Comparison the impact of mesenchymal stromal cells, their microvesicles and plasma enriched with soluble platelet factors on survival and apoptosis of rat spleen lymphocytes in vitro

封面

如何引用文章

全文:

开放存取 开放存取
受限制的访问 ##reader.subscriptionAccessGranted##
受限制的访问 订阅存取

详细

BACKGROUND: The trophic function is one of the important but insufficiently studied features of mesenchymal stromal cells (MSCs), their microvesicles (MVs), and plasma enriched with soluble platelet factors (PRPs), which ensure the viability of target cells.

AIM: To analyze the capability of MSCs, MVs, and PRP to affect the viability and spontaneous and activation-induced apoptosis of rat spleen lymphocytes during culturing in vitro.

MATERIALS AND METHODS: MSCs were isolated from the mononuclear cell fraction of the femoral bone marrow of Wistar rats using the plastic adhesion method. MVs were obtained from the conditioned medium of MSCs by centrifugation at 14,500 g. PRP was prepared by freezing/thawing rat peripheral blood platelet concentrate. Rat spleen lymphocytes were isolated on a density gradient of 1.077 g/cm3. The viability and degree of lymphocyte apoptosis in vitro were assessed by flow cytometry for 7-AAD incorporation and binding to annexin V.

RESULTS: The presence of MSCs at 10 and 20% concentrations caused an increase in the number of living intact and PMA-activated lymphocytes by the end of 3-day in vitro cultivation. Compared with controls, the amount of necrotic cells decreased 8.3–13.5 times, and the number of apoptotic cells decreased 2.3–4.0 times, mainly due to lymphocytes at the late stage of apoptosis. MVs of MSCs at the indicated concentrations did not significantly affect the viability of lymphocytes cultured in vitro but reduced the level of apoptosis of intact and PMA-activated lymphocytes by 3.6 (р=0.03) and 4.8–5.2 (р=0.048; р=0.03) times respectively. Studies have shown that 1.25% rat PRP has a growth-stimulatory activity against MSCs but not against lymphocytes cultured in vitro. In the culture of intact lymphocytes, PRPs did not significantly affect cell viability with a slight decrease (2.7–2.9 fold, p >0.05) in the number of necrotic cells. In the culture of PMA-activated lymphocytes, 1.25–2.50% PRP increased the number of living cells by 1.6–2.2 times (р=0.002; р=0.01) and the number of necrotic cells by two times (р=0.02).

CONCLUSION: MSCs, MVs of MSCs, and PRP, in decreasing order, enhanced the viability of rat spleen lymphocytes and suppressed late apoptosis during in vitro cultivation. Lymphocytes activated by phorbol myristate acetate are more sensitive to their vital action compared with resting cells.

全文:

ВВЕДЕНИЕ

За последние годы регенеративная медицина обогатилась новыми лечебными технологиями, включающими такие клеточные продукты, как мезенхимальные стромальные клетки (МСК) и внеклеточные микровезикулы МСК (МВ МСК), а также плазму, обогащённую растворимыми факторами тромбоцитов (ПОРФТ/PRP) (PRP — platelet-rich plasma) [1–3]. В Российской Федерации МСК относят к биологическим лекарственным препаратам. Их биологическая и терапевтическая значимость связана с доступностью источника получения, а также с установленным в качестве основного противовоспалительным/иммуномодулирующим и регенеративным действием. Данные биопрепараты рассматривают как лечебные средства с «сетевым», но не адресным действием, что предполагает проявление необходимой активности в зависимости от условий in vivo или in vitro. Среди описанных свойств этих биопрепаратов остаётся малоизученной их способность вызывать снижение повреждающего действия патологических процессов на органы и ткани, а также способность подавлять апоптоз клеток сердца, сосудов [4–6], лёгких [7], почек [8], поджелудочной железы [9]. В экспериментах in vitro показана способность МСК (в том числе праймированных) проявлять антиапоптотическое действие в отношении кардиомиоцитов и эндотелиальных клеток [5]. МСК и кондиционированная среда, содержащая МВ МСК, уменьшают апоптоз моноцитов и нейтрофилов [10], снижают уровень индуцированной β-амилоидом или гипоксией смерти нейронов [2]. ПОРФТ/PRP повышает выживаемость и продукцию инсулина β-клетками [9], выживаемость ЛПС- и эрастин-активированных кардиомиоцитов [6], пролиферацию и выживаемость фибробластов различного происхождения [3]. Способность этих биопродуктов поддерживать жизнеспособность органов и тканей проявляется быстро, в течение нескольких часов, и предшествует проявлению других биологических свойств МСК, МВ МСК, ПОРФТ/PRP в течение последующего времени [5]. Общепризнано, что МСК костного мозга (МСК КМ) является стандартным источником клеток для клеточной терапии с использованием МСК.

Цель исследования — провести анализ способности МСК, МВ МСК, ПОРФТ/PRP оказывать влияние на жизнеспособность, спонтанный и активационный апоптоз культивированных in vitro лимфоцитов селезёнки крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работу проводили с крысами линии Wistar обоего пола весом 250–300 г, содержавшимися в соответствии с нормативами индивидуального размещения в виварии Белорусского государственного медицинского университета (БГМУ). Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с международными и разработанными в Республике Беларусь требованиями санитарии и биоэтики. Проведение исследований с участием экспериментальных животных одобрено Комитетом по этике БГМУ (протокол № 8 от 01.02. 2022 г.). Для осуществления забора органов и тканей крыс подвергали эвтаназии путём внутрибрюшинного введения тиопентала натрия в дозе 200 мг/кг веса животного. В стерильных условиях осуществляли забор селезёнки, а также клеток костного мозга из бедренных костей обеих лап.

