Evaluation of the properties of osteogenic gene-activated matrices based on hydrogels impregnated with polyplexes with the BMP2 gene

全文:

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время для эффективной регенерации костной ткани разрабатываются подходы генной терапии, направленные на достижение терапевтических концентраций остеогенных индукторов за счёт высокого уровня экспрессии их генов в резидентных клетках в зоне костного дефекта [1, 2]. В качестве целевого гена перспективно использование эффективного индуктора остеогенеза — костного морфогенетического белка 2 (bone morphogenetic protein 2, BMP-2) [3]. Доставка генов с помощью невирусных векторов является наиболее безопасным способом, который исключает риск возникновения иммунного ответа и инсерционного мутагенеза [4]. Для обеспечения направленной доставки целевых генов в зону костного повреждения и их пролонгированного высвобождения генетические конструкции импрегнируют в биорезорбируемые биосовместимые материалы, получая ген-активированные матриксы [5]. В качестве матриц-носителей векторов для генной терапии костной ткани многообещающим является применение гидрогелей на основе природных полимеров, в том числе белков внеклеточного матрикса [6–8]. Коллаген I типа — основной компонент нативной костной ткани, продукты его деградации могут участвовать в синтезе нового костного матрикса [9]. Материалы на основе коллагена, хотя и имеют хорошую биосовместимость и адгезивные свойства, но обладают недостаточной механической прочностью и высокой скоростью резорбции, что обусловливает введение дополнительных компонентов в состав матрикса [10]. Для формирования более плотного гидрогеля, способного сохранять форму в течение нескольких недель, к коллагену может быть добавлена обогащённая тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma, PRP), широко используемая в регенеративной медицине. Активация тромбоцитов PRP приводит к высвобождению факторов роста (TGF-β, VEGF, PDGF и т.д.), цитокинов и к формированию плотного фибринового сгустка. Волокна фибрина участвуют в поддержании остеокондукции. Продуцируемые тромбоцитами факторы роста стимулируют ангиогенез, миграцию стволовых клеток и способствуют регенерации ткани в месте дефекта [11, 12].

Цель работы — in vitro исследование свойств ген-активированных матриксов на основе коллагена и PRP, импрегнированных полиплексами с геном BMP2.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры

Культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) выделяли из подкожной жировой ткани крыс по ранее разработанной методике [13]. Клетки культивировали в ростовой среде DMEM/F12 («ПанЭко», Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки — ЭТС (PAA Laboratories, США), а также 0,584 мг/мл L-глутамина, 5000 ед./мл пенициллина и 5000 мкг/мл стрептомицина («ПанЭко», Россия), при 37 °С и 5% СО₂. Ростовую среду меняли каждые 3 сут.

Для оценки остеогенных свойств матриксов ММСК культивировали в остеогенной среде DMEM («ПанЭко», Россия), содержащей 10% ЭТС, 0,584 мг/мл L-глутамина; 0,05 мг/мл L-аскорбиновой кислоты и 2,16 мг/мл β-глицерофосфата (Sigma-Aldrich, США); 5000 ед./мл пенициллина и 5000 мкг/мл стрептомицина — при 37 °С и 5% СО₂ в течение 21 сут, заменяя половину объёма среды на свежую каждые 3 сут.

Во всех экспериментах ММСК 3–4-го пассажа инкубировали в присутствии матриксов в 24-луночных планшетах с системой Transwell (диаметр пор — 8 мкм) (SPL Lifesciences, Корея), что позволяет исключить травмирование монослоя клеток при соприкосновении с матриксом. На дно лунок высевали клеточные культуры и через 24 ч в фильтры помещали исследуемый материал.

Получение полиплексов

Для получения полиплексов использовали плазмиды, несущие целевой ген BMP2 (pBMP2; TagRFP-N-BMP2; «Евроген», Россия) и ген зелёного флуоресцентного белка EGFP с высокой интенсивностью эмиссии (pEGFP; pEGFP-C1; Clontech, США). Плазмиды наращивали в клетках Escherichia coli в среде LB Broth (Sigma-Aldrich, США) с 50 мкг/мл канамицина (GRiSP, Португалия) и выделяли с помощью набора реактивов Plasmid Midiprep («Евроген», Россия) по протоколу фирмы-производителя. Затем 40 мкл трансфицирующего агента TurboFect — TF (Thermo Fisher Scientific, США) смешивали с 20 мкг плазмиды, добавляли DPBS («ПанЭко», Россия) до конечного объёма 50 мкл и инкубировали 20 мин при 37 °С для образования полиплексов (TF/pEGFP или TF/pBMP2).

Получение матриксов

Были получены два типа матриксов: матриксы на основе коллагена I типа с добавлением PRP (коллаген/PRP) и матриксы коллаген/PRP, импрегнированные полиплексами (ген-активированные матриксы).

