Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БГК – биосинтетический генный кластер; КЖ – культуральная жидкость; ТФЭ – твердофазная экстракция; МПК – минимальная подавляющая концентрация; ХМСА – хромато-масс-спектрометрический анализ; ЛПС – липополисахарид; мРНК FLuc – матричная РНК, кодирующая светлячковую люциферазу.

ВВЕДЕНИЕ

Распространение антибиотикорезистентности среди патогенов представляет одну из острейших проблем современной медицины. Потенциал ранее найденных и введенных в медицинскую практику молекул практически исчерпан, а темпы открытия новых значительно снизились по сравнению с «Золотой эрой антибиотиков», которая приходилась на середину ХХ века. Большинство обнаруживаемых в ходе широкомасштабного скрининга [1–3] антибиотиков оказываются «переоткрытием» ранее уже обнаруженных молекул, однако новый инструментарий исследования механизмов действия позволяет взглянуть на эти вещества под новым углом и обнаружить новый потенциал их применения [4–6].

Такими инструментами могут быть мишень-ориентированный скрининг и методы определения механизма действия молекул на начальных стадиях исследования. Это позволяет сосредоточить поиск антибактериальных веществ, специфичных к наиболее перспективным мишеням, и даже может ускорить идентификацию молекул. В настоящее время нами успешно используется репортерная система, в которой соединения, ингибирующие биосинтез белка или ДНК, детектируются при помощи экспрессии репортерных генов флуоресцентных белков в ответ на это воздействие. Актуальность поиска ингибиторов трансляции заключается в том, что рибосома является ключевым элементом функционирования живой клетки, при этом в структурах рибосом про- и эукариот имеются значительные различия, что позволяет рассчитывать на возможность высокоспецифичного воздействия именно на бактериальные рибосомы и значительно повышает шансы разработки лекарственных препаратов с хорошими терапевтическими свойствами.

Актиномицеты рода Streptomyces – богатейший источник биологически активных веществ, они продуцируют примерно 50% используемых в медицинской практике антибактериальных субстанций [7–9]. Актиномицеты являются одними из обладателей самых больших геномов среди прокариот и, соответственно, имеют большой кодирующий потенциал, что приводит к структурному разнообразию продуцируемых ими вторичных метаболитов. К настоящему времени описаны десятки тысяч молекул, продуцируемых стрептомицетами, однако даже «переоткрываемые молекулы» часто демонстрируют новые, уникальные свойства.

Ранее благодаря использованию репортерной системы нам удалось установить механизм действия тетраценомицина Х [10]. Эта молекула и ее антибактериальные свойства были описаны еще в 60-х годах. Тетраценомицин Х обладает структурным сходством с доксорубицином, поэтому считалось, что его эффект также основан на интеркаляции в двухцепочечную структуру ДНК, однако использование репортерной системы позволило предположить, а в дальнейшем и подтвердить, что эта молекула ингибирует биосинтез белка путем взаимодействия с рибосомой в новом, ранее не исследованном центре связывания, что дает надежды на разработку перспективных полусинтетических производных на ее основе.

В данном исследовании нами обнаружен штамм-продуцент вещества К-1115А, механизм антибактериального действия которого основан на подавлении биосинтеза белка, что подтверждено с помощью теста в бесклеточной системе трансляции. Полученные результаты позволяют нам утверждать, что вещество К-1115А является ингибитором биосинтеза белка.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Отбор образцов, выделение и культивирование микроорганизмов

Штамм БВ-204 S. phaeochromogenes был выделен из образцов почв, отобранных на Федеральной территории Сириус. Образцы почвы отбирали весной 2021 года в парковой зоне на побережье Черного моря (43°23’53.7″N 39°57’48.2″E). Пробоотбор проводили согласно методике, описанной ранее [11, 12]. Верхний слой почвы (0–5 см) снимали стерильным шпателем и помещали в стерильную емкость для сбора образцов. Актинобактерии выделяли путем поверхностного посева на агаризованные питательные среды из серийных разведений почвенных суспензий согласно [13]. В качестве питательной среды использовали ISP3 [13] с добавлением нистатина (250 мкг/мл) и налидиксовой кислоты (10 мкг/мл) для подавления развития микромицетов и грамотрицательных бактерий соответственно. Посев инкубировали в течение 14 суток при температуре 28°С.

Штамм БВ-204 был отобран на основе морфологических признаков, выделен в чистую культуру из первичного посева на минеральный агар Гаузе 1 для микроморфологических исследований [14]. Для поддержания в лабораторных условиях штамм культивировали на среде ISP3, для долговременного хранения – растили на жидкой среде ISP3 в течение 14 суток с постоянным перемешиванием (200 об/мин при 28°С), а затем полученную суспензию смешивали с равным объемом 50% раствора глицерина и замораживали в жидком азоте; образцы хранили при -80°С.

