].

Поиск альтернативных сплайсинговых событий. Данные секвенирования РНК клеточной линии RWPE-1 с нокдауном TRIM29 и без (GSE204811) были картированы на референсный геном версии hg19 с аннотацией генома gencode v37 при помощи программы STAR [14]. Альтернативные сплайсинговые события были определены при помощи программы rMATS [15]. Событие альтернативного сплайсинга считалось значимым, если FDR <0,05 и абсолютное значение разницы включения между группами сравнения больше 0,1. Визуализацию анализа альтернативного сплайсинга проводили при помощи программного пакета rmats2sashimiplot [15].

Иммуноцитохимический анализ. Фиксацию клеток осуществляли 4% параформальдегидом в течение 30 мин, после чего клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (phosphate-buffered saline, PBS) («ЭКО-Сервис», Россия). Пермеабилизацию клеточной мембраны осуществляли раствором 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин. Далее осуществляли блокировку неспецифических антигенов: клетки промывали раствором 0,1% Tween 20 в PBS три раза по 5 мин, затем инкубировали в блок-растворе (PBS; 0,1% Tween 20; 5% FBS; 5% сыворотка козы) в течение 30 мин. После этого добавляли первичные антитела и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Клетки промывали от первичных антител раствором 0,1% Tween 20 три раза по 5 мин. Затем вносили раствор вторичных антител, помеченных флуорофором Alexa Fluor 555, в PBS и инкубировали в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого клетки промывали от вторичных антител раствором 0,1% Tween 20 три раза по 5 мин. Для окрашивания ядер клеток выполняли инкубацию с DAPI (100 нг/мл) в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре. Затем клетки промывали раствором PBS один раз, удаляли PBS, добавляли глицерин на образец и накрывали его покровным стеклом. Визуализацию окрашенных белков осуществляли на флуоресцентном микроскопе Eclipse Ni-E (Nikon, Япония).

Конфокальная микроскопия. Изображения получены при помощи инвертированного конфокального микроскопа Nikon A1 с объективом Nikon Plan Apo À 40× (NA 0,95) и с использованием программного обеспечения NIS-Elements (Nikon, Япония). Флуоресцентный сигнал от GFP/RFP был получен с помощью лазера с длиной волны 488 и 561 нм соответственно. Сигнал эмиссии GFP/RFP был детектирован в диапазонах 500–550 и 570–620 нм соответственно.

Результаты

Делеция Coiled-Coil-домена TRIM29 значительно снижает количество его белок-белковых партнёров в нормальном базальном эпителии предстательной железы

Для изучения интерактома TRIM29 и его усечённых форм в нормальном базальном эпителии предстательной железы мы использовали клеточные культуры RWPE-1, трансдуцированные лентивирусными частицами для сверхэкспрессии следующих химерных белков: полноразмерный белок TRIM29-FLAG; усечённая форма TRIM29 без региона 1-200 аминокислотной последовательности, содержащего B-Box-домен (dBB-TRIM29-FLAG); усечённая форма TRIM29 без региона 248-352 аминокислотной последовательности, содержащего Coiled-Coil домен (dCC-TRIM29-FLAG) (см. рис. 1, a; рис. 1, b). Интерактомы исследуемых белков были получены при помощи иммунопреципитации с антителами, специфичными к пептиду FLAG, с последующим масс-спектрометрическим анализом преципитата (рис. 1, c). В качестве отрицательного контроля использовали клеточную линию RWPE-1, экспрессирующую gfp. Первое, что мы обнаружили: в преципитате dBB-TRIM29-FLAG присутствует полноразмерный эндогенный TRIM29, который продуцирует клетки линии RWPE-1, а в преципитате dCC-TRIM29-FLAG его нет (см. рис. 1, b, обозначено красной стрелкой). Таким образом, делеция Coiled-Coil-, но не B-Box-домена TRIM29 приводит к нарушению димеризации TRIM29 (см. рис. 1, b).