Для выделения PRP кровь крыс собирали в пробирки с цитратом натрия (Greiner Bio-One, Австрия), перемешивали, центрифугировали при 1100 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре, отбирали супернатант, в котором содержится плазма с тромбоцитами и лейкоцитами, центрифугировали при 3600 об./мин в течение 15 мин при комнатной температуре, удаляли половину объёма супернатанта, бедного тромбоцитами, а в оставшемся объёме ресуспендировали осадок. Полученную PRP использовали сразу или хранили при –80 °С в криопробирке без добавления криопротектора.

Для получения матриксов коллаген/PRP-гидрогель на основе коллагена I типа (Intense; «Биофармахолдинг», Россия) смешивали с PRP и по каплям добавляли раствор тромбина (100 NIH; PZ Cormay, Польша) в 10% растворе хлорида кальция («Славянская аптека», Россия) для полимеризации. Соотношение коллагена I типа и PRP составляло 1:2 по объёмным долям.

Для получения ген-активированных матриксов TF/pEGFP-коллаген/PRP или TF/pBMP2-коллаген/PRP полиплексы в объеме 50 мкл смешивали с 50 мкл гидрогеля на основе коллагена I типа и инкубировали в течение 2 ч, затем добавляли 80 мкл PRP и 20 мкл раствора тромбина для гелеобразования.

Оценка цитосовместимости матрикса и его компонентов

Цитотоксичность матрикса коллаген/PRP и его компонентов оценивали через 1 и 7 сут инкубации с ММСК в ростовой среде с помощью МТТ-теста методом флуоресцентной микроскопии. В качестве контроля использовали ММСК, культивируемые в ростовой среде без добавления матрикса и его компонентов.

Для проведения МТТ-теста в лунки планшета добавляли 0,5 мг/мл 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолий бромида (МТТ; «ПанЭко», Россия) и инкубировали 2 ч при 37 °С, визуально контролируя интенсивность окраски. Затем кристаллы формазана элюировали из клеток с помощью ДМСО («ПанЭко», Россия), перемешивая на шейкере в течение 20 мин. Поглощение формазана оценивали, измеряя оптическую плотность элюата на планшетном спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США) при длине волны 570 нм и вычитая фоновое значение при 620 нм.

Для визуализации живых и мёртвых клеток ММСК перед инкубацией с исследуемыми материалами окрашивали РКН26 (red fluorescent cell linker kit; Sigma-Aldrich, США) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя, а затем — флуоресцентным красителем DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole; Biotium, США) в концентрации 5 мкг/мл в течение 10 мин при комнатной температуре для выявления мёртвых клеток и 0,5 мкМ кальцеином AM (Biotium, США) в течение 35 мин при 37 °С — для выявления живых клеток. Анализ проводили с помощью люминесцентного инвертированного микроскопа Axio Observer D1 с камерой AxioCam HRc (Zeiss, Германия).

Анализ трансфицирующей способности полиплексов в составе матриксов

Для оценки кинетики высвобождения плазмидной ДНК матриксы TF/pEGFP-коллаген/PRP инкубировали в физиологическом растворе («ПанЭко», Россия) в течение 25 сут. Концентрацию ДНК определяли методом спектрофотометрии при длине волны 260 нм с помощью спектрофотометра NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific, США).

Матриксы TF/pEGFP-коллаген/PRP добавляли в лунки с ММСК, культивируемыми в ростовой среде, и каждые 3 сут переносили в новые лунки с клетками для оценки трансфицирующей способности полиплексов в составе матриксов на протяжении 14 сут. Клетки, синтезирующие EGFP, выявляли методом флуоресцентной микроскопии с помощью люминесцентного инвертированного микроскопа Axio Observer D1 с камерой AxioCam HRc.

Для количественной оценки эффективности трансфекции клетки снимали с планшетов раствором Версена с добавлением 0,25% трипсина, осаждали центрифугированием при 1200 об./мин в течение 5 мин, исследовали на проточном цитофлуориметре CyFlow Space (Partec, США) и анализировали количество клеток, синтезирующих EGFP, с помощью программы FloMax.

Анализ остеогенных свойств матриксов

Остеогенные свойства матриксов, импрегнированных полиплексами TF/pBMP2 (TF/pBMP2-коллаген/PRP), оценивали через 21 сут культивирования ММСК с матриксами TF/pBMP2-коллаген/PRP по сравнению с ММСК, которые культивировали в присутствии полиплексов TF/pBMP2 без матриксов. В группе контроля ММСК культивировали в остеогенной среде без добавления матриксов и полиплексов.

