DEVELOPMENT OF CONDITIONS FOR SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF FLAVONOIDS OF CANADIAN GOLDENROD HERB

Full Text

Введение Разработка новых и совершенствование существующих методик контроля качества - одно из перспективных направлений исследований в фармации [11]. Особое внимание привлекает разработка методик количественного определения биологически активных веществ (БАВ) лекарственного растительного сырья (ЛРС) и лекарственных средств растительного происхождения [3, 4]. Основными проблемами при разработке таких методик является то, что необходимо объективно оценить содержание группы БАВ, а не одного индивидуального вещества [1]. Для решения данной задачи перспективным представляется следующий подход: использование спектрофотометрии для количественного определения как основного метода из-за ее доступности и простоты, но при разработке методики базироваться на близости данных, полученных спектрофотометрическим методом, с данными, полученными методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [6]. При этом важным моментом при выборе базовой спектрофотометрической методики является системный подход, основанный на апробации фармакопейных методик определения БАВ на конкретном растительном объекте. Золотарник канадский - сорный вид, широко распространенный на территории Республики Беларусь и Российской Федерации и обладающий ценными фармакологическими свойствами [8]. Заготовку травы данного растения для получения лекарственных препаратов перспективно рассматривать с позиции борьбы с данным сорным видом [7]. Золотарника канадского траву стандартизируют по флавоноидам [12]. Согласно Европейской фармакопее количественное определение флавоноидов золотарника проводят по унифицированной методике: гидролиз до агликонов, спектрофотометрическое определение суммы агликонов с алюминия хлоридом в пересчете на гликозид гиперозид. Недостатками методики являются ее длительность, трудоемкость, большой расход реактивов и то, что нативные флавоноиды золотарника содержат гликозиды [5], которые методика не определяет. Также разработаны методики спектрофотометрического определения флавоноидов золотарника канадского, основанные на реакции с алюминия хлоридом [9, 10]. Однако методики сосредоточены на подборе условий водно-спиртовой экстракции и не проработаны с точки зрения подбора спектрофотометрических параметров (определен только объем и концентрация раствора алюминия хлорида), не установлено влияет ли добавление вспомогательных реагентов на ход протекания реакции, время протекания реакции и др. Поэтому целесообразно провести подбор базовой методики для количественного определения флавоноидов золотарника и разработать условия спектрофотометрического определения. Цель исследования - разработка спектрофотометрических условий количественного определения флавоноидов золотарника канадского травы. Методика Объектом исследования служила золотарника канадского трава, которую заготовили в фазу массового цветения в августе-сентябре 2018-2022 гг. в местах естественного произрастания в окрестностях д. Новое поле (Минский район), д. Ольгово (Витебский район), д. Заречье (Бобруйский район) и высушили воздушно-теневым способом Осуществляли выбор среди следующих фармакопейных методик количественного определения флавоноидов: методика определения суммы флавоноидов календулы цветков в пересчете на рутин или гиперозид. Аналогичная методика (с пересчетом на гиперозид) приводится для следующего ЛРС: березы листья; горца птичьего трава; липы цветки; пустырника трава; хвоща полевого трава [2]; методика определения суммы флавоноидов боярышника листьев и цветков. Данная методика также проводится для фиалки травы, стандартизуют по виолантину; методика определения суммы флавоноидов боярышника листьев; боярышника плодов; бессмертника песчаного цветков; бузины черной цветков; горца перечного травы; дов душицы травы; зверобоя травы; лабазника вязолистного цветков; лапчатки белой травы; многоколосника морщинистого травы; пассифлоры травы, идентична методике определения суммы флавоноидов боярышника листьев и цветков; методика определения суммы флавоноидов сушеницы топяной травы, аналогична методике определения суммы флавоноидов боярышника плодов; методика определения суммы флавоноидов череды травы. Измерения оптической плотности выполнены