Для TRIM29-FLAG, dBB-TRIM29-FLAG и dCC-TRIM29-FLAG масс-спектрометрически идентифицировано 288, 288 и 113 белков-партнёров соответственно (приложение 1, рис. 1, d). Из данных видно, что делеция Coiled-Coil-домена приводит к потере способности к димеризации TRIM29. Кроме того, мы наблюдаем сильное снижение количества белковых партнёров TRIM29, в то время как списки белков-партнёров TRIM29-FLAG и dBB-TRIM29-FLAG значимо пересекаются (см. приложение 1). Возможно, такое значимое пересечение списков белков-партнёров TRIM29-FLAG и dBB-TRIM29-FLAG связано с тем, что dBB-TRIM29-FLAG также связывается с эндогенным полноразмерным TRIM29 в нормальном базальном эпителии ПЖ (см. рис. 1, b) и таким образом искажает картину своих белок-белковых взаимодействий.

Влияние функциональных доменов TRIM29 на его локализацию в клетке

Анализ идентифицированных белков показал, что партнёры TRIM29-FLAG и dBB-TRIM29-FLAG значимо представлены в цитоплазме, цитоскелете, рибосомах, клеточном ядре и, что интересно, во внеклеточном матриксе и клеточных везикулах (рис. 2, a, b, верхняя панель). При делеции Coiled-Coil-домена интерактом TRIM29 обедняется на ядерные белки, белки рибосомы и клеточных везикул, а также внеклеточного матрикса (рис. 2, c, верхняя панель). Для подтверждения локализации TRIM29-FLAG мы получили клеточные культуры PC3 (рак предстательной железы без эндогенной экспрессии TRIM29) со сверхэкспрессией TRIM29-FLAG и его усечённых форм и провели иммуноцитохимический анализ с окрашиванием антителами, специфичными к FLAG. Клеточное ядро было окрашено красителем DAPI (рис. 2, нижняя панель). Как видно из рисунка, полноразмерный TRIM29-FLAG локализуется и в цитоплазме, и в ядре, причём по паттерну окраски можно предположить, что в цитоплазме TRIM29-FLAG ассоциирован с белками цитоскелета, что согласуется с результатами других научных коллективов [10] и полученными нашей группой данными иммунопреципитации, согласно которым наибольшее количество идентификаций было обнаружено для белков цитоскелета (филамин, актин, миозин, тропомиозин, тубулин — см. приложение 1). У dBB-TRIM29-FLAG отмечена более диффузная окраска и видно потерю специфичности связывания с цитоскелетом; несмотря на это, многие белки цитоскелета были обнаружены среди его белков-партнёров (рис. 2, b, нижняя панель; см. приложение 1). В случае с dCC-TRIM29-FLAG мы видим равномерное окрашивание клетки, без определённой специфичности к каким-либо компартментам (рис. 2, с, нижняя панель). Таким образом, делеция B-Box- или Coiled-Coil-домена не влияет на транспортировку TRIM29-FLAG в ядро, но без Coiled-Coil-домена TRIM29-FLAG теряет возможность связываться с некоторыми классами ядерных белков, как, например, с гистоном H1 или белками сплайсосомы, что мы видим по результатам масс-спектрометрического анализа (см. приложение 1).

 

Рис. 2. Влияние функциональных доменов белка TRIM29-FLAG на его локализацию в клетке: верхняя панель — расположение белков-партнёров TRIM29-FLAG и его усечённых форм в компартментах клетки; чем интенсивнее окрашивание, тем значимее обогащение интерактома TRIM29-FLAG или его усечённых форм белками соответствующего компартмента; нижняя панель — иммуноцитохимическое окрашивание антителами, специфичными к пептиду FLAG (обозначено красным цветом) клеточной культуры PC3 со сверхэкспрессией TRIM29-FLAG или его усечённых форм; синим цветом окрашены клеточные ядра (DAPI); вертикальные панели соответствуют сверхэкспрессии полноразмерного белка TRIM29-FLAG и его усечённых форм dBB-TRIM29-FLAG и dCC-TRIM29-FLAG; FDR — false discovery rate (ожидаемая доля ложных отклонений), РПЖ — рак предстательной железы.

Fig. 2. Effects of functional TRIM29-FLAG domains on intracellular TRIM29-FLAG localization: Top panel: Localization of TRIM29-FLAG partner proteins and their truncated forms in cell compartments; the more intense the staining, the more significant the enrichment of the TRIM29-FLAG interactome or its truncated forms with proteins of the corresponding compartment; Bottom panel: Immunocytochemical staining with antibodies specific for the FLAG peptide (indicated in red) of PC3 cell cultures overexpressing TRIM29-FLAG or its truncated forms; nuclei are stained blue (DAPI); vertical panels correspond to overexpression of the full-length TRIM29-FLAG protein and its truncated forms of dBB-TRIM29-FLAG and dCC-TRIM29-FLAG; FDR — false discovery rate; PCa — prostate cancer.

