ГИПОКСИЯ ИНДУЦИРОВАННЫЙ ФАКТОР-1 - КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ МАРКЕР СИСТЕМНОГО МЕХАНИЗМА АДАПТАЦИИ К ОСТРОМУ ПСИХОТРАВМИРУЮЩЕМУ РАССТРОЙСТВУ

Полный текст

Введение

Распространенность тяжелых стресс-ассоциированных расстройств имеют сильный разброс: от 13 до 50% респондентов с травматическим опытом, их частота напрямую увеличивается в зоне военных конфликтов и на территории, где ведутся боевые действия [2]. Высокая распространенность стресс-ассоциированных психических расстройств у участников боевых действий обусловлена мощным психотравмирующим воздействием угрожающего жизни характера, сопровождающегося экстремальным стрессом. Среди участников боевых действий в Ираке и Афганистане тяжелая психопатология составила 23% [2]. Отечественная практика, на примере контртеррористической операции на территории Чеченской республики, показала высокий уровень распространенности посттравматических стрессовых расстройств (ПТСР) среди гражданского населения, проживавшего в зоне военного конфликта – 31,2% [4].

Посттравматическое стрессовое расстройство – психическое нарушение, развивающееся вследствие чрезмерного психотравмирующего воздействия угрожающего или катастрофического характера [1]. Основное клиническое проявление – повторение элементов травматического события с чувствами тревоги, паники, вины или безнадежности, стремлением избегать внутренние и внешние стимулы, ассоциирующиеся со стрессором. Расстройство провоцирует развитие персистирующих и сквозных нарушений в аффективной сфере, отношении к самому себе и в социальном функционировании, включая трудности в регуляции эмоций, ощущение себя как униженного, побежденного и ничего не стоящего человека, трудности в поддержании взаимоотношений [9].

Учитывая геополитическую ситуацию в мире, количество военных конфликтов с вовлечением мирного населения не уменьшается и, соответственно, ожидать снижения распространения психопатий военного времени не представляется возможным. Существуют определённые трудности и неоднозначность объективизации диагноза ПТСР: наблюдается разнообразие подходов к клиническому пониманию ПТСР, что обусловлено рядом фундаментальных позиций, лежащих в основе различных авторских концепций [1]. Среди них можно выделить следующие ключевые вопросы: новизна диагностических критериев ПТСР в контексте учения о психогениях, клиническая выраженность ПТСР: моно- или полисимптомный характер, статус ПТСР: самостоятельное нозологическое образование или стадия единого патологического процесса, совместное течение ПТСР с другими психическими расстройствами (коморбидность).

Диагноз ПТСР в основном устанавливается на основе клинического обследования. Врач собирает информацию о жалобах пациента, изучает анамнез заболевания и оценивает его психическое состояние. Типичными жалобами пациентов являются: воспоминания о травмирующей ситуации: повторяющиеся, неконтролируемые и навязчивые переживания психотравмирующего события, сопровождающиеся страхом или ужасом, ночные кошмары: сновидения, содержащие элементы травматического опыта, повышенная бдительность, опасение и готовность к опасности, стремление избежать любых напоминаний о психотравмирующем событии, мыслей и воспоминаний о нём. Это может включать избегание определённых видов деятельности, ситуаций или людей, которые вызывают ассоциации с травмой.

В настоящее время отсутствуют лабораторные или инструментальные методы диагностики ПТСР. Основная задача таких методов – исключение соматических заболеваний, которые могут проявляться симптомами, схожими с ПТСР.

С XIX в. в клинической медицине известны острые и кратковременные расстройства, ассоциированные со стрессом. Эти психотические расстройства представляют собой гетерогенную и до сих пор дискуссионную группу. Составители МКБ-10 отмечают отсутствие систематических клинических данных, достаточных для формирования их концепции [9]. Диагностический приоритет отдают началу проявления симптомов в течение двух недель, наличию типичных синдромов и острого стресса, характерными признаками являются быстро меняющаяся полиморфная симптоматика и наличие в некоторых случаях психических симптомов, первые из которых обычно появляются в течение приблизительно двух недель после стрессовых событий у большинства людей в подобных ситуациях и в соответствующей культурной среде. Основная проблема заключается в выявлении объективных последствий воздействия психотравмирующей стресс-ассоциированной ситуации, которая послужит триггером развития соматической патологии [12].