Полифазная идентификация штамма

Культуральные признаки штамма БВ-204 (наличие и окраска воздушного мицелия, выделение растворимых пигментов) оценивали на плотных средах, рекомендованных International Streptomyces Project (ISP), после 14 суток культивирования при 28°С [15]. Морфологические признаки (наличие и форма цепочек репродуктивных спор, характер поверхности спор) оценивали с помощью светового Zeiss Axiolab A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) и сканирующего электронного микроскопа JSM-6380LA (JEOL Ltd., Япония) спустя 14 дней роста при 28°С на среде ISP3. Подготовку образцов для электронной микроскопии осуществляли в соответствии с методикой, описанной ранее [16]. Утилизацию источников углерода (моно- и полисахаридов, спиртов) оценивали на минеральном агаре ISP9 с добавлением бромкрезолового пурпурного при 28°С в течение 14 дней [15]. Способность разлагать крахмал, целлюлозу и казеин оценивали по размеру зон гидролиза полимеров согласно [17, 18]. Чувствительность к различным антибиотикам определяли с помощью бумажных дисков, пропитанных антибиотиками (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Индия).

Полногеномное секвенирование, филогенетический анализ и анализ БГК

ДНК из штамма-продуцента выделяли согласно [19]. Геном штамма БВ-204 был секвенирован de novo с использованием платформы Illumina HiSeq 4000 (Illumina, США). Сборка генома осуществлена с помощью SPAdes v3.13.0 [20]. Геном был аннотирован с использованием конвейерной технологии RASTtk на основании веб-сервиса PATRIC [21]. Целостность и качество генома, а также средние значения идентичности нуклеотидов (ANI) оценивали с помощью веб-сервиса MiGA (http://microbial-genomes.org). Филогенетическую принадлежность исследовали с использованием полногеномной последовательности и сервиса Type (Strain) Genome Server (TYGS) (https://tygs.dsmz.de/). Геном штамма БВ-204 автоматически сопоставляли со всеми геномами, представленными в базе данных TYGS, с помощью алгоритма MASH [22]. Филогенетическое дерево получено с помощью FastME 2.1.6.1 на основании расстояний GBDP, рассчитанных исходя из нуклеотидных последовательностей генома. Длины ветвей были масштабированы по формуле расстояния GBDP d5 [23].

БГК биологически активных соединений были идентифицированы с помощью бактериальной версии браузера antiSMASH 6.1.0 (https://antismash.secondarymetabolites.org). Гомологичные области в каждом геноме идентифицировали с помощью NCBI Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Скрининг антимикробного действия

Первичное определение антибактериальной активности проводили на штамме E. coli BW25113, у которого делитированны кодоны 330–352 гена lptD, обозначаемый нами в дальнейшем E. coli SS_lptd. Данная мутация приводит к нарушению нормального синтеза липополисахаридной оболочки грамотрицательных бактерий, что делает ее более проницаемой для низкомолекулярных соединений [11]. Данный штамм содержит плазмиду pDualrep2 [10]. В присутствии ингибиторов репликации ДНК или ингибиторов биосинтеза белка штамм экспрессирует флуоресцентные белки TurboRFP или Katushka2s соответственно (Приложения, рис. S7). Скрининг проводили методом диффузии в агаре, описанном ранее [16]. Штамм БВ-204, наряду с другими штаммами, выращивали на ISP3, тестирование проводили на 3, 6 и 9 сутки; для этого из участка газона с отчетливым ростом вырезали агаровый блок диаметром 5 мм и помещали его на чашки, содержащие агаризованную среду LB, предварительно засеянные культурами тест-организмов. Флуоресцентный сигнал детектировали на следующий день после посева с помощью ChemiDoc MP (Bio-Rad) в каналах Су-3 и Су-5. Для изучения спектра действия штамм БВ-204 тестировали на других тест-организмах, таких, как S. aureus АТСС 29213, S. aureus ATCC 25923, S. aureus SS01, S. aureus (MRSA) INA00761, B. subtilis ATCC 6633, C. albicans CBS 8836, M. smegmatis Ac-1171. Антибактериальную активность оценивали с помощью методики агаровой диффузии, описанной выше. Для формирования газона бактерий использовали агаризованную среду LB, для дрожжей – глюкозо-пептонно-дрожжевой агар [24], инкубировали при 37°С в течение 24 ч, после чего оценивали размер зон подавления роста.

Выделение и идентификация активных компонентов

В ходе первичного скрининга была установлена способность штамма БВ-204 проявлять антагонистическую активность при росте на среде ISP3. Для получения культуральной жидкости (КЖ), содержащей активное вещество, штамм культивировали в жидкой питательной среде ISP3 (7 суток, 28°С на шейкере New Brunswick Innova (Eppendorf), 200 об/мин). КЖ отделяли от биомассы путем центрифугирования при 4000 g, концентрировали и очищали с помощью твердофазной экстракции (ТФЭ). С этой целью КЖ наносили на хроматографическую колонку Poly-Prep Econo-Pac (Bio-Rad), содержащую 1 мл сорбента LPS-500H («Техносорбент», Россия), после чего элюировали ступенчатым градиентом вода-ацетонитрил (v/v) с фракционным сбором элюата. Исследовали антагонистическую активность собранных фракций, активные фракции использовали для дальнейшей очистки методом ВЭЖХ.

