Создание клона эмбриональных стволовых клеток мышей с кондиционным нокаутом гуманизированного гена Snca
- Авторы: Патраханов Е.А.1, Покровский В.М.1, Карагодина А.Ю.1, Краюшкина А.М.1, Жунусов Н.С.1, Дейкин А.В.1, Корокин М.В.1, Покровский М.В.1, Алтухова О.Б.1
-
Учреждения:
- Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
- Выпуск: Том 10, № 6 (2022)
- Страницы: 525-535
- Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
- URL: https://journals.rcsi.science/2307-9266/article/view/132945
- DOI: https://doi.org/10.19163/2307-9266-2022-10-6-525-535
- ID: 132945
Цитировать
Аннотация
Одним из ключевых молекулярных звеньев в патогенезе болезни Паркинсона является белок α-синуклеин. Накопленные данные свидетельствуют о том, что патогенные мутации в гене Snca ассоциированы с развитием нейродегенеративного повреждения головного мозга, тем самым указывая на актуальность изучения нейробиологической роли α-синуклеина.
Цель. Создание генетически-модифицированного клона стволовых клеток мышей с кондиционным нокаутом гуманизированного α-синуклеина, который может быть использован для реинъекции в мышиные бластоцисты, а также для фундаментальных и прикладных in vitro исследований в области патофизиологии и нейрофармакологии.
Материалы и методы. Для создания мышиных стволовых клеток с кондиционным нокаутом гуманизированного гена Snca был использован прежде полученный клон с фланкированным LoxP-сайтами первым экзоном Snca. Для гуманизации IV и V экзона была использована система CRISPR/Cas9-опосредованной гомологичной рекомбинации с донорными ДНК олигонуклеотидами человеческих сайтов соответствующих генов. Нуклеаза Cas9, гидовые РНК и донорная ДНК были трансфецированы в клетки мыши.
Результаты. Нами был предложен и реализован подход к получению клонов мышиных генетически-модифицированных стволовых клеток, экспрессирующих патологический гуманизированный α-синуклеин. Полученные клоны были высеяны на чашки Петри для размножения и дальнейшего генетического анализа. Был обнаружен клон 126-2F4, несущий необходимые генетические модификации. Результаты проведенного исследования принципиально важны не только для понимания развития патологического процесса при α-синуклеинопатиях, но и, что ещё важнее, для разработки новых терапевтических подходов, которые позволят остановить распространение агрегационной патологии человеческого α-синуклеина по нервной системе и валидации этих подходов в доклинических испытаниях.
Заключение. В результате проведенного исследования разработана стратегия CRISPR/Cas9-ассистированной гомологической рекомбинации в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши для создания полностью гуманизированного гена Snca, кодирующего α-синуклеин. Выполнено редактирование генома клона эмбриональных стволовых клеток мыши с использованием CRISPR технологии. Синтезированы РНК и ДНК олигонуклеотиды, необходимые для создания рибонуклеопротеиновых комплексов, осуществляющих направленную гомологическую рекомбинацию в Snca локусе генома мыши. Разработанный клон клеток может служить для создания линии генетически-модифицированных мышей, служащих тест-системой для патофизиологических и нейрофармакологических исследований, связанных с синуклеинопатиями. При этом до индукции Cre-зависимой рекомбинации данная линия является репрезентативной моделью для исследования биологической роли мутантного Snca. В то же время, после Cre-зависимая активация нокаута позволяет имитировать фармакологическое ингибирование α-синуклеина, что представляет особый интерес для прикладных исследований в нейрофармакологии.
Ключевые слова
Полный текст
Открыть статью на сайте журналаОб авторах
Евгений Александрович Патраханов
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Email: pateval7@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8415-4562
ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85Владимир Михайлович Покровский
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Email: vmpokrovsky08@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3138-2075
ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85Анастасия Юрьевна Карагодина
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Email: karagodina75@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9440-5866
ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85Анастасия Михайловна Краюшкина
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Email: annkrayushkina98@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6830-3820
ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85Никита Сергеевич Жунусов
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Email: nzhunu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1969-3615
ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85Алексей Васильевич Дейкин
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Email: deykin@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0001-9960-0863
кандидат биологических наук, доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85Михаил Викторович Корокин
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Автор, ответственный за переписку.
Email: mkorokin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5402-0697
доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85Михаил Владимирович Покровский
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Email: mpokrovsky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4478-1091
доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии, руководитель НИИ Фармакологии живых систем
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85Оксана Борисовна Алтухова
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Email: altuhova_o@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4674-8797
доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии медицинского института
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85Список литературы
- Checkoway H., Lundin J.I., Kelada S.N. Neurodegenerative diseases // IARC Sci. Publ. – 2011. – P. 407–419.