 

TRIM29 вовлечён в процесс убиквитинирования белков

Для многих белков семейства TRIM показана E3-убиквитин-лигазная активность за счёт RING-домена [16]. Однако неканонические белки TRIM без убиквитин-лигазного RING-домена (например, TRIM29) также могут участвовать в процессах убиквитинирования за счёт B-Box-домена напрямую или связываясь с другими убиквитин-лигазами [11, 17]. Среди белков-партнёров TRIM29 в нормальном базальном эпителии ПЖ мы обнаружили убиквитин и несколько E3-убиквитин-лигаз, таких как RNF213 и HERC6, которые обладают убиквитин-лигазной активностью за счёт каноничных каталитических доменов RING и HECT (см. приложение 1). Что интересно, делеция B-Box-домена повышает количество убиквитин-лигаз семейства TRIM (TRIM47, TRIM32), связывающихся с TRIM29, но делеция Coiled-Coil-домена, видимо, нарушает гетеродимеризацию TRIM29 с другими E3-убиквитин-лигазами (см. приложение 1). Это подтверждается результатами работы [16], показывающей, что Coiled-Coil-домен необходим для взаимодействия с другими членами семейства TRIM. Среди белков-партнёров полноразмерного TRIM29 нет E1-убиквитинактивирующих ферментов и E2-убиквитинконъюгирующих ферментов, однако с dBB-TRIM29-FLAG связывается E2-убиквитинконъюгирующий фермент UBE2N, который является частью димера UBE2N:UBE2V1, катализирующего лизин-63-связанное-полиубиквитинирование, не приводящее к протеосомальной деградации белков [18]. Обнаружено также, что TRIM29 взаимодействует с деубиквитиназой UPS10, которая регулирует уровень убиквитинирования TP53 и тем самым участвует в клеточном ответе на повреждения ДНК по TP53-зависимому пути [19]. Для того чтобы проверить, как в целом влияет TRIM29 на убиквитинирование белков, мы провели реакцию in vivo убиквитинирования, трансфицировав клеточную линию HEK293 генно-инженерными конструкциями, кодирующими химерные белки FLAG-убиквитин и TRIM29 (см. «Материалы и методы»). После этого была проведена иммунопреципитация белков антителами, специфичными к FLAG. Иммуноблотинг преципитата показал, что в присутствии TRIM29 значительно повышается фракция убиквитинированных белков (рис. 3, a). Это может быть свидетельством как того, что TRIM29 непосредственно убиквитинирует множество белков, так и того, что он выполняет функции скаффолда для других убиквитин-лигаз, которые были обнаружены среди его белков-партнёров (см. приложение 1).

 

Рис. 3. TRIM29 вовлечён в клеточный ответ на стресс: a — in vitro убиквитинирование белков клеточной линии HEK293; вестерн-блот-анализ иммунопреципитата FLAG-убиквитин в отсутствии и присутствии TRIM29; b — тепловая карта, отображающая биологические пути клеточного ответа на вирусную инфекцию, в которые вовлечены белки-партнёры TRIM29-FLAG и его усечённых форм; c — обогащение белков-партнёров TRIM29-FLAG и его усечённых форм белками стрессовых гранул; вертикальная черта — отсечка значимости отношения шансов, точный тест Фишера), которую не должны пересекать доверительные интервалы; d — конфокальная микрофотография клеточной культуры HEK293 со сверхэкспрессией RFP-H1 и GFP-TRIM29 в присутствии TNF-α (+TNF-α, TNF-α — 100 нг/мл, 48 ч) и отсутствии TNF-α (–TNF-α); синим цветом обозначена локализация RFP-H1, розовым — GFP-TRIM29; e — вестерн-блот-анализ иммунопреципитата TRIM29-FLAG с антителами, специфичными к гистону H1, в клеточной линии RWPE-1-TRIM29-FLAG; f — количество фокусов gH2AX в клеточном ядре клеточной линии RWPE-1 без и с нокдауном TRIM29 под действием воспалительного (TNF-α — 100 нг/мл, 48 ч), окислительного (H₂O₂ — 0,1 мкрМ, 48 ч) и генотоксического (доксорубицин — 2 мкрМ, 48 ч) стрессов; ns — нет значимых различий, * p <0,05, *** p <1e–5; ИП — анализируются элюаты эксперимента по иммунопреципитации, ИБ — иммуноблотинг, окрашивание мембраны антителами к белкам интереса, КЛ — клеточный лизат, siTRIM29 — нокдаун TRIM29, siLUC — нокдаун контроль.