ВЭЖХ-анализ и фракционирование выполняли с помощью системы Vanquish Flex с использованием детектора с диодной матрицей (Thermo Fisher Scientific, США), оснащенного колонкой Luna 5 мкм C18(2) 100 Å, 250 × 4.6 мм (Phenomenex), скорость потока 1 мл/мин, инжекционный объем 20 мкл. В качестве элюента А использовали 0.1% водный раствор ТФУ, а в качестве элюента В – ацетонитрил с добавлением 0.1% ТФУ. Элюирование осуществляли путем увеличения концентрации элюента В с 25 до 95% в течение 10 мин, затем поддерживали концентрацию элюента В 95% в течение 2 мин. Собирали фракции объемом 1 мл и анализировали их антибактериальную активность (Приложения, рис. S8).

Активные фракции анализировали с использованием хромато-масс-спектрометрической системы – хроматограф UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific, США), оснащенный колонкой Acclaim RSLC 120 C18 2.2 мкм 2.1 × 100 мм (Thermo Fisher Scientific), и qTof-масс-спектрометр аmaXis II 4G ETD (Bruker Daltonics). Измерения проводили в режиме регистрации спектра 100–1500 м/з и с выделением трех наиболее интенсивных ионов для фрагментации CID 10–40 эВ, газ столкновений – азот. Масс-спектры анализировали с помощью OpenChrom Lablicate Edition (1.4.0.202201211106), TOPPView v.2.6.0 [25]. Химические структуры идентифицировали с использованием баз данных GNPS [26], NPAtlas [27, 28] и Dictionary of Natural Products 31.1.

Активную ВЭЖХ-фракцию (1 мл) концентрировали с помощью вакуумного биоконцентратора CentriVap (Labconco) и растворяли в 500 мкл 10% водного раствора ДМСО; полученный раствор именовали «рабочий раствор антибиотика».

Ингибирование трансляции in vitro

Подавление трансляции изучали в бесклеточной системе с использованием коммерческого набора E. coli T7 S30 Extract System for Circular DNA (Promega) согласно инструкции фирмы. В реакционную смесь (4 мкл) вносили рабочий раствор антибиотика (0.5 мкл), а затем 0.5 мкл 200 нг/мкл мРНК FLuc и инкубировали в течение 1 ч при 37°С.

Активность люциферазы определяли с использованием набора Luciferase Assay Reagent (Promega) по интенсивности хемилюминесценции на планшетном ридере ClarioStar (BMG Labtech) на длине волны 580(80) нм.

Исследование МПК и цитотоксичности

Ночные культуры штаммов E. coli SS_lptd, S. aureus INA00761 (MRSA), S. aureus SS01 и B. subtilis ATCC 6633 разбавляли свежей средой LB до OD600 = 0.6, а затем полученный посевной материал разводили в 1000 раз для получения рабочей суспензии. В лунки стерильного 96-луночного планшета вносили по 100 мкл рабочей суспензии, кроме первого и последнего рядов. В первый ряд вносили по 180 мкл суспензии, последний ряд заполняли 100 мкл стерильной питательной среды и использовали в качестве отрицательного контроля. Далее в первый ряд планшета вносили 20 мкл рабочего раствора антибиотика и получали серию двукратных разведений, последовательно перенося 100 мкл из лунки одного ряда в лунку следующего. В качестве положительного контроля использовали предпоследний ряд, в который антибиотик не вносили. Затем планшет инкубировали при перемешивании (200 об/мин, 37°С). Рост клеток регистрировали через 24 ч на планшетном ридере ClarioStar на длине волны 590 нм. В качестве МПК принимали концентрацию вещества, при которой наблюдалось полное подавление роста бактерий.

Для определения цитотоксичности клеточные линии подготавливали согласно [29]. Культуру клеток HEK293 культивировали на питательной среде DMEM, содержащей 10% FBS, 4 мМ L-глутамина, 4.5 г/л глюкозы. В ряд подготовленных микроцентрифужных пробирок вносили по 100 мкл питательной среды, затем в первую пробирку добавляли 80 мкл среды и 20 мкл рабочего раствора антибиотика, после чего производили двукратные последовательные разведения, перенося по 100 мкл из первой пробирки во вторую и далее по всему ряду. В качестве отрицательного контроля использовали двукратные разведения доксорубицина в диапазоне от 75.9 до 0.16 мкМ; в качестве положительного контроля оставляли ряд лунок с клетками без антибиотиков. Содержимое пробирок переносили в соответствующие лунки заранее подготовленного планшета, содержащие клетки, и инкубировали в течение 3 суток в СО2-инкубаторе при 37ºС. По истечении времени инкубации в лунки, содержащие питательную среду, вносили 20 мкл раствора резазурина (0.15 мг/мл), перемешивали покачиванием для равномерного распределения красителя в лунках и выдерживали в СО2-инкубаторе при 37ºС в течение 3 ч. Далее интенсивность флуоресценции измеряли с помощью планшетного ридера ClarioStar (Ex = 545 нм, Em = 600 нм).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Генетический и филогенетический анализ

По результатам полногеномного секвенирования и последующей сборки размер генома клеток штамма БВ-204 составляет 11 380 121 п.н., содержание G+C равно 70.2%, что характерно для представителей рода Streptomyces [30].