Получение лимфоцитов селезёнки крысы

Для получения лимфоцитов селезёнку крысы переносили в пробирку, гомогенизировали, ресуспендировали в питательной среде RPMI-1640 (Elabscience, Китай) c 1% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; Gibco, США) с дальнейшим выделением мононуклеарных клеток на градиенте плотности (Гистопак-1077; Sigma, США) в течение 30 мин при 1200 об./мин при комнатной температуре. Мононуклеарную фракцию лимфоцитов собирали, дважды отмывали средой RPMI-1640 c 1% ЭТС, доводили до концентрации 2 млн/мл и использовали для проведения экспериментов in vitro.

Культивирование мезенхимальных стромальных клеток

Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга получали из бедренной кости крыс путём перфузии питательной средой DMEM/F12 (Elabscience, Китай) c 5% ЭТС. Собранную клеточную взвесь отмывали центрифугированием при 1500 об./мин. в течение 20 мин. МСК КМ рассевали в питательной среде DMEM/F12 c 10% ЭТС в культуральных флаконах Т25 (Sarstedt, Германия). После формирования крупных колоний МСК КМ клетки снимали 0,25% трипсином-ЭДТА (Elabscience, Китай), отмывали центрифугированием и высевали в новые культуральные флаконы в концентрации 3000/см2. Клеточную массу МСК КМ наращивали в СО2-инкубаторе (Esco, Сингапур) при +37°С и 5% CO2 до достижения 80% конфлюентного роста в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС и раствора антибиотиков (стрептомицин/пенициллин, Sigma-Aldrich, США). Концентрацию МСК КМ доводили до 200 тыс./мл и использовали в экспериментах in vitro. Культивирование и снятие с ростовой поверхности МСК КМ осуществляли под контролем инвертированного микроскопа Leica DM2500 (Leica Microsystems, Германия) при увеличении ×25. В исследовании использовали МСК 2–3-го пассажей.

Выделение микровезикул мезенхимальных стромальных клеток

Методом дифференциального центрифугирования с подбором различных скоростных режимов центрифугирования, времени и фильтрации в растворе получали МВ МСК [11]. На первом этапе МСК КМ высевали в культуральный флакон Т75 (Sarstedt, Германия) в концентрации 3000/см2 в полную питательную среду DМЕМ/F12 с 10% ЭТС, 2,5 мм L-глютамина и раствора антибиотиков стрептомицина и пенициллина (Capricorn Scientific, Германия). Клетки культивировали в СО2-инкубаторе (Esco, Сингапур) при +37 °С и 5% CO2 до достижения конфлюентности на ростовой поверхности более 90%. На втором этапе для обогащения культуральной среды МВ культуру клеток промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ; Elabscience, Китай) и переводили на бессывороточную среду DМЕМ/F12. Культивирование продолжали в течение 48 ч для создания условий лёгкого клеточного стресса, не вызывающего некротической гибели клеток и способствующего выделению внеклеточных МВ. Третий этап представлял собой непосредственно получение фракции МВ из культуральной жидкости МСК. Полученную кондиционированную среду в количестве 10 мл центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об./мин. при +4 °С для удаления крупных частиц, клеток и клеточного дебриса. Супернатант, содержащий МВ, собирали и осаждали путём центрифугирования в пробирках типа Эппендорф объёмом 1,5 мл при 14 500 g в течение 30 мин при температуре +4 оС (микроцентрифуга MicroCL 21R; Thermo Fisher Scientific, США). Удаляли 2/3 супернатанта, осадки в объёме 250 мкл объединяли в одну пробирку, доводили ФСБ (профильтрованным через фильтры 0,2 мкм) до 1,5 мл и центрифугировали при 14 500 g в течение 30 мин при температуре +4 оС. Удаляли супернатант, оставляя в пробирке 250 мкл осадка, которые объединяли в одну пробирку. Доводили ФСБ до 1,5 мл и центрифугировали в том же режиме. Полученный 10-кратно концентрированный осадок МВ ресуспендировали в 1 мл ФСБ и использовали в экспериментах.

Получение аллогенной плазмы, обогащённой растворимыми факторами тромбоцитов

Для получения аллогенной ПОРФТ/PRP использовали здоровых животных — крыс обоего пола весом 250–300 г. ПОРФТ/PRP получали методом R. Yamaguchi с соавт. [12] в нашей модификации. Эвтаназию животных выполняли с помощью внутрибрюшинного введения тиопентала натрия в дозе 200 мг/кг массы тела. Затем у животных вскрывали грудную клетку и шприцем путём внутрисердечной пункции забирали около 5 мл крови, которую переносили в пробирки с 3,8% цитратом натрия (Merck, Германия). Содержимое пробирок перемешивали, затем центрифугировали при 1000 об./мин в течение 20 мин при комнатной температуре. Собирали плазму и лейкотромбоцитарный слой, объединяли из различных пробирок и центрифугировали повторно при 1500 об./мин в течение также 20 мин. После центрифугирования отбирали верхний слой плазмы так, чтобы количество тромбоцитов в нижней части составило около 2,2×1012/л при подсчёте на гематологическом анализаторе SysmexKX-21N (Sysmex, Япония). Полученный концентрат тромбоцитов (×3,0–3,5 по сравнению с исходным уровнем) замораживали на ночь при –80 оС. Через 1–3 дня пробирку с замороженным концентратом тромбоцитов в плазме размораживали и центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 мин. Супернатант отбирали, стерилизовали через фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, расфасовывали по 0,5 мл в пробирки типа Эппендорф и хранили при –80 оС до использования в экспериментальных исследованиях.

Определение иммунофенотипа мезенхимальных стромальных клеток и их микровезикул

Иммунофенотипическую характеристику полученных МСК КМ проводили методом проточной цитометрии. Принадлежность выделенной популяции клеток к МСК определяли по наличию экспрессии поверхностного маркёра CD90 (Bio-Rad, США) и отсутствию экспрессии CD45 (BD Biosiences, США). Регистрацию и анализ данных выполняли с использованием проточного цитофлуориметра FACSCanto II (Becton Dickinson, США) и программного обеспечения FACSDiva 7.0 (Becton Dickinson, США).