Диагностика стресс-ассоциированных расстройств у участников боевых действий должна быть многофакторной, учитывая клинические, биологические, социальные и генетические аспекты, а также гормональный фон и результаты психологической диагностики. Несмотря на это, как в России, так и за рубежом, чаще всего [8] применяются клинический психопатологический подход и методы психологической диагностики. Однако из-за стигматизации обращения к психиатрам среди участников боевых действий эти методы не всегда эффективны.

На сегодняшний день сложность диагностики тяжелых стресс-ассоциированных расстройств и ПТСР обусловлена отсутствием не только характеристики событий и факторов, приводящих к развитию заболевания, но и терминологическими проблемами психогенного фактора. В связи с этим возникает полемика об обоснованности постановки диагноза по этиологическому признаку. В клинической практике для диагностики разработан и используется комплекс специально сконструированных клинико-психологических и психометрических методик, отражающих субъективную сторону процесса [11]. Прогнозирование развития стресс-ассоциированных заболеваний (артериальная гипертензия, стрессорные нарушения коронарного и мозгового кровообращения, стрессорные язвы желудка, психопатии и т.д.), основанное на удобном объективном лабораторном или инструментальном критерии открывает известные перспективы в ранней диагностике и не сложной профилактике развития социально значимых неинфекционных заболеваний. Объективную сторону может показать использование в качестве диагностического маркера гипоксия-индуцируемого фактора 1 (HIF1), который активируют экспрессию генов и синтез белковых продуктов, тем самым адаптируя организм к острому стрессу.

При проведении в 1990 г. исследований по изучению молекулярного механизма реакции клеток на кислородное голодание и динамику выработки эритропоэтина почками [13] было открыто соединение, которое первоначально получило название гипоксия-респонсивный элемент (hypoxia responsive element, HRE) – в последствии гипоксия-индуцированный фактор 1 (hypoxia-inducible factor – HIF1). В дальнейших исследованиях HIF1 был охарактеризован как белок, чувствительный к уровню кислорода, который в условиях гипоксии взаимодействует с цепью ДНК, что приводит к увеличению экспрессии генов, регулируемых им. [15]. Более углубленные исследования выявили, что белок HIF1 функционирует как транскрипционный фактор. Его структура представляет собой гетеродимер, включающий одну постоянно экспрессируемую β-субъединицу и одну α-субъединицу, активность которой зависит от уровня кислорода в окружающей среде. Молекулярная масса α-субъединицы составляет 120-130 кДа; β субъединицы – 91-94 кДа.

Концентрация и стабильность HIF1, его клеточная локализация и активность транскрипции находятся в прямой зависимости от уровня кислорода в клетке [10]. Следует отметить, что в ряде исследований, рассматривающих эффекты и молекулярные механизмы фактора HIF1, состоящего из α- и β-субъединиц, авторы часто акцентируют внимание именно на α-субъединице, которая обеспечивает большую часть эффектов HIF1. Фактор HIF1 играет ключевую роль в адаптации клеток млекопитающих к изменениям кислородного баланса. Его основная функция заключается в активации транскрипции генов, регулирующих снабжение клеток кислородом и повышающих их устойчивость к гипоксии и ишемии. Количество выявленных генов, активируемых HIF1, постоянно растет и включает гены, участвующие в ангиогенезе, энергетическом метаболизме, эритропоэзе, клеточной пролиферации, ремоделировании сосудов и вазомоторных реакциях [3].