Филогенетический анализ, основанный на полногеномных последовательностях, показывает, что штамм БВ-204 наиболее близко кластеризуется со штаммом S. phaeochromogenes JCM 4958 (ранее S. ederensis JCM 4958) и вместе с ним, а также со штаммами S. umbrinus JCM 4521, S. liliifuscus ZYC-3, S. albicerus TRM 68295 образует монофилетическую группу с максимальным значением поддержки ветвления 100% (рис. 1).

 

Рис. 1. Филогенетическое дерево, основанное на полном геноме штамма S. phaeochromogenes БВ-204. Указаны значения бутстрэп-анализа выше 60%

 

Фенотипические и морфологические свойства штамма БВ-204

Штамм S. phaeochromogenes БВ-204 является грамположительной аэробной бактерией с неподвижными клетками, активно растущими на питательных средах ISP2 и ISP3 и умеренно – на средах ISP5 и ISP6. Окраска субстратного мицелия варьируется от темно-бурой до бежевого, воздушный мицелий палевый с розовыми оттенками, на среде ISP6 воздушный мицелий не образуется. Кроме того, штамм БВ-204, растущий на среде ISP3, выделяет темно-бурый растворимый пигмент (Приложения, табл. S1).

Клетки S. phaeochromogenes БВ-204 имеют такой же спектр утилизации углеводов, как и штаммы S. phaeochromogenes JCM 4958(Т) и S. umbrinus JCM 4521, описанные ранее: не выявлено отличий в способности БВ-204 и близкородственных видов использовать моно-, дисахариды и спирты. У штамма S. phaeochromogenes БВ-204 обнаружена способность гидролизовать карбоксиметилцеллюлозу, т.е. этот штамм обладает целлюлазной активностью, не описанной ранее у других представителей этого таксона (Приложения, табл. S2).

Штамм S. phaeochromogenes БВ-204 образует прямые, длинные цепочки спор с гладкой поверхностью, что согласуется с описанием типовых штаммов [14] (рис. 2).

 

Рис. 2. Электронная микрофотография штамма S. phaeochromogenes БВ-204 на 14 сутки инкубации в среде ISP3 при 28°C. Размерный отрезок соответствует 2 мкм

 

Таким образом, результаты филогенетического анализа, полученные с использованием полифазного таксономического подхода, и сравнение фенотипических признаков позволяют отнести штамм БВ-204 к виду S. phaeochromogenes.

Антибактериальная активность

В ходе первичного скрининга была обнаружена антибактериальная активность S. phaeochromogenes БВ-204 в отношении E. coli SS_lptd pDualrep2. Вещество, выделяемое продуцентом, индуцировало экспрессию Katushka2s, что позволяет предположить возможность ингибирования синтеза белка (рис. 3). В качестве положительного контроля использовали 0.05 мкг эритромицина (ингибитора биосинтеза белка), который вызывает экспрессию Katushka2s, и 1 нг норфлоксацина (ингибитора ДНК-гиразы), который вызывает экспрессию TurboRFP. Для удобства сигналы Katushka2s и TurboRFP визуализируются программным обеспечением ChemiDoc MP – красным и зеленым цветом соответственно. На штамме E. coli JW5503 ΔtolC pDualrep2 ингибирование и индукция репортерных флуоресцентных белков отсутствовали.

 

Рис. 3. Активность агаровых блоков с S. phaeochromogenes БВ-204 в отношении штамма E. coli SS_lptd pDualrep2 на 3-и (а), 6-е (б) и 9-е (в) сутки роста

 

Обнаружено, что штамм S. phaeochromogenes БВ-204 подавляет рост грамположительных бактерий B. subtilis ATCC 6633, S. aureus SS01, S. aureus INA00761 (MRSA); однако не ингибирует штаммы S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, C. albicans CBS 8836, M. smegmatis Ac-1171. Оптимальной средой для синтеза активного метаболита штаммом БВ-204 была как агаризованная, так и жидкая среда ISP3.