на спектрофотометре Solar PB 2201 (ЗАО «Солар», Республика Беларусь). Сопоставляли близость результатов, полученных по выше перечисленным спектрофотометрическим методикам, с ВЭЖХ. Выбирали наиболее близкие между собой. Затем модифицировали выбранную методику, адаптируя ее для золотарника канадского травы путем подбора следующих условий спектрофотометрического определения: концентрация раствора алюминия хлорида Р в спирте (70%, об/об) Р; добавляемый объем раствора алюминия хлорида Р в спирте (70%, об/об); объем кислоты уксусной разведенной Р; концентрация раствора гексаметилентетрамина Р; добавляемый объем раствора гексаметилентетрамина Р; длительность протекания реакции. Исследования выполняли поэтапно с учетом вышеуказанной последовательности. Статистическую обработку выполнили при помощи компьютерной программы Microsoft Office Exсel 2016 (пакет «Анализ данных). Каждое испытание выполняли три раза (n = 3; Р = 0,95). Результаты представляли в виде ±, где - среднее; - полуширина доверительного интервала среднего. Результаты исследования и их обсуждение Результаты количественного определения флавоноидов в золотарника канадского траве при помощи фармакопейных методик и максимумы поглощения полученных извлечений представлены в таблице 1. Таблица 1. Результаты определения флавоноидов золотарника по фармакопейным методикам Фармакопейная методика Результаты исследования Объект, для которого используется методика Стандартный образец, используемый в методике λmax, нм Золотарника канадского трава λmax, нм % Календулы цветки гиперозид 425 425 0,82±0,067 Календулы цветки рутин 408 408 1,57±0,123 Боярышника листья и цветки гиперозид 410 410 17,1±1,25 Боярышника листья рутин 409 414 18,4±1,39 Боярышника плоды гиперозид 365 332 0,34±0,040 Бессмертника песчаного цветки рутин 411 406 12,5±0,952 Бузины черной цветки рутин 407 407 8,21±1,00 Горца перечного трава кверцетин 430 408 3,90±0,571 Душицы трава лютеолин 400 408 1,68±0,120 Зверобоя трава рутин 415 403 5,29±0,100 Лабазника вязолистного цветки спиреозид 420 420 5,42±0,490 Лапчатки белой трава рутин 412 407 2,59±0,120 Многоколосника морщинистого трава лютеолин 330 330 9,32±0,625 Пассифлоры трава виолантин 401 401 13,8±1,00 Сушеницы топяной трава гнафалозид А 338 338 0,31±0,028 Череды трава лютеолин-7-гликозид 510 510 7,92±1,00 Из таблицы видно, что для золотарника канадского травы можно выделить три методики с результатами, близкими к ВЭЖХ: бузины черной цветки (8,21%), многоколосника морщинистого трава (9,32%) и череды трава (7,92%). Однако при спектрофотометрии раствора стандартного образца изокверцитрина по методике многоколосника морщинистого травы выявлена низкая оптическая плотность, для извлечения она выше, что указывает на вклад в поглощение извлечения не только флавоноидов, но и других БАВ. При спектрофотометрии раствора изокверцитрина по методике череды травы при характерной длине волны в 510 нм наблюдали низкое поглощение в отличие от извлечения, где оно выше. Данный факт говорит о том, что в реакцию изокверцитрин практически не вступает в отличие от других БАВ. Для извлечения и изокверцитрина по методике бузины черной цветков оптическая плотность входила в оптимальный диапазон от 0,2 до 0,8. При чем в данной методике идет пересчет на изокверцитрин, который доминирует в золотарника канадского траве [5]. Спектры поглощения испытуемого раствора и стандартного образца изокверцитрина, полученные при воспроизведении методики бузины черной листьев, представлены на рис. 2 и 3 соответственно. Рис. 2. Спектр поглощения испытуемого раствора извлечения золотарника канадского травы, полученного при воспроизведении методики бузина черной цветков Рис. 3. Спектр поглощения испытуемого раствора изокверцитрина, полученного при воспроизведении методики бузины черной цветков Из рис. 2 и 3 видно, что максимумы поглощения испытуемого раствора (407±4 нм) и раствора стандартного образца изокверцитрина (407±4 нм) совпадали (р=0,50). Из рис. 4-6 следует, что наибольшие значения оптической плотности характерны для следующих условий спектрофотометрического определения флавоноидов золотарника канадского травы: концентрация раствора алюминия хлорида Р - 50 г/л; добавляемый объем раствора алюминия хлорида Р - 3,0 мл; объём кислоты уксусной разведенной Р - 50 мкл; концентрация раствора