Помимо классического пути активации HIF1, вызванного гипоксией и накоплением HIF1α, существуют альтернативные (неканонические) механизмы его регулирования. Эти механизмы охватывают практически все этапы активности HIF1 и его α-субъединицы: экспрессия, синтез, трансактивация, накопление и деградация. Например, синтез HIF1α может осуществляться независимо от уровня кислорода посредством каскадов сигнальных реакций, регулируемых системами MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа) и PI3K (фосфатидилинозитол киназа), играющими важную роль в процессах роста, пролиферации и дифференцировки. Кроме того, установлено, что повышение транскрипционной активности HIF1 наблюдается под воздействием окиси азота, фактора некроза опухоли α, интерлейкина-1 и ангиотензина [7].

Цель исследования – изучить возможность и эффективность применения гипоксия индуцируемого фактора 1 (HIF1) в качестве биомаркера тяжелых стресс-ассоциированных расстройств.

 Методика

Исследование проводилось на крысах Vistar в возрасте 8-9 мес. массой 250-300 г. Животные содержались в пластиковых клетках при температуре воздуха 22±2°С, световом режиме 12/12 ч, со свободным доступом к гранулированному корму и воде. В клетке было по 6 однополых особей. Все эксперименты выполнялись в соответствии с Национальным стандартом РФ ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Приказом Минздрава РФ от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и Европейской конвенции Directive 2010/63/EU.

Моделирование стресс-индуцированных нейрофизиологических механизмов адаптации в условиях смертельной угрозы воспроизводили с использованием модели «Хищник – жертва». Животные были разделены на 4 группы. На разных сроках после стрессирующего воздействия проводились оценка динамики лабораторных показателей. Первая группа – исследовалась острейшая стресс-ассоциированная реакция на угрожающий жизни стимул. Вторая группа – исследовалась острая стресс-ассоциированная реакция на угрожающий жизни стимул. Третья группа – исследовалась отсроченная стресс-ассоциированная реакция на угрожающий жизни стимул. В качестве контроля использовали группу контрольных (интактных) крыс.

Определение уровня HIF1α проводили методом ИФА на образцах прозрачной фракции крови, миндалине и префронтальной коре головного мозга крыс (центрифугирование 8 000/об/мин), полученных при декапитации крыс у первой группы через 1 день после воздействия (моделирование острого периода), второй – через 3 дня (моделирование подострого периода), а у третьей – через 7 дней (моделирование хронического периода).

ИФА выполнялся сэндвич-методом с использованием тест-систем ELISA Kit for HIF1α (Cloud-Clone Corp., Хьюстон, США) в соответствии с протоколом фирмы изготовителя. Детекция антигена осуществлялась на спектрофотометре на длине волны 450 нм. До момента определения образцы сохраняли при -20°С.

Статистическую обработку производили с использованием GraphPadPrism8 и IBM SPSS Statistics 27 с оценкой статистической значимости показателей при p<0,05. По результатам критерия Шапиро-Уилка (p=0,086) и Колмогорова-Смирнова (p=0,200) проверяемое распределение показателя HIF1 в миндалине головного мозга соответствует нормальному, а в коре головного мозга и крови не соответствует нормальному (критерий Шапиро-Уилка (p<0,05) и Колмогорова-Смирнова (p <0,05), однако учитывая малую выборку, все данные обработаны при помощи непараметрического критерия.

В связи с невозможностью получения значения параметров у одного объекта исследования более одного раза (т.е. в динамике), принято решение взять четыре группы объектов с абсолютно одинаковыми характеристиками и снять показания: в первой группе – через 1 сутки после стрессирования, во второй – через 3 суток после стрессирования, в третьей – через 7 суток после стрессирования, в четвертой группе – до стрессирования (контрольная группа). Статистический анализ проводился при помощи однофакторного дисперсионного анализа Краскалла-Уоллиса для несвязанных выборок.