Идентификация активного вещества

Активный метаболит получали в чистом виде с помощью твердофазной экстракции КЖ S. phaeochromogenes БВ-204, активный метаболит детектировался во фракциях, содержащих 30–40% ацетонитрила. Эти фракции были сконцентрированы и подвергнуты дальнейшему разделению и фракционированию с помощью ВЭЖХ. Обнаружено, что активность ассоциирована с компонентом, элюируемым на 9.47 мин (Приложения, рис. S10 и S11), имеющим максимумы поглощения при 276 и 407 нм. ХМСА этого вещества показал, что оно практически не ионизируется в режиме регистрации положительных ионов, однако дает интенсивный аддукт [M–H]-, соответствующий точной массе 326.0805 Да (Приложения, рис. S12). С учетом характерного спектра поглощения выделенного соединения в базах NPAtlas, Dictionary of Natural Products и PubChem выявлен кандидат с брутто-формулой C18H14O (точная масса 326.0790, отклонение 4.5 м.д.) и структурной формулой, представленной на рис. 4.

 

Рис. 4. Структура идентифицированного активного компонента К-1115А (3,8-дигидрокси-9,10-диоксо-1-пропилантрацен-2-карбоновая кислота)

 

K-1115A, как и алнумицин, имеет биосинтетическое происхождение и продуцируется стрептомицетами [31]. В спектре фрагментации аддукта [M-H]- с m/z 325.07 наблюдается основной фрагментный ион [M–44] с m/z 281.08, что согласуется с наличием в молекуле карбоксильной группы.

Исследование подавления биосинтеза белка соединением К-1115А in vitro

Изучена способность очищенной с помощью ВЭЖХ фракции К-1115А подавлять бесклеточную трансляцию. В качестве референсного ингибитора трансляции использовали эритромицин. Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Результаты определения концентрационной зависимости доза–эффект представлены на рис. 5. Значения EC50 составили 0.004 и 0.606 мкг/мл для эритромицина и К-1115А соответственно.

 

Рис. 5. Подавление in vitro трансляции гена люциферазы под действием К-1115А и эритромицина

 

Анализ БГК

С помощью биоинформатических методов в геноме S. phaeochromogenes БВ-204 найден БГК алнумицина с K-1115А в качестве шунтирующего продукта, гомологичный кластеру генов, ранее аннотированному у Streptomyces sp. CM020 (рис. 6) [32]. БГК содержит 32 открытых рамки считывания, которые могут участвовать в биосинтезе алнумицина и К-1115А. В него входит 22 предположительно структурных гена и 10 генов, несущих регуляторную и транспортную функцию. Общая длина кластера составляет 31030 п.н. Синтез антибиотика осуществляется поликетидсинтазой II типа.

 

Рис. 6. БГК алнумицина и К-1115А в геноме штамма Streptomyces sp. CM020 (A); S. phaeochromogenes БВ-204 (Б)

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Род Streptomyces является самым обширным среди актиномицетов, большинство известных клинически значимых антибиотиков, начиная со стрептомицина, были выделены именно из представителей этого таксона. Усилиями многочисленных научных коллективов к 1980 году опубликованы данные о десятках тысяч соединений, проявляющих антагонистическую активность. Большинство соединений, впрочем, не были полноценно охарактеризованы в силу ограниченности методологической базы того времени. Одним из подобных соединений оказалось вещество с индексом K-1115A, продуцируемое штаммом БВ-204, обнаруженным нами в ходе широкомасштабного скрининга, осуществляемого с применением «гражданской науки», с использованием мишень-ориентированной репортерной системы pDualrep2.

Штамм-продуцент БВ-204, атрибутированный на основе полифазного анализа как представитель вида S. phaeochromogenes, при росте на овсяной среде демонстрировал способность ингибировать модельные штаммы и вызывать индукцию репортерной системы, свидетельствующую о подавлении синтеза белка.

В результате последовательных стадий твердофазной экстракции КЖ S. phaeochromogenes БВ-204 с последующим ВЭЖХ-фракционированием удалось выделить активную субстанцию в чистом виде. Последующий ХМСА позволил предложить в качестве кандидата соединение K-1115A (3,8-дигидрокси-9,10-диоксо-1-пропилантрацен-2-карбоновая кислота), что подтверждается совпадением точной массы и характерным УФ-спектром, соответствующим опубликованным ранее данным [33]. Биоинформатический анализ выявил в геноме штамма S. phaeochromogenes БВ-204 БГК, ответственный за продукцию алнумицина и других родственных веществ, включая К-1115А, что дополнительно подтверждает способность БВ-204 синтезировать К-1115А. При этом ранее об антибактериальной активности К-1115А не сообщалось.

Известно, что некоторые продукты БГК алнумицина обладают антибактериальной активностью [31], однако механизм действия этих соединений не изучен. Анализ референсного генома (ГенБанк RefSeq:GCF_026343615.1) штамма S. phaeochromogenes NBC 00034 также выявил у него БГК алнумицина и сопряженных с ним соединений. Этот кластер был аннотирован ранее на основе штамма Streptomyces sp. CM020 [32], данные филогенетического атрибутирования которого не опубликованы, но на основе высокой гомологии БГК алнумицина Streptomyces sp. CM020, S phaeochromogenes NBC 00034 и S phaeochromogenes БВ-204, а также сходства фенотипических признаков можно предположить, что Streptomyces sp. CM020 также относится к таксону S. phaeochromogenes.