Экспрессию гена BMP2 и остеогенного маркёра Opn оценивали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green («Евроген», Россия), с предварительным проведением реакции обратной транскрипции. Общую РНК выделяли из клеток по протоколу RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, США), кДНК синтезировали с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК с обратной транскриптазой RevertAid (Thermo Fisher Scientific, США) и полученные значения нормировали относительно генов сравнения Gapdh и Actβ. Праймеры к исследуемым генам приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Последовательность праймеров, используемых в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Ген	Последовательность праймера, 5’→3’
Actβ	For: GAGATTACTGCCCTGGCTCC Rev: GCTCAGTAACAGTCCGCCTA
BMP2	For: ACTACCAGAAACGAGTGGGAA Rev: GCATCTGTTCTCGGAAAACCT
Opn	For: GACGATGACGACGGAGACC Rev: TGGCAGTGAAGGACTCATCA
Gapdh	For: GCGAGATCCCGCTAACATCA Rev: CCCTTCCACGATGCCAAAGT

Примечание: For — прямой праймер, Rev — обратный праймер.

 

Для оценки продукции белка BMP-2, секретируемого ММСК, среду собирали на протяжении всего срока инкубации клеток с исследуемыми матриксами и хранили при –80 °С. Затем все фракции объединяли, белок концентрировали на центрифужных фильтрах Amicon (Merck Millipore, США) и исследовали методом иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов Quantikine ELISA kit (R&D Systems, США) согласно инструкции производителя. Измерения проводили на планшетном спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США).

Для анализа минерализации внеклеточного матрикса клетки фиксировали охлаждённым 70% этанолом в течение 30 мин при 4 °С, окрашивали 2% водным раствором ализаринового красного (Sigma-Aldrich, США) при pH=4,1 в течение 5 мин, дважды промывали дистиллированной водой от несвязавшегося красителя и с помощью световой микроскопии получали изображения клеток.

Статистический анализ

Построение графиков и статистический анализ выполняли в программе SigmaPlot 12.0 (Германия). Все данные представлены как M±SD. Группы сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при вероятности ошибки отклонения от нулевой гипотезы или уровне статистической значимости ниже 5% (p <0,05). При построении столбчатых диаграмм значения, отличавшиеся от контрольных, помечали знаком «*» в соответствии с рекомендациями Американской ассоциации физиологов (APA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Цитосовместимость матрикса и его компонентов

При оценке цитотоксичности матрикса коллаген/PRP, а также каждого его компонента на культуре ММСК показано, что все исследуемые материалы обладают высокой цитосовместимостью: большинство клеток окрашивались кальцеином АМ, а мёртвых клеток, окрашенных DAPI, практически не наблюдалось (рис. 1, а). Количество жизнеспособных клеток через 7 сут инкубации в присутствии PRP и матрикса коллаген/PRP значимо увеличилось по сравнению с контролем и составило 153,5±13,3 и 153,2±16,6% соответственно. При этом для коллагена не выявлено статистически значимых отличий по сравнению с контролем (рис. 1, б). Добавление PRP в состав коллагеновых матриксов позволило повысить прочность гидрогеля и способствовало увеличению пролиферации ММСК за счёт входящих в неё факторов роста. Данные результаты обусловливают преимущество использования матрикса на основе коллаген/PRP для регенеративной медицины.

 

Рис. 1. Оценка цитотоксичности матрикса коллаген/PRP и его компонентов на культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток: а — окрашенных PKH26 (красный цвет); живых клеток, окрашенных кальцеином AM (зелёный цвет); мёртвых клеток, окрашенных DAPI (синий цвет). Флуоресцентная микроскопия: б — относительная жизнеспособность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, МТТ-тест. * p <0,05 (по сравнению с контролем).

 

Трансфицирующая способность полиплексов в составе матриксов TF/pEGFP-коллаген/PRP

Одна из основных проблем терапии с помощью плазмидных конструкций — низкая эффективность трансфекции клеток. Она может быть существенно повышена при использовании поликатионных трансфицирующих агентов, действие которых направлено на снижение удельного заряда плазмиды и её компактизацию [14]. Ранее нами показано, что трансфицирующий агент TF обеспечивает лучшую трансфекцию ММСК жировой ткани по сравнению с Polyethylenimine [15].

Для оценки трансфицирующей способности матриксы импрегнировали полиплексами TF/pEGFP и обнаружили, что включение плазмидных конструкций в гидрогелевые матриксы на основе коллаген/PRP обеспечивает их пролонгированное высвобождение (рис. 2, а). Плазмидные ДНК высвобождались постепенно: 20% выходило в первые 14 сут, а полное высвобождение происходило к 25 сут. Следует отметить, что полиплексы, высвободившиеся из матриксов, способны эффективно трансфицировать ММСК на протяжении всего исследуемого периода (рис. 2, б, в). По результатам проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии показано, что через 14 сут количество трансфицированных клеток увеличилось в 4,7 раза по сравнению с 3 сут. При этом трансфицирующая способность полиплексов TF/pEGFP, импрегнированных в матрикс, сопоставима по количеству трансфицированных клеток с полиплексами без скаффолдов для ММСК жировой ткани [16].