 Результаты исследования

Показатели HIF1α в генеральной совокупности в крови, миндалине и коре головного мозга крыс приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Показатели HIF1α в генеральной совокупности в крови, миндалине и коре головного мозга крыс, Me [Q1÷Q3]

Ткань	Уровень HIF1α	σ
кровь	0,05867 [0,05255÷0,06996]	0,01577
AMG	0,08675 [0,07892÷0,09571]	0,01616
PFC	0,08686 [0,07483÷0,09865]	0,01351

Примечание: Ме – медиана, σ – стандартное отклонение, Q1 – 25й процентиль, Q3 – 75й процентиль, AMG – миндалина головного мозга, PFC – кора головного мозга

При сравнении уровня HIF1α всех исследуемых животных в миндалине головного мозга (Ме – 0,08816, n – 23, σ – 0,01682) статистически значимых различий не выявлено (р=0,816). Показатели HIF1α в миндалине головного мозга крыс относительно времени приведены в табл. 2.

 Таблица 2. Показатели HIF1α в миндалины головного мозга крыс относительно времени, Me [Q1÷Q3]

Группа	Me [Q1÷Q3]	sd
контроль	0,08213 [0,07406÷0,11268]	0,01994
Через 1 сутки	0,08229 [0,07981÷0,113345]	0,02311
Через 3 суток	0,09262 [0,07679÷0,09731]	0,01126
Через 7 суток	0,08905 [0,08353÷0,09418]	0,00560

Примечание: Ме – медиана, sd – стандартное отклонение, Q1 – 25-ый процентиль, Q3 – 75-й процентиль

 

На рис. 1 представлена динамика изменения концентрации HIF1α в миндалине головного мозга крыс различных групп:

Рис. 1. Динамика HIF1α в миндалине головного мозга крыс различных групп

Анализируя уровень HIF1α в коре головного мозга (Ме – 0,08708, n – 23, σ – 0,02154), статистически значимых различий не выявлено (р=0,689). Показатели HIF1α в коре головного мозга крыс относительно времени приведены в табл. 3.

 

Таблица 3. Показатели HIF1α в коре головного мозга крыс относительно времени, Me [Q1÷Q3]

Группа	Me [Q1÷Q3]	sd
контроль	0,08208 [0,07149÷0,09466]	0,01234
Через 1 сутки	0,09190 [0,08092÷0,10112]	0,01239
Через 3 суток	0,09218[0,08280÷0,10844]	0,01674
Через 7 суток	0,08095 [0,07578÷0,09064]	0,01116

Примечание: Ме – медиана, sd – стандартное отклонение, Q1 – 25-й процентиль, Q3 – 75-й процентиль

На рис. 2 представлена диаграмма динамики HIF1α в префронтальной коре головного мозга крыс различных групп:

Рис. 2. Динамика HIF1α в префронтальной коре головного мозга крыс различных групп

При исследовании уровня HIF1 α в крови (Ме – 0,05867, n – 36, σ – 0,01577) выявлены статистически значимые различия (р=0,043), в частности значимое снижение уровня HIF1 во второй группе (через 3 суток) по сравнению с показателями контрольной группы. Показатели HIF1α в крови крыс относительно времени приведены в табл. 4.

 

Таблица 4. Показатели HIF1α в крови крыс относительно времени, Me [Q1÷ Q3]

Группа	Me [Q1÷Q3]	sd
контроль	0,07547 [0,06505÷0,09956]	0,02364
Через 1 сутки	0,05937 [0,05095÷0,07414]	0,01455
Через 3 суток	0,05740 [0,05385÷0,05867]	0,00450
Через 7 суток	0,05902 [0,04912÷0,06413]	0,00874

Примечание: Ме – медиана, sd – стандартное отклонение, Q1 – 25-й процентиль, Q3 – 75-й процентиль.

На рис. 3 представлена диаграмма динамики HIF1α в крови крыс различных групп.

Рис. 3. Динамика HIF1α в крови крыс различных групп

Анализ полученных статистических данных свидетельствует о том, что после воздействия ситуации «смертельной угрозы жизни» уровень HIF1α в крови крыс в динамике постепенно снижается, со статистически значимым снижением через 3 суток.