Согласно опубликованным данным, S. phaeochromogenes NBC 00034 продуцирует различные изомеры фаэхромацетина (A, B, C, D, E) [34–38], а также моэномицин и бамбермицин [38], однако ХМСА не выявил этих продуктов в спектре метаболитов S. phaeochromogenes БВ-204. Стоит также отметить, что ХМСА не выявил алнумицина в спектре метаболитов. Нарушение функционирования генов aln4 и aln5 может влиять на биосинтез алнумицина [34] и приводить к переключению биосинтеза на образование К-1115А в качестве основного продукта [32]. Выравнивание генов выявило, что aln4 у Streptomyces sp. CM020 и S. phaeochromogenes NBC 00034 полностью идентичны, тогда как нуклеотидная последовательность aln4 S. phaeochromogenes БВ-204 отличается от них несколькими заменами. Генетические последовательности гена aln5 у проанализированных штаммов различаются значительно сильнее (Приложения, рис. S9). Вероятно, именно с этим связано, что наш штамм продуцирует только К-1115А.

Анализ генома штамма БВ-204 выявил участки, ответственные за синтез многих вторичных метaболитов, как например, сидерофор коелихелин, однако исследование способности штамма образовывать соединения, хелатирующие железо, с применением метода диффузии в агар [39] дало отрицательные результаты.

Впервые вещество 3,8-дигидрокси-9,10-диоксо-1-пропилантрацен-2-карбоновая кислота было выделено из штамма S. griseorubiginosus (Mer-K1115A), описано как соединение антрахинонового ряда и названо К-1115А [33]. Были изучены противовоспалительные свойства этого соединения, но данные о противомикробной активности К-1115А в литературе не представлены. Существуют публикации об антагонистической активности структурно близкой молекулы 3,8-дигидрокси-1-пропилантрахинон-2-карбоновой кислоты в отношении грамположительных бактерий [40]. Диски с нагрузкой 40 мкг активного вещества давали на газонах S. aureus и S. viridochromogenes зоны ингибирования диаметром 14 и 12 мм соответственно, активности в отношении дрожжей и микромицетов не было выявлено [40]. Необходимо отметить, что, вероятно по ошибке, авторы именовали исследуемую ими молекулу как «К-1115А», при том, что она имеет иную формулу. Еще одно близкородственное соединение, 3,8-дигидрокси-l-метилантрахинон-2-карбоновая кислота, подавляло образование биопленок, формируемых метициллин резистентным стафилококком с ЕС50 200 мкг/мл [41]. Считаем необходимым упомянуть, что на это исследование ссылались в недавней работе, в которой антибактериальная активность была ошибочно приписана «К-1115А». Впервые достоверно антибактериальная активность К-1115А показана в настоящей работе. Существуют данные, что алнумицин и некоторые другие продукты БГК, например, 6-дигидро-8-пропилантрахинон, активны против E. coli ΔtolC [42], однако в наших опытах К-1115А против E. coli ΔtolC активности не показал. К-1115А действовал на вариант штамма E. coli SS_lptd с нарушенным синтезом липополисахаридов оболочки с повышенной проницаемостью клеточной мембраны соответственно. Согласно опубликованным данным, соединения антрахинонового ряда действуют преимущественно на грамположительные микроорганизмы, в частности представителей Staphylococcus, Bacillus, Streptomyces и т.д., но не действуют на грамотрицательные микроорганизмы и грибы [40].

Для веществ антрахиноновой природы в целом характерно ингибирование процессов, вовлеченных в биосинтез ДНК, однако продукты и интермедиаты алнумицинового БГК, в частности сам алнумицин и 1,6-дигидро-8-пропилантрахинон, не связываются с двухцепочечной ДНК и не ингибируют ДНК-гиразу [43]. Исследование К-1115А с помощью репортерной системы pDualrep2 также не обнаружило ингибирующего эффекта на синтез ДНК, однако выявило его способность ингибировать биосинтез белка.

Нами изучено влияние К-1115А на трансляцию в бесклеточной системе in vitro и показано, что данное соединение является ингибитором биосинтеза белка. Установлено, что ЕС50 К-1115А составляет 97% от его МПК, при этом ЕС50 эритромицина в этом исследовании составило 0.8%. Таким образом, для подавления роста клеток концентрация эритромицина должна быть в 125 раз больше, чем для ингибирования собственно трансляции, тогда как в случае К-1115А эти концентрации практически одинаковы. Такой эффект К-1115А несколько отличает его от распространенных ингибиторов трансляции, но не делает его уникальным. Например, аналогичный эффект оказывает известный ингибитор трансляции – хлорамфеникол, имеющий дополнительные механизмы действия, помимо связывания с рибосомой [44]. Это может говорить о том, что ингибирование бактериальной трансляции не единственный механизм противомикробного действия К-1115А либо, например, какие-то ферментные системы микробной клетки модифицируют К-1115А таким образом, что полученная молекула обладает существенно большим ингибирующим действием, чего мы не можем наблюдать в in vitro системе.