Идентификацию МВ МСК осуществляли также на проточном цитофлуориметре FACSCanto II относительно латексных калибровочных частиц (Becton Dickinson, США) размером 300–1000 нм при усилении чувствительности прибора. Популяцию МВ оценивали после выделения логического «гейта» калибровочных частиц с использованием анализа dot plot по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеиванию. Количество МВ МСК оценивали как количество регистрируемых событий в выделенной области, для каждой пробы анализировали от 100 000 до 200 000 частиц. Принадлежность выделенной фракции МВ к МВ МСК подтверждали экспрессией молекул CD90 и отсутствием экспрессии молекул CD45.

Оценка показателей жизнеспособности и апоптоза лимфоцитов, культивированных in vitro в присутствии мезенхимальных стромальных клеток, их микровезикул и плазмы, обогащённой растворимыми факторами тромбоцитов

Для изучения количества жизнеспособных клеток и клеток на разных стадиях спонтанного апоптоза или апоптоза, индуцированного форбол-миристат-ацетатом (ФМА; Roth, Германия), свежевыделенные лимфоциты селезёнки крыс высевали в полной питательной среде RPMI-1640 (Elabscience, Китай) с добавлением 5% ЭТС в лунки 12-луночного планшета (Corning, США) в конечной концентрации 1 млн/мл и инкубировали при +37 ºС в увлажнённом воздухе с 5% СО2. Контролем служили образцы лимфоцитов, культивированные без внесения биопродуктов — без или с ФМА (50 нг/мл). В качестве дополнительных биопродуктов в культуры интактных или ФМА-индуцированных лимфоцитов вносили: МСК КМ крысы в концентрации 10 или 20% от количества лимфоцитов; МВ МСК — 5 или 10% от объёма инкубационной среды; ПОРФТ/PRP — 0,625; 1,25 и 2,5% от объёма инкубационной среды. Все агенты воздействия вносили в культуру клеток одновременно. Дозы и соотношения вносимых реагентов и клеток устанавливали на основании анализа литературы и предварительной раститровки для обеспечения максимально репрезентативных результатов. По истечении 3-суточного культивирования лимфоциты собирали, переносили в маркированные пробирки, отмывали в холодном ФСБ при 1500 об./мин в течение 5 мин. Затем проводили подсчёт и оценку жизнеспособности клеток с 0,4% трипановым синим («БиолоТ», РФ).

Для определения показателей жизнеспособности и апоптоза клеток использовали набор FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (Becton Dickinson, США) в соответствии с инструкцией производителя. Аналитическую цитометрию производили на проточном цитофлуориметре FACSCanto II с использованием программного обеспечения FACSDiva v. 7.0 (Becton Dickinson, США) после выделения целевых популяций и отсечения клеточных агрегатов и дебриса. Целевые популяции лимфоцитов и МСК идентифицировали по морфологическим показателям исходя из их размера и гранулярности. Для каждого образца анализировали не менее 30 000 событий, степень чистоты — не менее 98%. Оценивали интенсивность флуоресценции annnexin V, конъюгированного с изотиоцианатом флуоресцеина (FITC, FL1, 530 нм), и флуоресценции 7-аминоактиномицина D (7-AAD, FL3, 680 нм). В качестве контроля аутофлуоресценции использовали неокрашенные лимфоциты крыс. Для корректной настройки протокола анализа и учёта использовали отрицательный и положительный контроль апоптоза лимфоцитов. Клетки с фенотипом annexin V–7-AAD– оценивали как жизнеспособные; annexin V–7-AAD+ — как некротические; annnexin V+7-AAD– — как ранние апоптотические; annnexin V+7-AAD+ — как клетки, находящиеся в стадии позднего апоптоза (рис. 1).

 

Рис. 1. Анализ dot plot распределения культивированных в течение 3 сут in vitro лимфоцитов крыс при окрашивании annexin V-FITC и 7-аминоактиномицином D (7-AAD): a — интактных, b — активированных форбол-миристат-ацетатом. Квадрант 1 — клетки в стадии некроза (annexin V–/7-AAD+); 2 — клетки в стадии позднего апоптоза (annexin V+/7-AAD+); 3 — живые клетки (annexin V–/7-AAD–); 4 — ранние апоптотические клетки (annexin V+/7-AAD–).

Fig. 1. Dot plot analysis of the distribution of rat lymphocytes cultured for 3 days in vitro and stained with annexin V-FITC and 7-aminoactinomycin D (7-AAD): a — without phorbol myristate acetate, b — activated with phorbol myristate acetate. Quadrant 1 — necrotic cells (annexin V–/7-AAD+); 2 — late apoptotic cells (annexin V+/7-AAD+); 3 — living cells (annexin V–/7-AAD–); 4 — early apoptotic cells (annexin V+/7-AAD–).

 

Статистическая обработка данных

Статистическую компьютерную обработку полученных данных проводили при помощи пакета программ Excel 2016 (Microsoft, США) и GraphPad Prism 9.3.1.471 (GraphPad, США). Для каждой группы данных определяли нормальность частотного распределения каждого признака. Так как выборки являлись малыми (n <50), проверку осуществляли по критерию Шапиро–Уилка. Поскольку в группах выявлено нормальное распределение, для определения статистической значимости различий уровней жизнеспособности клеток, спонтанного и индуцированного апоптоза (раннего или позднего) при культивировании лимфоцитов крыс в разных условиях применяли t-критерий Стьюдента. Данные в таблицах представлены в виде среднего значения (M) ± стандартное отклонение (SD). Различия считали статистически значимыми при р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

По данным иммунофенотипирования, МСК КМ крыс 2-го пассажа, использованные для экспериментов in vitro, в 94,1–99,9% случаев имели типичный фенотип МСК как CD90+/CD45– клеток. При этом важной особенностью экспериментов in vitro было то, что в условиях культивирования в питательной среде RPMI-1640 с 5% ЭТС к концу совместного культивирования с лимфоцитами крыс через 3 сут суспензионные клетки (лимфоциты) содержали незначительную примесь МСК с жизнеспособностью 0,5–3,1%, поэтому МСК КМ не могли повлиять на результаты оценки жизнеспособности и апоптоза лимфоцитов при использовании метода проточной цитометрии. Жизнеспособные МСК КМ к концу 3-х суток культивирования оставались прикреплёнными ко дну лунки и в анализируемые клеточные популяции не попадали. Количество лимфоцитов крыс во всех пробах колебалось в пределах 640 000–700 000 кл./мл с жизнеспособностью (при оценке с использованием трипанового синего) 55–85%.