Обсуждение результатов исследования

Анализ полученных статистических данных свидетельствует о том, что после воздействия ситуации «смертельной угрозы жизни» уровень HIF1α в крови крыс в динамике постепенно снижается, со статистически значимым снижением через 3 суток. Исходя из достоверных сведений о стимулировании синтеза HIF1α при гипоксии, изменение уровня HIF1 в крови является предсказуемым явлением в ответ на снижение концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе. Однако в нашем исследовании экспериментальные животные находились в нормоксических условиях и статистически значимое снижение HIF1α в крови является новыми неожиданными данными. Полученный результат свидетельствует о том, что изучаемый биологический маркер в экспериментальных условиях демонстрирует определённую роль в нейрогенной и физиологической адаптации к тяжёлой психотравмирующей ситуации, развитии стресс-ассоциированных реакций.

Было показано, что HIF1 играет роль в регуляции нейрогенеза нейронов гиппокампа у постнатального организма. Поэтому HIF1 представляет собой потенциальный диагностический маркер выраженности нарушения когнитивных функций и возможную терапевтическую мишень для коррекции поведенческих нарушений при различных психопатологиях, включая модуляцию нейрогенеза [6]. Стресс – важнейший фактор, меняющий активность головного мозга и нервной системы, связанный с повышением уровня симпатической иннервации, выбросом катехоламинов – это всё способствует развитию тканевой гипоксии.

Исследования системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники (ГГН) выявили, что мозг регулирует выработку кортизола посредством высвобождения адренокортикотропного гормона (АКТГ) гипофизом. Как недостаточная, так и чрезмерная активация системы ГГН связана с агрессивным поведением. Кортизол, в свою очередь, подавляет активность системы посредством механизма отрицательной обратной связи. Кроме того, кортизол оказывает влияние на различные аспекты поведения, включая проявления тревоги и дистресса, и снижает синтез тестостерона [17]. Такая картина наблюдается при ряде психопатологических состояний, таких как ПТСР и стресс-ассоциированные расстройства.

Связь между АКТГ и HIF1 проявляется в обнаружении HIF1 в клетках аденомы гипофиза. HIF1 выступает в роли ключевого транскрипционного регулятора, координирующего адаптацию клеток к гипоксическим условиям при прогрессировании аденомы гипофиза [14]. Он способствует подавлению апоптоза и участвует в ингибировании глюкокортикоидного рецептора под действием дексаметазона в гипоксических клетках линии AtT-20. HIF1 играет значительную роль в патогенезе патологии системы ГГН, ассоциированных с АКТГ, и вовлечен в регуляцию нейрометаболических и гипоксических адаптационных реакций.

Данные свидетельствуют о том, что воздействие жизнеугрожающего фактора запускает ответную системную реакцию, приводящую к дисбалансу и нарушению нейроэндокринной регуляции и адаптации к действию раздражителя, что приводит в конечном итоге либо к компенсации стресс-ассоциированного состояния, либо – к развитию патологии. Полученные нами результаты позволяют предположить, что нейропротективные механизмы, связанные с воздействием критических факторов, индуцируют экспрессию HIF1 в крови и головном мозге по мере прогрессирования психопатологии. Данное исследование поставило вопросы, почему в периферической крови наблюдается реакция исследуемого маркера на витальный стресс, а в миндалине и коре головного мозга – локация, где разыгрывается вся эмоциональная картина стрессогенной ситуации – изменения не отразились. Возникает предположение, что либо ЦНС является более защищённой системой от витального стресса, либо нейрогенные механизмы компенсации и адаптации головного мозга не задействуются в данном типе стрессирования. При этом другие виды негипоксического стресса вовлекают эти отделы головного мозга в реактивный процесс [5].

Динамика концентрации HIF1 в периферической крови, особенно в начальный период адаптации (3 сутки), может быть интерпретирована как значимый молекулярный маркер адаптации к воздействию жизнеугрожающего фактора. Однако, интерпретация полученных данных требует более углубленного и комплексного исследования. Это связано с тем, что HIF1 регулирует не только положительные с точки зрения клинической практики процессы, но также может запускать отдаленные негативные последствия, такие как неопластические процессы и апоптоз.