Fig. 3. TRIM29 is involved in the cellular response to stress: a: In vitro ubiquitination of proteins of the HEK293 cell line; western blot analysis of the FLAG-ubiquitin immunoprecipitate in the absence and in the presence of TRIM29; b: Heat map of biological pathways of cellular response to viral infection involving partner proteins and truncated forms of TRIM29-FLAG; c: Enrichment of partner proteins and truncated forms of TRIM29-FLAG in stress granule proteins; the vertical bar is the cut-off for the significance of the odds ratio Fisher’s exact test), which should not be crossed by the confidence intervals; d: Confocal microscopy of HEK293 cell culture overexpressing RFP-H1 and GFP-TRIM29 in the presence of TNF-α (+TNF-α; TNF-α, 100 ng/mL, 48 h) and in the absence of TNF-α (–TNF-α); RFP-H1 localization is blue, GFP-TRIM29 localization is pink; e: Western blot analysis of TRIM29-FLAG immunoprecipitate using histone H1 specific antibodies in the RWPE-1 TRIM29-FLAG cell line; f: The number of gH2AX foci in the nucleus of RWPE-1 cell line with and without TRIM29 knockdown affected by inflammatory (TNF-α, 100 ng/mL, 48 h), oxidative (H2O2, 0.1 μM, 48 h) and genotoxic (doxorubicin, 2 μM, 48 h) stress; ns, no significant differences; * p < 0.05; *** p < 1e–5; ИП, immunoprecipitation eluates are evaluated; ИБ, immunoblotting, membrane staining with antibodies against proteins of interest; КЛ, cell lysate; siTRIM29, TRIM29 knockdown, siLUC; knockdown control.

 

Вовлечённость TRIM29 в ответ на различные типы клеточного стресса

При анализе интерактома TRIM29-FLAG мы обнаружили, что TRIM29 вовлечён во многие биологические процессы, связанные с клеточным ответом на различные внешние стрессы. Как было показано в предыдущих исследованиях, TRIM29 вовлечён в процессы клеточного ответа на вирусные инфекции [9, 11, 20] (рис. 3, b). Среди белков-партнёров TRIM29 мы обнаружили другой член семейства TRIM — TRIM14, который является важным участником иммунного ответа на вирусные и бактериальные инфекции [21, 22]. Кроме того, TRIM29 взаимодействует с важным транскрипционным фактором STAT1, который в ответ на действие провоспалительных цитокинов фосфорилируется и активирует экспрессию генов антивирусного ответа [23–25]. Помимо STAT1, TRIM29 взаимодействует с другими интерферон-индуцируемыми белками, такими как IFIT1, IFI16 и EIF2AK2. Что интересно, ни делеция B-Box-домена, ни делеция Coiled-Coil-домена не приводит к полной потере связей с этой группой белков (см. рис. 3, b; см. приложение 1; приложение 2). Следовательно, при полноценном участии в антивирусной активности для TRIM29 могут быть необходимы все его функциональные домены и неструктурированные регионы.

Среди белков-партнёров полноразмерного TRIM29-FLAG были обнаружены белки, участвующие в формировании стрессовых гранул STRESS GRANULE ASSEMBLY по базе данных биологических процессов «генная онтология» (см. приложение 2). Тогда мы сравнили списки белков стрессовых гранул, полученных в процессе изучения формирования стрессовых гранул при тепловом шоке [26], с белками-партнёрами TRIM29. Оказалось, что интерактом как полноразмерного TRIM29-FLAG, так и его усечённых форм значимо обогащён белками стрессовых гранул (рис. 3, c). Однако стоит отметить: такое значимое обогащение может быть связано с тем, что среди белков стрессовых гранул есть белки цитоскелета MYH10, MYO1B, MYO6, TMP1, с которыми TRIM29 связывается. Кроме того, многие РНК-связывающие белки из интерактома TRIM29, такие как HNRNPR, HNRNPD, MATR3, PABPC4, также присутствуют в стрессовых гранулах. Потому непосредственное участие TRIM29 в формировании гранул требует дополнительного изучения.