Присутствие МСК КМ оказало существенное влияние на жизнеспособность культивированных лимфоцитов. Как видно из табл. 1, внесение в инкубационную среду МСК КМ крыс в концентрации 10 и 20% вызывало статистически значимое повышение количества живых интактных и ФМА-индуцированных лимфоцитов. Существенно, в 8,3–13,5 раза по сравнению с контролем, снизилось количество некротических клеток, в 2,3–4,0 раза — количество апоптотических клеток в культуре лимфоцитов. Важным является то, что снижение количества апоптотических клеток в культурах интактных клеток и активированных ФМА клеток произошло преимущественно за счёт снижения количества лимфоцитов, находящихся в стадии позднего апоптоза. Как видно из табл. 2, относительное количество клеток в стадии позднего апоптоза под действием совместного культивирования с 10 и 20% МСК снизилось соответственно в 2,1 и 4,5 раза в сравнении с интактными лимфоцитами, и в 3,5 и 4,8 раза — в культуре лимфоцитов, активированных ФМА. При этом присутствие МСК КМ практически не влияло на количество в культуре лимфоцитов, находящихся в стадии раннего апоптоза.

 

Таблица 1. Влияние мезенхимальных стромальных клеток на жизнеспособность культивированных in vitro лимфоцитов селезёнки крысы, M±SD

Table 1. Effect of mesenchymal stromal cells on the viability of rat spleen lymphocytes cultured in vitro (M±SD)

Лимфоциты

Фракции лимфоцитов (n=6), %

некроз

апоптоз

живые

Интактные

Контроль*

32,4±8,1

29,3±4,1

57,2±15,9

+ МСК 10%

2,7±0,7 (p=0,007)

11,4±3,7 (p=0,03)

81,4±8,0 (p=0,03)

+ МСК 20%

2,4±0,8 (p=0,006)

8,9±2,6 (p=0,006)

77,1±13,0

ФМА-индуцированные

Контроль*

28,5±2,4

42,7±6,9

57,3±7,5

+ МСК 10%

3,2±0,4 (p=0,00003)

17,8±6,3 (p=0,03)

73,2±9,1 (p=0,03)

+ МСК 20%

3,4±1,9 (p=0,00005)

10,6±5,2 (p=0,02)

74,1±15,0

* контроль — мезенхимальные стромальные клетки (МСК) не вносили. Здесь и в табл. 2–5: ФМА — форбол-миристат-ацетат.

* control — mesenchymal stromal cells (МСК) were not added. Here and in Tables 2–5: ФМА — phorbol myristate acetate.

 

Таблица 2. Влияние мезенхимальных стромальных клеток на апоптоз культивированных in vitro лимфоцитов селезёнки крысы, M±SD

Table 2. Effect of mesenchymal stromal cells on the apoptosis of rat spleen lymphocytes cultured in vitro (M±SD)

Лимфоциты

Фракции лимфоцитов (n=6), %

апоптоз ранний

апоптоз поздний

Интактные

Контроль*

1,4±0,8

20,2±5,6

+ МСК 10%

4,6±3,6

9,6±4,2

+ МСК 20%

4,0±2,1

4,5±3,6 (p=0,005)

ФМА-индуцированные

Контроль*

2,6±0,6

44,4±4,2

+ МСК 10%

4,2±3,2

12,8±6,2 (p=0,0008)

+ МСК 20%

4,4±2,8

9,0±2,0 (p=0,0007)

* контроль — мезенхимальные стромальные клетки (МСК) не вносили.

* control — mesenchymal stromal cells (МСК) were not added.

 

Результаты оценки влияния МВ МСК на жизнеспособность крысиных лимфоцитов, культивированных без или в присутствии ФМА, представлены в табл. 3. Исходя из полученных данных, использованные концентрации МВ МСК не оказывали существенного эффекта на показатели жизнеспособности лимфоцитов, культивированных in vitro. В то же время установлено, что присутствие МВ МСК снижает уровень апоптоза культивированных лимфоцитов. Как видно из табл. 4, количество лимфоцитов (интактных или ФМА-индуцированных) в стадии раннего апоптоза практически не изменялось в присутствии 5 и 10% МВ МСК. В то же время количество интактных лимфоцитов в стадии позднего апоптоза снижалось в присутствии 5 и 10% МВ МСК в 1,5 (р >0,05) и 3,6 (р=0,03) раза соответственно. Эффект МВ МСК был более выражен в культурах ФМА-активированных лимфоцитов: в присутствии 5 и 10% МВ МСК количество активированных лимфоцитов в стадии позднего апоптоза статистически значимо снижалось — в 4,75 и 5,20 раза соответственно.

 

Таблица 3. Влияние микровезикул мезенхимальных стромальных клеток на жизнеспособность культивированных in vitro лимфоцитов селезёнки крысы, M±SD

Table 3. Effect of extracellular vesicles of mesenchymal stromal cells on the viability of rat spleen lymphocytes cultured in vitro (M±SD)

Лимфоциты

Фракции лимфоцитов, n=6

некроз

апоптоз

живые

Интактные

Контроль*

27,8±11,2

26,3±6,2

60,5±15,4

+ МВ МСК 5%

25,9±13,0

26,4±7,8

64,3±7,9

+ МВ МСК 10%

19,9±10,6

25,5±6,7

71,6±5,0

ФМА-индуцированные

Контроль*

24,8±7,6

38,8±11,6

60,7±3,3

+ МВ МСК 5%

21,7±12,8

31,3±8,7

63,1±3,9

+ МВ МСК 10%

14,6±7,2

30,5±10,2

65,9±5,6

* контроль — микровезикулы мезенхимальных стромальных клеток (МВ МСК) не вносили.