 

Рис. 2. Оценка трансфицирующей способности полиплексов TF/pEGFP в составе матриксов на культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток: а — кинетика высвобождения плазмидной ДНК, спектрофотометрический анализ; б — клетки, трансфицированные TF/pEGFP, фазово-контрастная микроскопия (левый столбик) и флуоресцентная микроскопия (правый столбик); в — количество трансфицированных клеток, проточная цитофлуориметрия.

 

Остеогенные свойства матриксов TF/pBMP2-коллаген/PRP

При культивировании ММСК в присутствии ген-aктивированных матриксов TF/pBMP2-коллаген/PRP было выявлено 25-кратное увеличение продукции BMP-2 по сравнению с контролем через 21 сут. Следует отметить, что эти показатели в 2,4 раза выше, чем в группе, в которой полиплексы TF/pBMP2 добавляли непосредственно к клеткам (рис. 3, а). Полученные результаты свидетельствуют об эффективной трансфекции культур ММСК и высоком уровне экспрессии целевого гена в клетках. Методом ПЦР-РВ показано значительное (в 9,95 раза) увеличение относительной экспрессии гена Opn в культурах ММСК, культивируемых с матриксами TF/pBMP2-коллаген/PRP по сравнению с контролем (рис. 3, б). Кроме того, наблюдалось значительное увеличение минерализации внеклеточного матрикса в присутствии матрикса TF/pBMP2-коллаген/PRP, которая также была выше, чем при добавлении полиплексов TF/pBMP2 (рис. 3, в). Эти данные подтверждают, что в результате трансфекции ММСК инициируется продукция BMP-2 в дозах, достаточных для индукции остеогенной дифференцировки культур клеток, что определяет эффективность разработанных матриксов in vitro.

 

Рис. 3. Оценка остеогенных свойств матриксов TF/pBMP2-коллаген/PRP через 21 сут инкубации с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками: a — уровень продукции BMP-2, иммуноферментный анализ; б — уровень экспресcии гена Opn, ПЦР в режиме реального времени; * p <0,05 (по сравнению с контролем); в — минерализация внеклеточного матрикса мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, окрашивание ализариновым красным.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведённого исследования можно с уверенностью заключить, что разработанные матриксы на основе гидрогеля из коллагена I типа и PRP, импрегнированные полиплексами с геном BMP2, обладают высокой биосовместимостью, способствуют пролонгированному высвобождению плазмидных конструкций и эффективной трансфекции мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, обеспечивая высокий уровень продукции целевого белка BMP-2. Секретируемый трансфицированными клетками BMP-2 индуцирует остеогенную дифференцировку клеток, что подтверждается повышением экспрессии гена остеогенного маркёра Opn и уровня минерализации внеклеточного матрикса. Такие ген-активированные матриксы в перспективе могут быть использованы для генной терапии костной ткани.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России для ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Благодарности. Авторы выражают свою признательность сотрудникам компании ООО «Биофармахолдинг» за предоставление препарата коллагена для исследования.

作者简介

Anastasija Meglei

Research Centre for Medical Genetics; Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery

编辑信件的主要联系方式.
Email: an.megley95@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2970-7176
SPIN 代码: 5569-9070
俄罗斯联邦, Moscow; Moscow

Irina Nedorubova

Research Centre for Medical Genetics

Email: nedorubova.ia@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8472-7116
SPIN 代码: 1548-6998
俄罗斯联邦, Moscow

Victoria Mokrousova

Research Centre for Medical Genetics; Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery

Email: victoria-mok@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3828-8495
SPIN 代码: 6988-4309
俄罗斯联邦, Moscow; Moscow

Victoria Basina

Research Centre for Medical Genetics

Email: vika.basina12@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow

Andrey Vasilyev

Research Centre for Medical Genetics; Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery

Email: vav-stom@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7169-2724
SPIN 代码: 8864-6279

MD, Dr. Sci. (Med.)

俄罗斯联邦, Moscow; Moscow

Oleg Makhnach

Research Centre for Medical Genetics

Email: an.megley95@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2707-8313
SPIN 代码: 1453-9189

Cand. Sci. Chem.

俄罗斯联邦, Moscow

Dmitry Goldshtein

Research Centre for Medical Genetics

Email: dvgoldshtein@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2438-1605
SPIN 代码: 7714-9099

Dr. Sci. (Biol.), Professor

俄罗斯联邦, Moscow

Tatiana Bukharova

Research Centre for Medical Genetics

Email: bukharova-rmt@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0481-256X
SPIN 代码: 2092-5580

Cand. Sci. (Biol.)

俄罗斯联邦, Moscow

参考

补充文件