- Bougea A. Synuclein in neurodegeneration // Adv. Clin. Chem. – 2021. – Vol. 103. – P. 97–134. doi: 10.1016/bs.acc.2020.08.007
- Ozansoy M., Başak A.N. The central theme of Parkinson’s disease: α-synuclein // Mol Neurobiol. – 2013. – Vol. 47, No. 2. – P. 460–465. doi: 10.1007/s12035-012-8369-3
- George J.M. The synucleins // Genome Biol. – 2002. – Vol. 3, No. 1. – Art. ID: 3002. doi: 10.1186/gb-2001-3-1-reviews3002
- Breydo L., Wu J.W., Uversky V.N. Α-synuclein misfolding and Parkinson’s disease // Biochim. Biophys. Acta. – 2012. – Vol. 1822, No. 2. – P. 261–285. doi: 10.1016/j.bbadis.2011.10.002
- Iwai A., Masliah E., Yoshimoto M., Ge N., Flanagan L., de Silva H.A., Kittel A., Saitoh T. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer’s disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system // Neuron. – 1995. – Vol. 14, No. 2. – P. 467–475. doi: 10.1016/0896-6273(95)90302-x
- Lee S.J., Jeon H., Kandror K.V. Alpha-synuclein is localized in a subpopulation of rat brain synaptic vesicles // Acta Neurobiol. Exp. (Wars). – 2008. – Vol. 68, No. 4. – P. 509–515.
- Lashuel H.A., Overk C.R., Oueslati A., Masliah E. The many faces of α-synuclein: from structure and toxicity to therapeutic target // Nat. Rev. Neurosci. – 2013. – Vol. 14, No. 1. – P. 38–48. doi: 10.1038/nrn3406
- Dalfó E., Ferrer I. Alpha-synuclein binding to rab3a in multiple system atrophy // Neurosci. Lett. – 2005. – Vol. 380, No. 1–2. – P. 170–175. doi: 10.1016/j.neulet.2005.01.034
- Burré J., Sharma M., Tsetsenis T., Buchman V., Etherton M.R., Südhof T.C. Alpha-synuclein promotes SNARE-complex assembly in vivo and in vitro // Science. – 2010. – Vol. 329, No. 5999. – P. 1663–1667. doi: 10.1126/science.1195227
- Ninkina N., Connor-Robson N., Ustyugov A.A., Tarasova T.V., Shelkovnikova T.A., Buchman V.L. A novel resource for studying function and dysfunction of α-synuclein: mouse lines for modulation of endogenous Snca gene expression // Sci. Rep. – 2015. – Vol. 5. – Art. ID: 16615. doi: 10.1038/srep16615
- Roman A.Y., Limorenko G., Ustyugov A.A., Tarasova T.V., Lysikova E.A., Buchman V.L., Ninkina N. Generation of mouse lines with conditionally or constitutively inactivated Snca gene and Rosa26-stop-lacZ reporter located in cis on the mouse chromosome 6 // Transgenic Res. – 2017. – Vol. 26, No. 2. – P. 301–307. doi: 10.1007/s11248-016-9995-8
- Chaprov K.D., Lysikova E.A., Teterina E.V., Buchman V.L. Kinetics of alpha-synuclein depletion in three brain regions following conditional pan-neuronal inactivation of the encoding gene (Snca) by tamoxifen-induced Cre-recombination in adult mice // Transgenic Res. – 2021. – Vol. 30, No. 6. – P. 867–873. doi: 10.1007/s11248-021-00286-3
- Krüger R., Kuhn W., Müller T., Woitalla D., Graeber M., Kösel S., Przuntek H., Epplen J.T., Schöls L., Riess O. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson’s disease // Nat. Genet. – 1998. – Vol. 18, No. 2. – P. 106–108. doi: 10.1038/ng0298-106
- Polymeropoulos M.H., Lavedan C., Leroy E., Ide S.E., Dehejia A., Dutra A., Pike B., Root H., Rubenstein J., Boyer R., Stenroos E.S., Chandrasekharappa S., Athanassiadou A., Papapetropoulos T., Johnson W.G., Lazzarini A.M., Duvoisin R.C., Di Iorio G., Golbe L.I., Nussbaum R.L. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease // Science. – 1997. – Vol. 276, No. 5321. – P. 2045–2047. doi: 10.1126/science.276.5321.2045