* control — microvesicles of mesenchymal stromal cells (МВ МСК) were not added.

 

Таблица 4. Влияние микровезикул мезенхимальных стромальных клеток на апоптоз культивированных in vitro лимфоцитов селезёнки крысы, M±SD

Table 4. Effect of extracellular vesicles of mesenchymal stromal cells on the apoptosis of rat spleen lymphocytes cultured in vitro (M±SD)

Лимфоциты

Фракции лимфоцитов (n=8), %

апоптоз ранний

поздний апоптоз

Интактные

Контроль*

7,6±8,6

21,3±6,3

+ МВ МСК 5%

11,0±8,3

14,5±5,9

+ МВ МСК 10%

9,5±8,0

5,9±4,5 (p=0,03)

ФМА-индуцированные

Контроль*

9,6±9,5

36,1±13,7

+ МВ МСК 5%

13,5±9,9

7,6±5,1 (p=0,048)

+ МВ МСК 10%

9,8±6,1

6,9±5,1 (p=0,03)

* контроль — микровезикулы мезенхимальных стромальных клеток (МВ МСК) не вносили.

* control — microvesicles of mesenchymal stromal cells (МВ МСК) were not added.

 

Нами также была изучена ПОРФТ/PRP, обладающая широким спектром терапевтического действия в регенеративной медицине, в отработанной экспериментальной модели оценки антиапоптотического действия на культивируемые МСК и лимфоциты крысы. Сравнительные эксперименты показали, что крысиная ПОРФТ/PRP в концентрации 1,25% обладает рост-стимулирующим действием в отношении МСК, но не лимфоцитов, культивированных in vitro (рис. 2).

 

Рис. 2. Различная способность плазмы, обогащённой растворимыми факторами тромбоцитов (ПОРФТ/PRP), вызывать пролиферацию (a) мезенхимальных стромальных клеток (n=4) и (b) лимфоцитов селезёнки крыс (n=4). В лунки культур клеток исходно высевали 9000 МСК/мл (МСК) или 2 000 000 лимфоцитов/мл (Лимф); * р=0,025 по отношению к контролю МСК.

Fig. 2. Differential ability of platelet rich plasma (PRP) to induce proliferation of (a) mesenchymal stromal cells (n=4) and (b) rat spleen lymphocytes (n=4). Cell culture wells were initially seeded with 9,000 MSC/ml (МСК) or 2,000,000 lymphocytes/ml (Лимф); * p=0.025 relative to control MSC.

 

Оценка антиапоптотического действия ПОРФТ/PRP на лимфоциты при культивировании in vitro показала, что в культуре интактных лимфоцитов ПОРФТ/PRP не оказывала существенного влияния на жизнеспособность клеток при некотором снижении (в 2,7–2,9 раза, p >0,05) количества некротических клеток (табл. 5). В то же время внесение в культуру ФМА-активированных крысиных лимфоцитов 1,25–2,50% ПОРФТ/PRP обеспечивало повышение количества живых клеток в 1,6–2,2 раза (р=0,002 и р=0,01), при этом значительно снизилось количество клеток в стадии некроза (более чем в 2 раза, р=0,02).

 

Таблица 5. Влияние присутствия плазмы, обогащённой растворимыми факторами тромбоцитов, на жизнеспособность культивированных in vitro лимфоцитов селезёнки крысы, M±SD

Table 5. Effect of the presence of PRP on the viability of rat splenic lymphocytes cultured in vitro (M±SD)

Лимфоциты

Фракции лимфоцитов (%), n=6

некроз

апоптоз

живые

Интактные

Контроль*

30,2±11,5

33,7±9,1

43,4±4,7

+ ПОРФТ/PRP 1,25%

10,4±4,5

39,3±9,3

47,8±7,7

+ ПОРФТ/PRP 2,5%

11,3±9,5

34,5±10,6

51,7±4,0

ФМА-индуцированные

Контроль*

27,2±1,2

48,4±8,4

24,0±5,0

+ ПОРФТ/PRP 1,25%

13,3±8,8

(p=0,02)

43,3±8,6

54,0±7,7

(p=0,002)

+ ПОРФТ/PRP 2,5%

12,7±9,7

45,5±12,9

39,8±7,3

(p=0,01)

* контроль — ПОРФТ/PRP (плазму, обогащённую растворимыми факторами тромбоцитов) не вносили.

* control — PRP (platelet-rich plasma) was not added.

 

Проведённая дополнительно оценка апоптоза лимфоцитов не выявила статистически значимого стимулирующего или угнетающего действия ПОРФТ/PRP в концентрациях 1,25 и 2,50% на распределение стадий раннего и позднего апоптоза интактных и ФМА-активированных лимфоцитов (n=8, данные не представлены).