Можно также предположить, что нарушение синтеза клеточной мембраны бактерии не является альтернативным механизмом действия, так как в нашем случае вещество действует на штамм с уже нарушенным синтезом ЛПС, но не на штамм, у которого эта структура сохранена. Можно предположить, что дополнительная мишень не связана с взаимодействием с ДНК, несмотря на то, что это характерно для антрахиноновых производных, иначе мы наблюдали бы в эксперименте дополнительно индукцию TurboRFP, свидетельствующую о SOS-ответе.

Стоит отметить, что специфичность данного вещества в отношении грамположительных бактерий и рекомбинантного штамма E. coli SS_lptd с делецией в гене lptD свидетельствует о том, что активность К-1115А в отношении бактериальных клеток в значительной степени определяется проницаемостью клеточных барьеров для этой молекулы.

Для перспективности соединения в качестве агента антимикробной терапии огромную роль играет специфичность его воздействия на клетки патогенных микроорганизмов и безопасность для клеток животных, характеризуемая показателем «терапевтический индекс» (ТИ). Мы исследовали способность К-1115А ингибировать клеточную линию HEK293, для которой EC50 составила 5 мкг/мл, и нескольких модельных патогенов (табл. 1), рассчитали ТИ как отношение EC50 HEK293 к МПК штаммов микроорганизмов.

 

Таблица 1. Способность К-1115А подавлять модельные патогенные штаммы микроорганизмов

Тест-объект	МПК, мкг/мл	ТИ
E. coli SS_lptd	0.625	8
S. aureus (MRSA) INA00761	2.5	2
B. subtilis ATCC 6633	1.25	4
S. aureus SS01	0.625	8
S. aureus 29213	нет*	-
S. aureus ATCC 25923	нет	-
M. smegmatis Ac-1171	нет	-
C. albicans CBS 8836	нет	-

*Подавление отсутствует в исследованном диапазоне.

 

ТИ разных исследованных штаммов, в которых наблюдалось подавляющее действие, находился в диапазоне от 2 до 8, это дает надежды на возможность разработки на основе К-1115А полусинтетических производных, обладающих хорошими клиническими перспективами.

Получены также данные о наличии у продуктов и интермедиатов алнумицинового БГК противоопухолевой активности за счет параптоза [45], аутофагии [45], предотвращения аберрантного клеточного метаболизма [46], повышения радиочувствительности раковых клеток [47], апоптоза и др. [48]. Показано также, что К-1115А обладает противовоспалительными свойствами, оно ингибирует прямое связывание транскрипционного фактора АР-1 с олигонуклеотидом АР-1 и выработку коллагеназы в стимулированных IL-1a синовиальных клетках крыс in vitro. Установлено также, что вещество ослабляет воспалительную реакцию, опосредованную АР-1, за счет снижения активности орнитиндекарбоксилазы у мышей, индуцированных форболмиристатацетатом [31]. Паттерсон и соавт. использовали вещество К-1115А для создания физиологически активных конъюгатов [49].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование современных механизм-ориентированных подходов к классическому скринингу позволяет найти не только новые биологически активные вещества, но и обнаружить новые перспективные свойства ранее открытых, но малоизученных молекул, что дает им шанс стать потенциальным лекарственным средством. Несмотря на то, что соединение К-1115А открыто более 25 лет назад и получены некоторые данные об антибактериальной активности его гомологов, активность данного вещества и механизм его действия до сих пор не были изучены. В этом исследовании нам удалось с помощью двойной репортерной системы pDualrep2 обнаружить продуцента К-1115А, установить, что это соединение ингибирует синтез белка, а также подтвердить этот эффект путем ингибирования трансляции in vitro с использованием мРНК FLuc.

Антрахиноновое производное К-1115А, продуцируемое штаммом S. phaeochromogenes БВ-204, показало активность штамма E. coli SS_lptd с ослабленной клеточной мембраной, а затем на ряде клинически релевантных изолятов S. aureus, в том числе MRSA, B. subtilis. Отсутствие активности в отношении S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, C. albicans CBS 8836, M. smegmatis Ac-1171 дает надежды на специфичность действия в отношении бактериальных мишеней. К-1115А продемонстрировало новое для продуктов БГК алнумицина свойство – способность ингибировать биосинтез белка.

Терапевтический индекс для К-1115А относительно невелик (2–8 у разных штаммов), однако данное вещество может стать основой для разработки полусинтетических производных для антимикробной терапии. Ранее было показано, что К-1115А и его полусинтетические производные обладают противовоспалительной активностью, что вместе с антимикробными свойствами позволяет рассматривать их в качестве перспективных соединений для разработки препаратов комплексной противомикробной и противовоспалительной терапии (например, для обработки ран).