- Angelova P.R., Choi M.L., Berezhnov A.V., Horrocks M.H., Hughes C.D., De S., Rodrigues M., Yapom R., Little D., Dolt K.S., Kunath T., Devine M.J., Gissen P., Shchepinov M.S., Sylantyev S., Pavlov E.V., Klenerman D., Abramov A.Y., Gandhi S. Alpha synuclein aggregation drives ferroptosis: an interplay of iron, calcium and lipid peroxidation // Cell Death Differ. – 2020. – Vol. 27, No. 10. – P. 2781–2796. doi: 10.1038/s41418-020-0542-z
- Angelova P.R., Horrocks M.H., Klenerman D., Gandhi S., Abramov A.Y., Shchepinov M.S. Lipid peroxidation is essential for α-synuclein-induced cell death // J. Neurochem. – 2015. – Vol. 133, No. 4. – P. 582–589. doi: 10.1111/jnc.13024
- Choi M.L., Chappard A., Singh B.P., Maclachlan C., Rodrigues M., Fedotova E.I., Berezhnov A.V., De S., Peddie C.J., Athauda D., Virdi G.S., Zhang W., Evans J.R., Wernick A.I., Zanjani Z.S., Angelova P.R., Esteras N., Vinokurov A.Y., Morris K., Jeacock K., Tosatto L., Little D., Gissen P., Clarke D.J., Kunath T., Collinson L., Klenerman D., Abramov A.Y., Horrocks M.H., Gandhi S. Pathological structural conversion of α-synuclein at the mitochondria induces neuronal toxicity // Nat. Neurosci. – 2022. – Vol. 25, No. 9. – P. 1134–1148. doi: 10.1038/s41593-022-01140-3. Erratum in: Nat. Neurosci. – 2022. – Vol. 25, No. 11. – Art. ID: 1582.
- Choi M.L., Gandhi S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases // FEBS J. – 2018. – Vol. 285, No. 19. – P. 3631–3644. doi: 10.1111/febs.14587
- Srinivasan E., Chandrasekhar G., Chandrasekar P., Anbarasu K., Vickram A.S., Karunakaran R., Rajasekaran R., Srikumar P.S. Alpha-Synuclein Aggregation in Parkinson’s Disease // Front. Med. (Lausanne). – 2021. – Vol. 8. – Art. ID: 736978. doi: 10.3389/fmed.2021.736978
- Chaprov K.D., Goloborshcheva V.V., Tarasova T.V., Teterina E.V., Korokin M.V., Soldatov V.O., Pokrovskiy M.V., Kucheryanu V.G., Morozov S.G., Ovchinnikov R.K. Increased Expression of the Multimerin-1 Gene in α-Synuclein Knokout Mice // Dokl. Biol. Sci. – 2020. – Vol. 494, No. 1. – P. 260–263. doi: 10.1134/S0012496620050014
- Soldatov V.O., Kubekina M.V., Silaeva Yu.Yu., Bruter A.V., Deykin A.V. On the way from SARS-CoV-sensitive mice to murine COVID-19 model // Research Results in Pharmacology. – 2022. – Vol. 6, No. 2. – P. 1–7. doi: 10.3897/rrpharmacology.6.53633
- Bruter A.V., Korshunova D.S., Kubekina M.V., Sergiev P.V., Kalinina A.A., Ilchuk L.A., Silaeva Y.Y., Korshunov E.N., Soldatov V.O., Deykin A.V. Novel transgenic mice with Cre-dependent co-expression of GFP and human ACE2: a safe tool for study of COVID-19 pathogenesis. Transgenic Res. 2021 Apr 14;30(3):289–301. doi: 10.1007/s11248-021-00249-8. Epub ahead of print.
- Кузубова Е.В., Радченко А.И., Покровский В.М., Патраханов Е.А., Новикова А.А., Степенко Ю.В., Дейкин А.В. Патологические состояния, ассоциированные с белком тау: механизмы развития и возможные биологические мишени для фармакологической коррекции тау-протеинопатии (обзор) // Научные результаты биомедицинских исследований. – 2022. – Т. 8, № 4. – С. 474–797. doi: 10.18413/2658-6533-2022-8-4-0-6
- Dolskiy A.A., Gudymo A.S., Taranov O.S., Grishchenko I.V., Shitik E.M., Prokopov D.Y., Soldatov V.O., Sobolevskaya E.V., Bodnev S.A., Danilchenko N.V., Moiseeva A.A., Torzhkova P.Y., Bulanovich Y.A., Onhonova G.S., Ivleva E.K., Kubekina M.V., Belykh A.E., Tregubchak T.V., Ryzhikov A.B., Gavrilova E.V., Maksyutov R.A., Deykin A.V., Yudkin D.V. The Tissue Distribution of SARS-CoV-2 in Transgenic Mice With Inducible Ubiquitous Expression of hACE2 // Front. Mol. Biosci. – 2022. – Vol. 8. – Art. ID: 821506. doi: 10.3389/fmolb.2021.821506
Дополнительные файлы