ОБСУЖДЕНИЕ

Мезенхимальные стромальные клетки, относящиеся к негемопоэтическим клеткам, обладают регенеративным действием в отношении многих тканей, а также модулирующим действием в отношении иммунной системы [4, 5, 7, 10]. При этом трофическая функция МСК рассматривается как одна из основных на ранних этапах воздействия на другие клетки [13–15]. Иммуномодулирующее действие МСК опосредовано механизмами, связанными с перестройкой в иммунной системе реципиента и индукцией M2, Th2, T-регуляторных клеток [4, 14–16]. Из них терапевтически значимыми оказались эффекты МСК, проявлявшиеся прежде всего иммуносупрессией реакций Т-, В-лимфоцитов, ЕК-клеток (ЕК — естественные киллеры), моноцитов и нейтрофилов [17, 18]. Клиническое использование МСК, оказывающих пролонгированный эффект в течение 6–12 мес, свидетельствует о вовлечении иммунной системы, обладающей длительной иммунологической памятью. Выживание клеток в ходе перестройки иммунной системы становится первейшей задачей, решаемой при применении МСК, их дериватов или ПОРФТ/PRP. Клетки иммунной системы в условиях патологического процесса находятся в состоянии активационного стресса, что повышает вероятность их гибели [7, 19]. При этом функция МСК по регулированию и предотвращению клеточной смерти включена в перечень шести основных функций, имеющих терапевтическое значение. Регулируемая клеточная смерть в основном представлена апоптозом, некроптозом, пироптозом клеток-мишеней, в отношении которых МСК оказывают витальное действие путём секреции паракринных факторов, регулирования обмена ионов Са2+, митохондриального переноса, переноса биоактивных микроРНК и белков посредством внеклеточных везикул при преимущественно межклеточных контактах [20]. Установление факта воздействия МСК на снижение количества некротических клеток, а среди апоптотических — клеток в стадии позднего апоптоза, является тем элементом новизны, который отличает настоящую работу от ранее выполненных. Проведённые исследования in vitro показали, что МСК (и их культуральная среда, содержащая МВ) способны в большей степени повышать жизнеспособность активированных клеток при их сокультивировании, и в меньшей степени оказывать витальное действие на клетки, находящиеся в состоянии покоя [21–24]. Способность МСК потенциировать выживание лимфоидных клеток связывают чаще с прямыми межклеточными контактами. Эта способность зависит от соотношения МСК и лимфоидных клеток [22, 24]. При этом даже межклеточные взаимодействия связаны с продуцируемыми МСК цитокинами, хемокинами, ростовыми факторами. В качестве таких факторов выступают SDF-1, HGF, IGF-1, EGF, NGF, TGF-α, bFGF, STC-1, SFRP1, SFRP2, GM-CSF, VEGF, TGF-β, IL-6, IL-10 [10, 18, 20, 25]. Эффект растворимых факторов, содержащихся в культуральной среде МСК или во фракции МВ МСК, в отношении живых лимфоидных клеток слабее (или отсутствует) по сравнению с МСК [22, 26]. В наших исследованиях с культивированными лимфоцитами крыс присутствие МСК в соотношениях 1:5–1:10 привело к значительному росту количества жизнеспособных клеток, особенно в условиях активации лимфоцитов с помощью ФМА. Витальное действие МВ МСК как продуктов, выделяемых МСК в процессе жизнедеятельности, активации, старения или смерти, в наших исследованиях наблюдалось только в отношении лимфоцитов, находящихся в стадии позднего апоптоза [26]. Витальное действие МСК может быть связано как с ингибицией апоптоза (подавлением экспрессии Fas-рецептора), так и с другими механизмами (повышением экспрессии ICAM-1 в лимфоцитах и МСК при отсутствии влияния на экспрессию Bcl-2 в лимфоцитах, повышением экспрессии IL-6 в МСК) [21, 22, 24, 27]. Поэтому нами было оценено антиапоптотическое действие МСК и МВ МСК в качестве одного из механизмов витального действия МСК. В результате показано, что как МСК, так и МВ МСК очевидно подавляют апоптоз лимфоцитов, при этом наиболее важным оказалось снижение количества клеток, находящихся в стадии позднего (необратимого) апоптоза, но не раннего апоптоза, что рассматривалось в качестве самостоятельно регулируемых процессов [28, 29]. Это действие для МСК (и МВ МСК) является наиболее существенным в обеспечении пролонгирования жизни и функциональной активности лимфоидных клеток, что мы рассматриваем впервые в данном исследовании.

В работах [30, 31] показано, что ПОРФТ/PRP хорошо известна как биокомпонент с выраженным регенеративным действием, способствующий пролиферации МСК in vitro. ПОРФТ/PRP в экспериментальных условиях хорошо поддерживала жизнеспособность кардиомиоцитов мышей, особенно в условиях кислородного взрыва, вызванного бактериальным липополисахаридом, или эрастин-индуцированного ферроптоза [6], а также клеток поджелудочной железы, продуцирующих инсулин [9]. В настоящей работе показано, что ПОРФТ/PRP обладала витальным (снижение процента некротических клеток) и рост-стимулирующим действием в отношении МСК, но не лимфоидных клеток крыс. При оценке влияния на жизнеспособность лимфоцитов ПОРФТ/PRP (в оптимальной концентрации 1,25%) оказывала в культуре ФМА-активированных, но не покоящихся лимфоцитов витальное действие, которое проявлялось снижением количества некротических клеток и повышением — жизнеспособных клеток. При этом нами не выявлено протективного влияния ПОРФТ/PRP на апоптотическую гибель лимфоцитов крыс при культивировании in vitro.

Таким образом, нами в экспериментах in vitro показано, что МСК КМ обладают выраженной способностью поддерживать жизнеспособность лимфоидных клеток, в большей степени — активированных лимфоцитов. МВ МСК и ПОРФТ/PRP обладают способностью поддерживать жизнеспособность лимфоцитов, культивированных in vitro, при этом воздействуют на различные механизмы апоптотической и неапоптотической гибели клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В исследованиях in vitro установлено, что внесение в культуру лимфоцитов крыс МСК КМ костного мозга в концентрации 10 и 20% вызывало повышение жизнеспособности лимфоцитов, при этом снижалось количество клеток, находящихся в стадии позднего апоптоза (в 2,1–4,8 раза) и некроза (в 8,3–13,5 раза). Микровезикулы МСК не оказывали существенного эффекта на жизнеспособность исследованных клеток, но статистически значимо снижали количество лимфоцитов селезёнки крыс в стадии позднего апоптоза — в 3,6–5,2 раза. ПОРФТ/PRP не оказывала существенного влияния на жизнеспособность интактных лимфоцитов крыс, но обеспечивала повышение жизнеспособности ФМА-активированных лимфоцитов в 1,6–2,2 раза, при этом в 2,0 раза снижалось количество некротических клеток.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке гранта № 20220724 Министерства здравоохранения Республики Беларусь.