гексаметилентетрамина Р - 70 г/л; добавляемый объем раствора гексаметилентетрамина Р - 0,4 мл; длительность протекания реакции - 15-25 мин (среднее 20 мин). Рис. 4. Зависимость оптической плотности от концентрации раствора алюминия хлорида Р (А), от добавляемого объема раствора алюминия хлорида Р (Б) Рис. 5. Зависимость оптической плотности от объема кислоты уксусной разведенной Р (А); от концентрации раствора гексаметилентетрамина Р (Б) Рис. 6. Зависимость оптической плотности от добавляемого объема раствора гексаметилен-тетрамина Р (А); от длительности протекания реакции (Б) Дисперсионный анализ влияния условий спектрофотометрического определения на оптическую плотность показал, что концентрация раствора алюминия хлорида Р (р=0,028); добавляемый объем раствора алюминия хлорида Р (р=0,048); объем кислоты уксусной разведенной Р (р=0,018); концентрация раствора гексаметилентетрамина Р (р=0,020), добавляемый объем раствора гексаметилентетрамина Р (р=0,040) и длительность протекания реакции (р=0,020) статистически значимо влияли на оптическую плотность. Таким образом, количественное определение флавоноидов золотарника канадского травы проводится путем добавления к 2,00 мл извлечения 15 мл спирта (70%, об/об) Р, 50 мкл кислоты уксусной разведенной Р, 3,0 мл раствора 50 г/л алюминия хлорида Р в спирте (70%, об/об) Р, 0,4 мл раствора 70 г/л гексаметилентетрамина Р и доводят спиртом (70%, об/об) Р до объема 50,0 мл. Компенсационный раствор. К 2,00 мл извлечения прибавляют 15 мл спирта (70%, об/об) Р, 50 мкл кислоты уксусной разведенной Р, 0,4 мл раствора 70 г/л гексаметилентетрамина Р и доводят спиртом (70%, об/об) Р до объема 50,0 мл. В среднем через 20 мин. измеряют оптическую плотность испытуемого раствора при 407 нм против компенсационного раствора. Пересчет проводили методом одного стандарта на изокверцитрин. Для стандартного образца изокверцитрина готовили испытуемый раствор как описано выше, добавляя вместо 2,00 мл извлечения 0,500 мл раствора 1 г/л изокверцитрина Р. Компенсационный раствор готовили без добавления алюминия хлорида Р. В фармакопейной методике определения (по Европейской фармакопее) суммы флавоноидов золотарника травы в пересчёте на гиперозид проводят путем трёхкратную экстракции в солянокислой среде при кипении раствора ацетона Р, четырёхкратной очистки этилацетатом Р, что, в итоге, трудоемко и длительно по времени и не позволяет анализировать нативные флавоноиды извлечения, а только продукты их гидролиза - агликоны [12]. При воспроизведении такой методики содержание веществ в 10 раз меньше, чем при использовании модифицированной. Модифицированная методика позволяет снизить расход реактивов (не используют ацетон Р, этилацетат Р, кислоту хлористоводородную Р1, натрия сульфат безводный), уменьшить трудоемкость за счет сокращения операций гидролиза, жидкость-жидкостной экстракции и обезвоживания и сократить время реакции в 1,5 раза. В статьях [9, 10] описаны условия спектрофотометрического определения, несколько отличаются от указанных выше в отношении объема и концентрации раствора алюминия хлорида, что связано с введением в реакционную смесь гексаметилентетрамина для облегчения протекания реакции флавоноидов золотарника с алюминия хлоридом. Введение данного реагента позволяет определять максимально полно нативный комплекс флавоноидов за счет создания слабо щелочной среды, в которой легче протекает реакция комплексообразования. Заключение Таким образом, оптимальными параметрами спектрофотометрического определения флавоноидов золотарника канадского травы являлись: концентрация раствора алюминия хлорида Р - 50 г/л; добавляемый объем раствора алюминия хлорида Р - 3,0 мл; объем кислоты уксусной разведенной Р - 50 мкл; концентрация раствора гексаметилентетрамина Р - 70 г/л; добавляемый объем раствора гексаметилентетрамина Р - 0,4 мл; длительность протекания реакции - 20 мин.

About the authors

R. I Lukashou

Belarusian State Medical University

Email: r_lukashov@mail.ru
кандидат фармацевтических наук, доцент, заведующий кафедрой фармацевтической химии с курсом повышения квалификации и переподготовки кадров учреждения образования «Белорусский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Республики Беларусь 83, Dzerzhinsky Ave., 220083, Minsk, Republic of Belarus

References

Supplementary files