Отдельный интерес представляет роль TRIM29 в репарации ДНК. Нашей группой уже было показано ранее, что TRIM29 значимо снижает генотоксический эффект воспалительного стресса в раке предстательной железы [1]. При использовании иммунопреципитации TRIM29 из ядерной фракции клеточной линии RWPE-1 и последующем масс-спектрометрическом анализе было обнаружено, что TRIM29 взаимодействует с белками, принадлежащими системе репарации ДНК, включая белки из семейств «эксцизионная репарация нуклеотидов» (RAD23B, CENT2, DDB1), «репарация ошибочно спаренных нуклеотидов» (MSH2, MSH6), а также с белком TP53BP1 из семейства «негомологичного соединения концов» [1, 9]. Кроме того, TRIM29 связывается с гистоном H1, убиквитинирование которого является маркёром репарации ДНК [27] (см. приложение 1). Таким образом, TRIM29 может быть потенциальной E3-убиквитин-лигазой H1 либо E4-лигазой, обеспечивающей взаимодействие другой E3-убиквитин-лигазы с H1. Для исследования колокализации этих двух белков мы сверхэспрессировали химерные белки RFP-H1 и GFP-TRIM29 в клеточной линии HEK293 — генно-инженерных конструкциях pTagRFP-N и pTagGFP2-N соответственно (см. «Материалы и методы»). Красный и зелёный флуоресцентные белки, слитые с H1 и TRIM29 соответственно, позволяют детектировать расположение этих белков в клетке при помощи конфокальной микроскопии. Таким образом, было показано, что при действии воспалительного стресса (TNF-α — 100 нг/мл, 48 ч) колокализация TRIM29 и гистона H1 значимо возрастает (рис. 3, d). Кроме того, мы подтвердили взаимодействие TRIM29 и H1 при помощи иммунопреципитации TRIM29-FLAG с последующим вестерн-блот-анализом преципитата с антителами, специфичными к H1 (рис. 3, e). Мы также показали, что при нокдауне TRIM29 в нормальном базальном эпителии ПЖ под действием воспалительного (TNF-α — 100 нг/мл, 48 ч), окислительного (H₂O₂ — 0,1 мкрМ, 48 ч) и генотоксического (доксорубицин — 2 мкрМ, 48 ч) стресса количество фокусов gH2AX — маркёров повреждения ДНК — значимо возрастает (рис. 3, f). Все описанные выше данные показывают, что TRIM29 является важным участником клеточного ответа на различные стрессы.

TRIM29 — белковый партнёр РНК-связывающих белков

Среди белков-партнёров TRIM29 обнаружено множество белков, участвующих в сплайсинге: таких как FXR1, FXR2, SRSF1, SRSF5, THRAP3, WBP11, HNRNPR, TCERG1, TRA2B, RBMX, PRMT1 (см. приложение 1). Кроме того, по результатам анализа TRIM29 связывается с белками, стабилизирующими и транспортирующими из ядра мРНК, такими как ELAVL1, PRRC2C, PABPC4 (см. приложение 1). При этом сам TRIM29 не обладает известными РНК-связывающими доменами, как, например, TRIM25 из того же семейства [28]. Можно предположить, что TRIM29 может быть вовлечён в регуляцию сплайсинга как один из скаффолдных белков сплайсосомы или как регулятор стабильности сплайсинговых белков. Из данных иммунопреципитации видно, что делеция B-Box-домена TRIM29 не влияет на связывание TRIM29 с белками сплайсосомы, однако делеция Coiled-Coil-домена почти полностью блокирует взаимодействие с РНК-связывающими белками (см. приложения 1 и 2, рис. 4). Для того чтобы проверить влияние TRIM29 на процесс сплайсинга, мы проанализировали данные секвенирования РНК при нокдауне TRIM29 в клеточной линии нормального базального эпителия ПЖ RWPE-1, полученные нашей группой ранее [1]. Действительно, нокдаун TRIM29 приводит к 35 событиям пропуска экзона и 11 событиям сохранения интрона (рис. 5). Что интересно, эти события альтернативного сплайсинга обогащены мотивами РНК-связывающих белков SRSF1, SRSF7, MATR3, PABPC4, FXR1, FXR2, HNRNPL и IGF2BP3, которые связываются с полноразмерным TRIM29-FLAG либо с dBB-TRIM29-FLAG, но не с dCC-TRIM29-FLAG (данные по обогащению РНК-мотивами получены при помощи онлайн-сервиса MAPS2 [29]). Всё вместе это свидетельствует о том, что TRIM29 может быть важной составляющей процессинга РНК.