Конфликт интересов. У авторов отсутствует конфликт интересов, связанный с публикацией данной статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: О.В. Клименкова — экспериментальные процедуры, биоинформационный анализ данных, написание текста; М.П. Потапнев — сбор и анализ литературных источников и редактирование статьи; Н.В. Гончарова — экспериментальные процедуры, биоинформационный анализ данных, написание статьи; О.А. Куделич — экспериментальные процедуры, написание статьи; Г.Г. Кондратенко — обзор литературы, редактирование статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This work was supported by the grant No. 20220724 of Ministry of Health the Republic of Belarus.

Competing interests. The authors declare that they have no conflict of interest related to publication of this article.

Authors’ contribution. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication). The greatest contribution is distributed as follows: O.V. Klimenkova — experimental procedures, bioinformatics data analysis, writing of the text; M P. Potapnev — collection and analysis of literature sources, editing the article; N.V. Goncharova — experimental procedures, bioinformatics data analysis, writing of the text; O.A. Kudelich — experimental procedures, writing of the text; G.G. Kondratenko — literature review, editing the article.

×

作者简介

Oksana Klimenkova

Republican Scientific and Practical Center of Transfusiology and Medical Biotechnologies

Email: oks.klimenkovaaa@yandex.by
ORCID iD: 0009-0001-1651-4298
SPIN 代码: 2802-5300
Scopus 作者 ID: 58958361800
白俄罗斯, Minsk

Michael Potapnev

Republican Scientific and Practical Center of Transfusiology and Medical Biotechnologies

编辑信件的主要联系方式.
Email: mpotapnev@yandex.by
ORCID iD: 0000-0002-6805-1782
SPIN 代码: 5379-2168
Scopus 作者 ID: 7004113745
Researcher ID: CAE-9862-2022

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

白俄罗斯, Minsk

Natalia Goncharova

Republican Scientific and Practical Center of Transfusiology and Medical Biotechnologies

Email: ksju2006@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8143-4518
SPIN 代码: 2713-8210
Scopus 作者 ID: 13609104100
Researcher ID: KHY-5166-2024
白俄罗斯, Minsk

Oleg Kudelich

Belarusian State Medical University

Email: kudelichsurg@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0569-3427
SPIN 代码: 7410-1760
Scopus 作者 ID: 56298325500

MD, Cand. Sci. (Medicine), Associate Professor

白俄罗斯, Minsk

Gennady Kondratenko

Belarusian State Medical University

Email: gkondrat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5295-1068
SPIN 代码: 4561-2842
Scopus 作者 ID: 7003786327