Высокопроизводительный скрининг с использованием системы pDualrep2 значительно повышает эффективность поиска новых ингибиторов синтеза белка даже среди известных соединений, открывая новые свойства и перспективы для целых классов молекул.

Финансирование работы осуществлялось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-10-2021-093; проект [BTH-RND-2127]).

Приложения доступны на сайтеhttps://doi.org/10.32607/actanaturae.27315.

Приложения

 

Таблица S1. Морфологические характеристики роста S. phaeochromogenes БВ-204 на различных индикативных средах

Среда	Пигментация воздушного (ВМ),субстратного мицелия (СМ),наличие растворимых пигментов (РП)	Среда	Цвет воздушного (ВМ),субстратного мицелия (СМ),наличие растворимых пигментов (РП)
ISP2	ВМ: палевый, СМ: темно-бурый, РП: нет	ISP5	ВМ: светло-палевый, СМ: темно-бурый, РП: нет
ISP3	ВМ: розовато-палевый, СМ: темно-бурый, РП: темно-бурый	ISP6	ВМ: отсутствует, СМ: бежевый, РП: нет

 

Таблица S2. Культуральные характеристики штамма S. phaeochromogenes БВ-204 (1) и наиболее ему филогенетически ближайших S. phaeochromogenes JCM 4958 (2), S. umbrinus JCM 4521 (3)

	1	2*	3*
Морфологические и физиологические признаки
Поверхность спор	гладкая	гладкая	гладкая
Форма спороносцев	прямые длинные	прямые или извитые	прямые или извитые
Диапазон температур/оптимальная температура (°C)	8–37/ 28	н/о/28°C	н/о/28°C
Диапазон рН/ рН-оптимум	4.5–8.5/ 7	5–11	5–11
Утилизация источников углерода
Арабиноза	+	+	+
Галактоза	+	н/о	н/о
Глюкоза	+	+	н/о
Инозитол	+	+	н/о
Ксилоза	+	+	+
Лактоза	+	н/о	н/о
Мальтоза	–	н/о	н/о
Маннитол	+	н/о	н/о
Раффиноза	+	н/о	н/о
Рамноза	+	+	+
Сорбитол	–	-	-
Сахароза	+	н/о	н/о
Фруктоза	+	+	+
Разложение субстратов и ферментативная активность
Крахмал	+	н/о	н/о
Желатин	+	+	+
Карбоксиметилцеллюлоза	+	-	-
Оксидаза	+	н/о	н/о
Нитрат-редуктаза	–	н/о	н/о
Устойчивость к антибиотикам
Хлорамфеникол, 34 мкг/мл	+	н/о	н/о
Стрептомицин, 12.5 мкг/диск	+	н/о	н/о
Тетрациклин, 10 мкг/диск	+	н/о	н/о
Спектиномицин, 5 мкг/диск	+	н/о	н/о
Эритромицин, 5 мкг/диск	+	н/о	н/о
Ванкомицин, 5 мкг/диск	37 мм**	н/о	н/о
Левофлоксацин, 5 мкг/диск	16 мм**	н/о	н/о

* Данные о штаммах Streptomyces phaeochromogenes JCM 4958, Streptomyces umbrinus JCM 4521 были взяты из каталога DSMZ Bacdive (https://bacdive.dsmz.de/) и литературных источников [31–33].

** Диаметр зоны отсутствия роста штамма вокруг диска с антибиотиком.

 

Рис. S7. Схема работы репортерной системы

 

Рис. S8. Активность очищенного вещества К-1115А

 

Рис. S9. Выравнивание транслированной аминокислотной последовательности гена аln5

 

Рис. S10. ВЭЖХ-профиль активной ТФЭ-фракции, элюированной 30–40% ацетонитрила. Стрелкой выделен пик активной фракции

 

Рис. S11. Проверка активности ВЭЖХ-фракций

 

Рис. S12. УФ- и масс-спектр пика ВЭЖХ активного компонента

Об авторах

А. Р. Белик

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: metrim@gmail.com
Россия, Сочи, 354340

Ю. В. Закалюкина

Научно-технологический университет «Сириус»; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: juline@mail.ru
Россия, Сочи, 354340; Москва, 119234

В. А. Алферова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: metrim@gmail.com
Россия, Москва, 117997

Ю. А. Буюклян

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: metrim@gmail.com
Россия, Сочи, 354340

И. А. Остерман

Научно-технологический университет «Сириус»; Сколковский институт науки и технологий

Email: metrim@gmail.com
Россия, Сочи, 354340; Москва, 121205

М. В. Бирюков

Научно-технологический университет «Сириус»; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: metrim@gmail.com
Россия, Сочи, 354340; Москва, 119234

Список литературы

Дополнительные файлы