 

Рис. 4. Тепловая карта, отображающая биологические пути, связанные с процессингом РНК, в которые вовлечены белки-партнёры TRIM29 и его усечённых форм.

Fig. 4. Heatmap shows RNA processing biological pathways enriched with protein partners of TRIM29-FLAG and its truncated forms.

 

Рис. 5. График, отображающий распределение прочтений РНК-секвенирования на транскрипте гена TCEA2: при нокдауне TRIM29 повышается частота удержания интрона. siTRIM29 — нокдаун TRIM29, siCNTR — нокдаун контроль, RPKM — reads per kilobase million (количество прочтений на килобазу на картированные прочтения).

Fig. 5. Heatmap shows RNA processing biological pathways enriched with protein partners of TRIM29-FLAG and its truncated forms. siTRIM29 — knockdown TRIM29, siCNTR — knockdown control, RPKM — reads per kilobase million.

 

Обсуждение

TRIM29 — неканонический белок семейства E3-убиквитин-лигаз TRIM, представленный преимущественно в базальном эпителии, выполняет множество функций, в том числе репарации двуцепочечных разрывов ДНК [9, 30, 31]. Многочисленные функции TRIM29 связаны с его участием в большом количестве регуляторных путей. В ответ на повреждения ДНК TRIM29 взаимодействует с гистонами и рекрутирует такие белки репарации, как MSH2, MSH6, MLH1, BRCA1, ATM, комплекс TIP60, убиквитин-лигазу RNF8 [9, 30], что подтверждается и работой нашей группы [1]. Среди белковых партнёров TRIM29 были обнаружены виментин (маркёр мезодермальных клеток), белок теплового шока 70, рибосомные белки, MARCKS (миристоилированные аланин-богатые субстраты протеинкиназы С, вовлечённые в процессы экзоцитоза) [30, 32]. TRIM29 способен влиять на распределение кератинов в цитоплазме и тем самым изменять форму и подвижность клеток [10]. Кроме того, показано, что TRIM29 взаимодействует с белками клеточного ответа на вирусную инфекцию и как E3-убиквитин-лигаза способствует протеосомальной деградации этих белков [11, 33].

В отличие от других членов своего семейства, TRIM29 не содержит убиквитин-лигазный домен RING и состоит из двух B-Box-доменов типа «цинковые пальцы» и Coiled-Coil-домена. В некоторых работах уже было показано, что B-Box-домены могут выполнять роль убиквитин-лигазного домена [11, 34], а Coiled-Coil-домен часто отвечает за димеризацию белков семейства TRIM [16, 30]. Однако влияние этих доменов на спектр белковых партнёров TRIM29 всё ещё не изучено.

В данной работе мы решили исследовать основные биологические пути, в которые вовлечён полноразмерный TRIM29 и его усечённые формы, без доменов B-Box и Coiled-Coil по отдельности, в нормальном базальном эпителии ПЖ. Оказалось, что делеция Coiled-Coil-домена, но не B-Box-домена, критична для гомодимеризации TRIM29. Масс-спектрометрический анализ полученных иммунопреципитатов показал, что Coiled-Coil-домен обеспечивал большую часть белок-белковых взаимодействий TRIM29, в то время как потеря B-Box-домена сильно не отразилась на количестве белковых партнёров. Coiled-Coil-домен оказался критичен для связывания с ядерными белками, при этом иммуноцитохимический анализ локализации dCC-TRIM29-FLAG в клетке показал, что без Coiled-Coil-домена TRIM29 способен проникать в ядро. Таким образом, Coiled-Coil-домен важен не для локализации TRIM29 в ядре, а для связывания с другими белками, что мы видим из полученных данных.