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

白俄罗斯, Minsk

参考

  1. Samadi P, Saki S, Manoochehri H, Sheykhhasan M. Therapeutic applications of mesenchymal stem cells: a comprehensive review. Curr Stem Cell Res Ther. 2021;16(3):323–353. doi: 10.2174/1574888X15666200914142709
  2. Gowen A, Shahjin F, Chand S, et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: challenges in clinical applications. Front Cell Dev Biol. 2020;8:149. doi: 10.3389/fcell.2020.00149
  3. Giusti I, D’Ascenzo S, Macchiarelli G, et al. In vitro evidence supporting applications of platelet derivatives in regenerative medicine. Blood Transfus. 2020;18(2):117–129. doi: 10.2450/2019.0164-19
  4. Fan XL, Zhang Y, Li X, Fu QL. Mechanisms underlying the protective effects of mesenchymal stem cell-based therapy. Cell Mol Life Sci. 2020;77(14):2771–2794. doi: 10.1007/s00018-020-03454-6
  5. Sarre C, Contreras-Lopez R, Nernpermpisooth N, et al. PPARβ/δ priming enhances the anti-apoptotic and therapeutic properties of mesenchymal stromal cells in myocardial ischemia-reperfusion injury. Stem Cell Res Ther. 2022;13(1):167. doi: 10.1186/s13287-022-02840-0 Corrected and republished from: Stem Cell Res Ther. 2022;13(1):338. doi: 10.1186/s13287-022-03086-6
  6. Jiao Y, Zhang Q, Zhang J, et al. Platelet-rich plasma ameliorates lipopolysaccharide-induced cardiac injury by inflammation and ferroptosis regulation. Front Pharmacol. 2022;13:1026641. doi: 10.3389/fphar.2022.1026641
  7. Armstrong BBS, Pedroso JCM, Conceição Carvalho JD Jr, Ferreira LM. Mesenchymal stem cells in lung diseases and their potential use in COVID-19 ARDS: A systematized review. Clinics (Sao Paulo). 2023;78:100237. doi: 10.1016/j.clinsp.2023.100237
  8. Kadono M, Nakashima A, Ishiuchi N, et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells cultured in serum-free medium attenuate acute contrast-induced nephropathy by exerting anti-apoptotic effects. Stem Cell Res Ther. 2023;14(1):337. doi: 10.1186/s13287-023-03553-8
  9. Nemati M, Karbalaei N, Mokarram P, Dehghani F. Effects of platelet-rich plasma on the pancreatic islet survival and function, islet transplantation outcome and pancreatic pdx1 and insulin gene expression in streptozotocin-induced diabetic rats. Growth Factors. 2020;38(3-4):137–151. doi: 10.1080/08977194.2021.1881502
  10. Lopes-Pacheco M, Robba C, Rocco PRM, Pelosi P. Current understanding of the therapeutic benefits of mesenchymal stem cells in acute respiratory distress syndrome. Cell Biol Toxicol. 2020;36(1):83–102. doi: 10.1007/s10565-019-09493-5
  11. Markova KL, Kozyreva AR, Gorshkova AA, et al. Methodological approaches to assessing the size and morphology of cell line microvesicles. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2020;(2):129–138. EDN: EJWQSX doi: 10.1007/s10517-020-04934-2
  12. Yamaguchi R, Terashima Н, Yoneyama S, et al. Effects of platelet-rich plasma on intestinal anastomotic healing in rats: PRP concentration is a key factor. J Surg Res. 2012;173(2):258–266. doi: 10.1016/j.jss.2010.10.001
  13. Caplan AI, Dennis JE. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 2006;98(5):1076–1084. doi: 10.1002/jcb.20886
  14. Fu Y, Karbaat L, Wu L, et al. Trophic effects of mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part B Rev. 2017;23(6):515–528. doi: 10.1089/ten.TEB.2016.0365
  15. Samsonraj RM, Raughunath M, Nurcombe V, et al. Concise review: multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem cells Transl Med. 2017;6(12):2173–2185. doi: 10.1002/sctm.17-0129
  16. Zhuan X, Jiang Y, Yang X, et al. Advances of mesenchymal stem cells and their derived extracellular vesicles ass a promising therapy for acute respiratory distress syndrome: from bench to clinic. Front Immunol. 2023;14:1244930. doi: 10.3389/fimmu.2023.1244930
  17. Wang L, ZhaoY, Shi S. Interplay between mesenchymal stem cells and lymphocytes: implications for immunotherapy and tissue regeneration. J Dent Res. 2012;91(11):1003–1010. doi: 10.1177/0022034512460404
  18. Ayala-Cuellar AP, Kang JH, Jeung EB, Choi KC. Roles of mesenchymal stem cells in tissue regeneration and immunomodulation. Biomol Ther (Seoul). 2019;27(1):25–33. doi: 10.4062/biomolther.2017.260
  19. Potapnev MP. Apoptosis of cells of the immune system and its regulation by cytokines. Immunologiya. 2002;23(4):237–243. (In Russ.).
  20. Naji A, Favier B, Deschaseaux F, et al. Mesenchymal stem/stromal cell function in modulating cell death. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):56. doi: 10.1186/s13287-019-1158-4
  21. Benvenuto F, Ferrari S, Gerdoni E, et al. Human mesenchymal stem cells promote survival of T cells in a quiescent state. Stem Cells. 2007;25:1753–1760. doi: 10.1634/stemcells.2007-0068
  22. Xu G, Zhang Y, Zhang L, et al. The role of IL-6 in inhibition of lymphocyte apoptosis by mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007;361(3):745–750. doi: 10.1016/j.bbrc.2007.07.052
  23. Bocelli-Tyndall C, Bracci L, Schaeren S, et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells and chondrocytes promote and/or suppress the in vitor proliferation of lymphocytes stimulated by interleukin 2, 7 and 15. Ann Rheum Dis. 2009;68(8):1352–1359. doi: 10.1136/ard.2008.094003
  24. Rubtsov Y, Goryunov K, Romanov A, et al. Molecular mechanisms of immunomodulation properties of mesenchymal stromal cells: a new insight into the role of ICAM-1. Stem Cells Int. 2017;2017:6516854. doi: 10.1155/2017/6516854
  25. Chang YF, Cheng YH, Ko YC, et al. Anti-apoptotic and autophagic effect: Using conditioned medium from human bone marrow mesenchymal stem cells to treat human trabecular meshwork cells. Regen Ther. 2022;22:50–58. doi: 10.1016/j.reth.2022.12.002
  26. Del Fattore A, Luciano R, Pascucci L, et al. Immunoregulatory effects of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles on T lymphocytes. Cell Transplant. 2015;24(12):2615–2627. doi: 10.3727/096368915X687543
  27. Le Burel S, Thepenier C, Boutin L, et al. Effect of Mesenchymal stromal cells on T cells in a septic context: immunosuppression or immunostimulation? Stem Cells Dev. 2017;26(20):1477–1489. doi: 10.1089/scd.2016.0184
  28. Pizzuti V, Balducelli E, Di Nunzio M, et al. Urine-derived renal epithelial cells isolated after kidney transplant are sensitive to neutrophil gelatinase-associated lipocalin exposure during in vitro culture. Eur J Cell Biol. 2024;103(3):151442. doi: 10.1016/j.ejcb.2024.151442
  29. Nikiforov VS, Blinova EA, Kotikova AI, et al. Transcriptional activity of repair, apoptosis and cell cycle genes (TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, OGG1, XPC, PADI4, MAPK8, NF-KB1, STAT3, GATA3) in chronically exposed persons with different intensity of apoptosis of peripheral blood lymphocytes. Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2022;26(1):50–58. EDN: KBBUEC doi: 10.18699/VJGB-22-08
  30. Ihnatsenko SI, Kosmacheva SM, Potapnev MP, et al. Growth-stimulating activity of platelet preparations in relation to mesenchymal stem cells in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Biological Series [Vescì Nacyânalʹnaj akadèmìì navuk Belarusì. Seryâ bìâlagìčnyh navuk]. 2016;(1):52–58.
  31. Strunk D, Lozano M, Marks DC, et al. International forum on GMP-grade human platelet lysate for cell propagation: summary. Vox Sang. 2018;113(1):80–87. doi: 10.1111/vox.12593

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig. 1. Dot plot analysis of the distribution of rat lymphocytes cultured for 3 days in vitro and stained with annexin V-FITC and 7-aminoactinomycin D (7-AAD): a — without phorbol myristate acetate, b — activated with phorbol myristate acetate. Quadrant 1 — necrotic cells (annexin V–/7-AAD+); 2 — late apoptotic cells (annexin V+/7-AAD+); 3 — living cells (annexin V–/7-AAD–); 4 — early apoptotic cells (annexin V+/7-AAD–).

下载 (505KB)
索引源数据
3. Fig. 2. Differential ability of platelet rich plasma (PRP) to induce proliferation of (a) mesenchymal stromal cells (n=4) and (b) rat spleen lymphocytes (n=4). Cell culture wells were initially seeded with 9,000 MSC/ml (МСК) or 2,000,000 lymphocytes/ml (Лимф); * p=0.025 relative to control MSC.

下载 (264KB)
索引源数据

版权所有 © Eco-Vector, 2024

Creative Commons License
此作品已接受知识共享署名-非商业性使用-禁止演绎 4.0国际许可协议的许可。

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».