Стресс является основным проводником и стимулятором развития гипоксического состояния, возникающего в ответ на дисметаболические изменения головного мозга, которые на ранних этапах не заметны и не диагностируются в рутинной клинической практике. Типичные проявления скрытого стрессоподобного состояния проявляются в виде плохого сна, нарушения аппетита и пищевого поведения, снижения физической активности, меняется митогенез, энергетическое обеспечение.

В связи с этим, важно изучить долгосрочные последствия изменения концентрации HIF1 для дифференциальной диагностики адаптивных и патологических процессов. Важным моментом является то, что HIF1 представляет собой системный механизм, который тонко реагирует как на острые, так и на хронические состояния, что подчеркивает вовлеченность именно системных механизмов в эти процессы.

Для окончательного подтверждения возможности использования HIF1α в качестве лабораторного маркера тяжелых стресс-ассоциированных расстройств и ПТСР требуется проведение дополнительных исследований. Важно определить продолжительность сохранения стабильных изменений уровня этого маркера и его сопоставимость с другими лабораторными маркерами, имеющими потенциал применения в качестве диагностики хронического стресса. Необходимо изучить долгосрочную стабильность и воспроизводимость выявленных изменений, а также провести аналогичные исследования на других экспериментальных моделях и в различных условиях, чтобы обеспечить универсальность и значимость использования HIF1α в клинической практике. Комплексный подход к этим вопросам позволит утвердить HIF1α как важный диагностический инструмент в оценке стресс-ассоциированных расстройств и ПТСР и повысить точность и надёжность диагностики подобных состояний.

Дальнейшие исследования позволят разработать новые терапевтические подходы к диагностике и фармакологической коррекции тяжелых стресс-ассоциированных расстройств и посттравматического стрессового расстройства.

Заключение

Стресс является важнейшим элементом внешнего воздействия на человека и животных, приводящим к развитию эндогенной гипоксии. HIF1α является возможным биологическим маркером гипоксического воздействия и обладает потенциалом отражать степень стрессорного воздействия. Циркуляция HIF1α на фоне стрессового состояния в кровеносной системе не позволяет однозначно судить о степени воздействия этого биомаркера как повреждающего агента на ЦНС животных.

Об авторах

Андрей Владимирович Любимов

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова; Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: lyubimov_av@mail.ru
кандидат медицинских наук, преподаватель кафедры военно-морской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, 6; Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Семён Валерьевич Ефимов

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: sve03helper@rambler.ru
кандидат медицинских наук, преподаватель кафедры военно-морской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, 6

Антон Сергеевич Тарахтеев

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: anton.tarakhteev@mail.ru
ассистент кафедры военно-морской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, 6

Диана Дмитриевна Быкова

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: didish2020@mail.ru
ассистент кафедры военно-морской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, 6

Александра Евгеньевна Трандина

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: sasha-trandina@rambler.ru
врач клинической лабораторной диагностики научно-исследовательской лаборатории тканевой инженерии научно-исследовательского отдела медико-биологических исследований Научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, 6

Елена Андреевна Погожая

Медицинский центр преморбидных и неотложных состояний Центрального военного клинического госпиталя им. П.В. Мандрыка

Email: epogozhaya16@yandex.ru
старший врач-специалист медицинского отдела (диагностики и диспансеризации) медицинского центра преморбидных и неотложных состояний ФКУ «Центральный военный клинический госпиталь им. П.В. Мандрыка» МО РФ Россия, 119002, Москва, пер. Серебряный, 4

Константин Валерьевич Асямов

Санкт-Петербургский медико-социальный институт

Email: asyamovkonstantin@mail.com
кандидат медицинских наук, доцент кафедры Санкт-Петербургского медико-социального института 195272, Санкт-Петербург, Кондратьевский проспект, 72 А

Дмитрий Викторович Черкашин

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: cherkashin_dmitr@mail.ru
доктор медицинских наук, профессор, начальник кафедры военно-морской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, 6

Список литературы

Дополнительные файлы