Полученные данные подтверждают результаты других групп [9, 30], показавших вовлечённость TRIM29 в процессы клеточного ответа на различные стрессовые воздействия. TRIM29 связывается с белками клеточного ответа на вирусную инфекцию и с белками системы репарации ДНК. При этом делеция доменов B-Box или Coiled-Coil не приводит к снижению обогащения этими биологическими путями списков белков-партнёров усечённых форм TRIM29. Мы также подтвердили, что в нормальном базальном эпителии предстательной железы нокдаун TRIM29 приводит к снижению способности клетки проводить репарацию ДНК.

Впервые было показано, что интерактом TRIM29 и его усечённых форм значимо обогащён белками стрессовых гранул. При этом делеция B-Box-домена снижает связывание с белками стрессовых гранул, в отличие делеции Coiled-Coil-домена. Это, по всей вероятности, говорит о том, что в формирование стрессовых гранул TRIM29 может быть вовлечён как E3-убиквитин-лигаза.

Несмотря на отсутствие у TRIM29 канонических убиквитин-лигазных доменов, он является E3-убиквитин-лигазой как минимум для белков NEMO и STRING, вовлечённых в иммунный ответ на вирусные инфекции [11, 35]. В нашем исследовании мы показали, что TRIM29 взаимодействует с широким спектром различных убиквитин-лигаз как из TRIM-семейства, так и из других семейств. Мы также показали, что сверхэкспрессия TRIM29 значимо повышает общий уровень убиквитинирования белков в клеточной линии HEK293. Это подтверждает вовлечённость TRIM29 в регуляцию убиквитинирования, но при этом остаётся вопрос, какие из определённых нами белков-партнёров являются целевыми для TRIM29 как для E3-убиквитин-лигазы.

Анализ интерактома TRIM29 показал, что он является партнёром РНК-связывающих белков, участвующих как в стабилизации РНК, так и в процессе сплайсинга. Мы обнаружили события пропуска экзонов и удержания интронов при нокдауне TRIM29 в нормальном базальном эпителии ПЖ. При этом регионы этих альтернативных сплайсинговых событий обогащены сайтами связывания сплайсосомальных белков, с которыми взаимодействует TRIM29. Что интересно, делеция Coiled-Coil-домена, но не B-Box-домена, полностью элиминирует обогащение интерактома TRIM29 РНК-связывающими белками. Это наводит на мысль о том, что TRIM29 может участвовать в процессинге РНК не как E3-убиквитин-лигаза, а как некий скаффолдный или стабилизирующий белок.

Заключение

Масс-спектрометрический анализ интерактома TRIM29 показал, что в нормальном базальном эпителии ПЖ E3-убиквитин-лигаза TRIM29 связывается с 288 белками, выполняющими широкий спектр функций в различных клеточных компартментах. Эти результаты согласуются с данными других исследовательских групп, показавших, что TRIM29 активно участвует в перестройке цитоскелета, клеточном ответе на вирусную инфекцию и повреждении ДНК. Кроме того, нашей группой впервые продемонстрировано, что TRIM29 взаимодействует с белками стрессовых гранул и РНК-связывающими белками, отвечающими как за стабилизацию мРНК, так и за сплайсинг, а Coiled-Coil-домен TRIM29 играет в этом ключевую роль.

Дополнительная информация

Приложение 1. Результаты масс-спектрометрического анализа данных интерактома TRIM29-FLAG и его усечённых форм. Accession_Number — идентификатор белка в системе Uniprot, Molecular_Weight — молекулярная масса белка, GFP — количество идентификаций пептидов с соответствующего белка в образце со сверхэкспрессией GFP, TRIM29 — количество идентификаций пептидов с соответствующего белка в образце со сверхэкспрессией TRIM29-FLAG, dBB-TRIM29 — количество идентификаций пептидов с соответствующего белка в образце со сверхэкспрессией dBB-TRIM29-FLAG, dCC-TRIM29 — количество идентификаций пептидов с соответствующего белка в образце со сверхэкспрессией dCC-TRIM29-FLAG, Gene_Name — имя гена соответствующего белка, Description — описание белка и его функций.

https://doi.org/10.17816/gc631806-4224384

Приложение 2. Результаты анализа обогащения белков-партнеров TRIM29-FLAG и его усечённых форм биологическими путями из базы данных «Генетическая онтология». Cluster — группа сравнения (образцы со сверхэкспрессией TRIM29-FLAG, dBB-TRIM29-FLAG, dCC-TRIM29-FLAG), ID — идентификатор биологического пути, GeneRatio — сколько белков из пути было обнаружено/сколько всего белков в пути, BgRatio — сколько белков не из пути было обнаружено/сколько всего белков, pvalue — p-value гипергеометрического распределения, p.adjust — p-value после поправки на множественное сравнение (Бенджамина–Хохберга), geneID — список обнаруженных генов из пути, Count — сколько белков из пути было обнаружено.

https://doi.org/10.17816/gc631806-4224385

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда, соглашение 22-75-00129 «Молекулярный механизм регуляции TP63-зависимых транскрипционных сетей через тканеспецифичную убиквитин-лигазу TRIM29. Новые возможности в терапии TP63-зависимых типов рака».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Р.И. Султанов, А.С. Мулюкина — проведение исследования и анализ данных, написание статьи; М.М. Лукина — иммуноцитохимический анализ; В.О. Шендер — подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа; М.А. Лагарькова, Г.П. Арапиди — организация и проведение исследования.

Additional information

Supplement 1. Mass spectrometry of TRIM29 FLAG interactome and its truncated forms. Accession_Number: Uniprot protein identifier, Molecular_Weight: molecular weight of protein, GFP: number of peptide identifications for the corresponding protein in the GFP-overexpressing sample, TRIM29: number of peptide identifications for the corresponding protein in the TRIM29-FLAG-overexpressing sample, dBB-TRIM29: number of peptide identifications for the corresponding protein in dBB-TRIM29-FLAG-overexpressing sample, dCC-TRIM29: number of peptide identifications for the corresponding protein in dCC-TRIM29-FLAG-overexpressing sample, Gene_Name: gene name of the corresponding protein, Description: description of protein and its functions.

https://doi.org/10.17816/gc631806-4224384

Supplement 2. Enrichment analysis of protein partners of TRIM29-FLAG and its truncated forms based on biological processes from the Gene Ontology database. Cluster: comparison group (samples overexpressing TRIM29-FLAG, dBB-TRIM29-FLAG, dCC-TRIM29-FLAG), ID: biological pathway identifier, GeneRatio: number of proteins detected from the pathway / total number of proteins in the pathway, BgRatio: number of proteins not detected from the pathway / total number of proteins, pvalue: p-value of hypergeometric distribution, p.adjust: p-value corrected for multiple comparisons (Benjamin-Hochberg), geneID: list of genes detected from the pathway, Count: number of proteins detected from the pathway.

https://doi.org/10.17816/gc631806-4224385

Funding source. The work was supported by the Russian Science Foundation, agreement N. 22-75-00129 "Molecular mechanism of regulation of TP63-dependent transcriptional networks through tissue-specific ubiquitin ligase TRIM29. New opportunities for the therapy of TP63-dependent types of cancer".

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. R.I. Sultanov, A.S. Mulyukina — conducting research and analyzing data, writing an article; M.M. Lukina — immunocytochemical analysis; V.O. Shender — preparation of samples for mass spectrometry; M.A. Lagarkova, G.P. Arapidi — organization and conduction of research.

Об авторах

Ринат Илгизович Султанов

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства

Автор, ответственный за переписку.
Email: rhenium112@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3918-708X
SPIN-код: 2295-5337

канд. биол. наук

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а

Алина Сергеевна Мулюкина

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства

Email: mulyukina.alina@gmail.com
ORCID iD: 0009-0005-2053-6157
Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а

Виктория Олеговна Шендер

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства; Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: victoria.shender@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9156-2938
SPIN-код: 2868-5902

канд. хим. наук

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а; Москва

Мария Максимовна Лукина

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства

Email: kuznetsova.m.m@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1374-8571
SPIN-код: 5113-0571

канд. биол. наук

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а

Мария Андреевна Лагарькова

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства

Email: lagar@rcpcm.org
ORCID iD: 0000-0001-9594-1134
SPIN-код: 4315-1701

д-р биол. наук, член-корреспондент РАН

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а

Георгий Павлович Арапиди

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства; Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: arapidi@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2323-1859
SPIN-код: 5871-4438

канд. биол. наук

Россия, 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы