Цис-регуляторная функция промотора гена Pou5f1 в MHC-локусе мыши

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

иПСК – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; ТПК – трофобластоподобные клетки; ЭСК – эмбриональные стволовые клетки; МЭФ – эмбриональные фибробласты мыши; ММС – митомицин C; Fgf4 – фактор роста фибробластов 4; IFNγ – интерферон-гамма; LPS – липополисахарид; MHC – Major Histocompatibility Complex (главный комплекс гистосовместимости); гРНК – гидовая (направляющая) РНК; GR – глюкокортикоидный рецептор.

ВВЕДЕНИЕ

Одним из ключевых факторов, ответственных за поддержание плюрипотентного состояния клеток эпибласта и их культивируемых аналогов – эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), – является белок Oct4, также известный как компонент «коктейля Яманаки» и используемый для репрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) [1]. ЭСК и иПСК, объединенные термином плюрипотентные стволовые клетки (ПСК), обладают способностью к неограниченной пролиферации и дифференцировке в любые типы соматических клеток. Указанные свойства делают эти клетки ценным инструментом для изучения ранних стадий эмбриогенеза, моделирования генетических заболеваний in vitro и разработки подходов для регенеративной медицины. Самоподдержание и выбор направления дифференцировки ПСК критически зависят от экспрессии Oct4 [2], даже небольшие изменения уровня этого белка оказывают существенное влияние на судьбу ПСК [3, 4].

Транскрипционный фактор Oct4 кодируется геном Pou5f1, расположенным в кластере генов главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC). Ген Pou5f1 находится на коротком плече хромосомы 6 человека и на хромосоме 17 мыши (рис. 1). В обоих случаях рассматриваемый локус является одной из самых плотных областей генома [5], включающей большое количество генов, которые кодируют белки, участвующие в реакциях врожденного и адаптивного иммунитета, в частности, отвечающих за процессинг и презентацию антигенов [6].

 

Рис. 1. Схема локуса Pou5f1-MHC. Схематическое изображение локусов Pou5f1-MHC человека (сверху) и мыши (снизу). Исследуемые в работе гены выделены цветом: Pou5f1 – зеленым, гены MHC – оранжевым, гены, предположительно взаимодействующие с Pou5f1, включая Tcf19, – красным. Направление транскрипции генов Pou5f1 и Tcf19 обозначено дополнительно стрелками. Рисунок создан с использованием BioRender

 

Ранее считалось, что для регуляции уровня экспрессии Pou5f1 и, как следствие, нормального функционирования ПСК и их корректного выхода из плюрипотентного состояния достаточно дистального энхансера, взаимодействующего с промотором Pou5f1 в «наивных» ПСК, а также проксимального энхансера, активного в праймированных плюрипотентных клетках [7, 8]. Однако помимо классических регуляторных элементов гена Pou5f1 (промотора, дистального и проксимального энхансеров), описанных еще в 1996 году Yeom и соавт. [9], развитие высокопроизводительных методов секвенирования привело к открытию множества ранее неизвестных цис-регуляторных элементов, влияющих на экспрессию этого гена [10, 11]. Таким образом, стало очевидным, что регуляция гена Pou5f1 представляет собой значительно более тонко настроенный процесс, чем считалось ранее. В настоящий момент функциональная роль всех регуляторных элементов в системе контроля экспрессии Pou5f1 остается недостаточно изученной. В исследовании Diao и соавт. показано, что 17 из 41 обнаруженного регуляторного элемента Pou5f1 являются промоторами других белоккодирующих генов, включая ближайшего соседа Pou5f1-Tcf19 [10], однако не ясно, существует ли обратная цис-регуляторная взаимосвязь между Pou5f1 и окружающими его генами. На мысль о существовании подобной взаимосвязи наталкивают также результаты работы, в которой обнаружили корреляцию между риском возникновения псориаза и наличием полиморфизмов в области промотора и первого экзона гена Pou5f1 [12].

Интерес вызывает также отрицательная корреляция между экспрессией генов Pou5f1 и MHC в ходе развития. Так, считается, что в ЭСК мыши экспрессия генов MHC первого и второго класса находится на низком уровне, возрастая в ходе дифференцировки [13, 14]. При этом экспрессия Pou5f1, согласно основной принятой гипотезе, ограничена ПСК и половыми клетками [9]. Исходя из этого можно предположить, что активность гена Pou5f1 может переключаться с белоккодирующей на цис-регуляторную, необходимую для регуляции активирующихся генов MHC. Такой механизм действия согласуется с данными, полученными на животных, у которых делеция промотора Pou5f1 в гладкомышечных и эндотелиальных клетках приводила к заметному ухудшению атеросклеротического фенотипа, а именно к уменьшению стабильности бляшек, накоплению липидов, воспалению, снижению митохондриального потенциала в эндотелиальных клетках и снижению миграции гладкомышечных клеток [15, 16].

В настоящей работе нами создана генетическая модель, позволяющая оценить цис-регуляторную функцию промоторной области Pou5f1 в отношении генов локуса Pou5f1-MHC в ЭСК и их дифференцированных потомках. Добившись дифференцировки ЭСК в трофобластном направлении с помощью форсированной экспрессии Cdx2, мы не обнаружили роли промоторной области Pou5f1 в регуляции экспрессии различных генов MHC-локуса. Однако наши данные выявили репрессорную активность промотора Pou5f1 в отношении гена Tcf19 как в ЭСК мыши, так и в трофобластных производных этих клеток.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение митотически инактивированных эмбриональных фибробластов мыши

Эмбриональные фибробласты мыши (МЭФ) выделяли в соответствии с действующими зоозащитными актами Российской Федерации при одобрении Совета по этике Института (протокол № 12/23).

МЭФ, полученные из эмбрионов мышей линии C57Bl6 на 12–14-й день развития, культивировали на адгезивном пластике, предварительно обработанном 0.1% раствором желатина (Sigma, США). Клетки культивировали в среде DMEM GlutaMAX (Gibco, США), содержащей 10% HyClone FBS (Cytiva, США) и 1×пенициллин/стрептомицин (Gibco). Спустя 4–5 пассажей, по достижении конфлюэнтности, МЭФ инкубировали в течение 2.5 ч в среде с добавлением 10 мкг/мл митомицина-C (MMC, Sigma). По окончании инкубации клетки промывали PBS и криоконсервировали для последующего использования.

Культивирование ЭСК

ЭСК мыши культивировали при температуре 37°C во влажной среде в атмосфере 5% CO₂ на адгезивных планшетах. В качестве подложки использовали фидерный слой митотически инактивированных эмбриональных фибробластов мыши (ММС-МЭФ) плотностью 36 × 10³ клеток/см², высеваемых на лунки за сутки до внесения ЭСК. Клетки культивировали в стандартной ЭСК среде S/L, включающей KnockOut DMEM (Gibco), обогащенной 15% HyClone FBS (Cytiva), 1×NEAA (Gibco), 1×пенициллин/стрептомицин (Gibco), 0.1 мМ β-меркаптоэтанол (Sigma-Aldrich), 2 мМ L-глутамин (Gibco) и 1:5000 hLIF собственного производства.

Для перевода ЭСК в наивное плюрипотентное состояние использовали среду 2i/L, включающую N2B27 (смесь DMEM/F12 (Gibco) и Neurobasal (1 : 1), обогащенную 1× N2, 1× B27 (без ретиноевой кислоты, Gibco), 50 мкМ β-меркаптоэтанол (Sigma-Aldrich), 0.005% BSA (Sigma), 1× пенициллин/стрептомицин (Gibco) и 2 мМ L-глутамин (Gibco)) с добавлением 3 мкМ CHIR99021 (Axon), 1 мкМ PD0325901 (Axon) и 1 : 5000 hLIF. Планшеты для культивирования обрабатывали 0.01% раствором поли-L-орнитина (Sigma).

Плазмиды

Плазмида Rosa26-GOF-2APuro-MUT была получена на основе плазмиды Rosa26-GOF-2APuro, описанной ранее [17]. Rosa26-GOF-2APuro-MUT содержит фрагмент 9.8 т.п.н. гена Pou5f1 с его проксимальным и дистальным энхансерами, плечи гомологии к локусу Rosa26 и ген устойчивости к селективному маркеру пуромицину. Также в PAM-сайт первого экзона гена Pou5f1 в плазмиде Rosa26-GOF-2APuro была внесена точечная синонимичная мутация, предотвращающая нокаут экзогенного Pou5f1.

Плазмиду pRosa26-GR-Cdx2, содержащую последовательность Cdx2, «сшитую» с лигандсвязывающим доменом глюкокортикоидного рецептора (GR), лигировали с использованием ранее полученных конструкций [18]. Плазмида также содержит ген устойчивости к генетицину и плечи гомологии к локусу Rosa26.

Для внедрения конструкций в аллели локуса Rosa26 использовали последовательность гидовой РНК (гРНК) 5’-ACTCCAGTCTTTCTAGAAGA-3’ в паре с Cas9-никазой.

CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут Pou5f1 проводили с помощью гРНК 5’- ACTCGTATGCGGGCGGACAT-3’, кодируемой вектором pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-EGFP. гРНК-последовательности были подобраны с помощью онлайн-ресурса Benchling (www.benchling.com).

Получение мутантных линий ЭСК

Для создания линии ЭСК Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 на первом этапе получали клетки Pou5f1^+/+; Rosa26^Pou5f1/+, содержащие в локусе Rosa26 последовательность Pou5f1 c синонимичной заменой в области первого экзона (в качестве донорской последовательности использовали вектор Rosa26-GOF-2APuro-MUT). Далее для нокаута эндогенного Pou5f1 ЭСК Pou5f1^+/+; Rosa26^Pou5f1/+ трансфицировали гРНК-/Cas9-кодирующей плазмидой. Трансфекцию проводили с использованием FuGene HD (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Нокаут эндогенных аллелей Pou5f1 и интактность экзогенной конструкции в локусе Rosa26 подтверждали с помощью секвенирования по Сэнгеру ТА-клонированных аллелей (рис. 2), для чего ампликоны этих аллелей клонировали в вектор pAL2-T («Евроген»).

 

Рис. 2. Нуклеотидные последовательности эндогенных аллелей Pou5f1 в линии Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/+, три биологических повторности. Обозначения: -/- 1–3 – номера клонов ЭСК Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/+

 

Для получения ЭСК Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 и Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 во второй аллель Rosa26 вышеописанных линий ЭСК помещали последовательность GR-Cdx2. В качестве донорской последовательности использовали вектор Rosa26-GR-Cdx2. Отбор колоний проводили в течение 6 дней с использованием антибиотика генетицина (G418) в концентрации 500 мкг/мл.

Трофобластная дифференцировка

Линии ЭСК Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 и Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 культивировали в среде S/L с добавлением антибиотиков G418 (500 мкг/мл, Neofroxx) и пуромицина (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich). Клетки затем переводили в наивное состояние, культивируя их в 2i/L-условиях на протяжении 7 дней, после чего пересевали на лунки, покрытые слоем ММС-МЭФ и культивировали в TS-среде, которую готовили на основе среды RPMI 1640 (Gibco) с добавлением 20% HyClone FBS (Cytiva), 1 мМ пирувата натрия (Gibco), 1× пенициллин/стрептомицина (Gibco), 0.1 мМ β-меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich), 2 мМ L-глутамина (Gibco), 1 мкг/мл гепарина (Hep) (Sigma-Aldrich) и 25 нг/мл фактора роста фибробластов 4 (Fgf4) (Peprotech). Среду предварительно кондиционировали на ММС-МЭФ на протяжении 72 ч. Для культивирования клеток использовали смесь кондиционированной и свежей среды в соотношении 7 : 3. На следующий день после пересева к клеткам добавляли дексаметазон (1 мкМ, Белмедпрепараты), а также G418 (500 мкг/мл, NeoFroxx). Спустя 4 дня клетки пересевали и культивировали в стандартной или моделирующей воспаление TS-среде. Последняя дополнительно включала 300 ед/мл интерферона-гамма (IFNγ, ProSpec) или 1 мкг/мл липополисахарида E. coli (LPS, Sigma-Aldrich). Спустя сутки после индукции провоспалительного ответа в клетках анализировали экспрессию маркеров трофобласта.

Количественная ОТ-ПЦР

РНК выделяли при помощи набора RNA Solo («Евроген»), а для синтеза кДНК использовали 1 мкг тотальной РНК. Синтез кДНК проводили в присутствии ингибитора РНКаз RiboСare и ревертазы MMLV («Евроген»). ПЦР в реальном времени проводили с помощью системы LightCycler® 96 (Roche) с использованием 5 × qPCRmix-HS SYBR («Евроген»). Специфичность праймеров и оптимальные температуры отжига (T_о) предварительно проверяли с помощью ПЦР и электрофореза в 4% агарозном геле. Последовательности праймеров, а также подобранные Т_о приведены в табл. 1. В качестве референсного гена использовали ген домашнего хозяйства GAPDH. Для каждой линии использовали не менее трех биологических и двух технических повторностей.

 

Таблица 1. Олигонуклеотиды, использованные для количественной ПЦР в реальном времени

Праймер	Нуклеотидная последовательность 5’→3’	T, °C	Размер ампликона, п.н.
qGAPDH-F	ACCCTTAAGAGGGATGCTGC	60	83
qGAPDH-R	CGGGACGAGGAAACACTCTC
qOct4A-F	AGTGGAAAGCAACTCAGAGG	60	135
qOct4A-R	AACTGTTCTAGCTCCTTCTGC
qCdx2-F	AGTCCCTAGGAAGCCAAGTGAA	60	96
qCdx2-R	AGTGAAACTCCTTCTCCAGCTC
qCdx2GR-F	GCTGAAATCATCACCAATCAGATAC	60	134
qCdx2GR-R	CGCACGGAGCTAGGATACAT
qCdx2endo-F	AGGCTGAGCCATGAGGAGTA	60	125
qCdx2endo-R	ctGAGGTCCATAATTCCACTCA
qMash2-F	CGGGATCTGCACTCGAGGATT	65	86
qMash2-R	CCCCGTACCAGTCAAGGTGTG
qTcfap2C-F	CGTCTCTCGTGGAAGGTGAAG	60	114
qTcfap2C-R	CCCCAAGATGTGGTCTCGTT
qHand1-F	CCTACTTGATGGACGTGCTGG	60	129
qHand1-R	TTTCGGGCTGCTGAGGCAAC
qElf5-F	CATTCGCTCGCAAGGTTACT	60	133
qElf5-R	GAGGCTTGTTCGGCTGTGA
qH2-K1-F	TCCACTGTCTCCAACATGGC	60	113
qH2-K1-R	CCACCTGTGTTTCTCCTTCTCA
qH2-Q6,8-F	CTGACCCTGATCGAGACCCG	60	112
qH2-Q6,8-R	TGTCCACGTAGCCGACGATAA
qH2-Q7,9-F	GAGCTGTGGTGGCTTTTGTG	68	85
qH2-Q7,9-R	TGTCTTCATGCTGGAGCTGG
qH2-Q10-F	ACATTGCTGATCTGCTGTGGC	60	120
qH2-Q10-R	GTCAGGTGTCTTCACACTGGAG
qH2-Dmb1-F	ATGGCGCAAGTCTCATTCCT	68	95
qH2-Dmb1-R	TCTCCTTGGTTCCGGGTTCT
qH2-Bl-F	ACCGGCTCCAACATGGTAAA	60	114
qH2-Bl-R	AGGAAGGATGGCTATTTTTCTGCT
qH2-T23-F	ATAGATACCTACGGCTGGGAAATG	60	105
qH2-T23-R	AGCACCTCAGGGTGACTTCAT
qTcf19-F	GATGATGAGGTCTCCCCAGG	60	107
qTcf19-R	TTTCCCTGTGGTCATTCCCC
qPsors1C2-F	CTGTGTGCAGGAGGCATTTC	68	86
qPsors1C2-R	AGGGATCACCAGGGATTGGG
Gm32362-F	GTCTGGAGAACCAAAGACAGCA	60	114
Gm32362-R	TTACAGCTTGGGATGCTCTTC
Prrc2a-F	GAGATCCAGAAACCCGCTGTT	60	104
Prrc2a-F	TTCAGGCTTGGAAGGTTGGC
Neu1-F	CCGGGATGTGACCTTCGAC	60	127
Neu1-R	CAGGGTCAGGTTCACTCGGA
TNF-F	GTGCCTATGTCTCAGCCTCTT	60	117
TNF-R	AGGCCATTTGGGAACTTCTCATC

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение линий контрольных ЭСК с нокаутом гена Pou5f1

Для исследования цис-регуляторной роли промотора гена Pou5f1 в ЭСК и полученных из них дифференцированных клетках использовали созданную нами ранее линию ЭСК с Cre-опосредованной делецией фланкированных loxP-сайтами промотора и первого экзона гена Pou5f1. Эти клетки поддерживают плюрипотентное состояние благодаря экспрессии экзогенного, встроенного в локус Rosa26 фрагмента гена Pou5f1 – Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/+ [17]. Делеция в созданной линии идентична делеции, полученной при исследовании роли транскрипционного фактора Oct4 в гладкомышечных и эндотелиальных клетках мыши, моделирующих атеросклероз [15, 16]. Для решения поставленной задачи мы дополнили полученную ранее линию новой, контрольной линией – Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/+, в которой нокаут эндогенного Pou5f1 получен за счет indel-мутаций в первом экзоне. Как и в случае с линией Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/+, экспрессия Oct4 обеспечивалась за счет фрагмента 9.8 т.п.н. Pou5f1, помещенного в один из аллелей Rosa26 (рис. 2). Таким образом, мы избавились от вариабельности в экспрессии Oct4 между двумя линиями ЭСК, которая бы неизбежно возникла при использовании линии Pou5f1^Δ/+. Важно подчеркнуть, что в аллеле Pou5f1^- сохранен интактный промотор, что позволяет оценить его функции при сравнении с аллелем Pou5f1^Δ. Ранее мы обнаружили, что аллель Rosa26^Pou5f1 может обеспечивать самоподдержание Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/+ ЭСК, однако такие клетки не способны нормально дифференцироваться, что, как мы заключили, обусловлено отсутствием в 9.8 т.п.н. Pou5f1-фрагменте цис-регуляторных элементов, ответственных за корректную регуляцию гена в ходе дифференцировки [17]. Таким образом, направленная дифференцировка Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/+ и Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/+ ЭСК представляет отдельную задачу, которую нужно было решить в ходе настоящего исследования.

Оценка способности полученных ЭСК к дифференцировке в трофобластном направлении

В качестве направления дифференцировки мы выбрали трофобластную дифференцировку. Известно, что клетки трофобласта, окончательно сегрегирующие на стадии поздней бластоцисты в виде троф­эктодермы, после имплантации способствуют формированию иммунотолерантности организма матери к плоду за счет активного синтеза неклассических МНС [19]. Также известно, что сегрегация трофобласта сопровождается выключением гена Pou5f1 [20], что, как мы ожидали, может способствовать переключению активности его промоторной области с регуляции самого Pou5f1 на регуляцию окружающих генов MHC-кластера [21]. Исходя из этого мы заключили, что трофобластная дифференцировка может послужить подходящей моделью для оценки динамики экспрессии генов в локусе Pou5f1-МНС.

В основу протокола дифференцировки легла форсированная экспрессия Cdx2, ключевого мастер-регулятора трофобласта [22, 23], также встраиваемого в локус Rosa26. Форсированная экспрессия была выбрана в качестве самой логичной альтернативы дифференцировки при помощи сред и ростовых факторов из-за ее простоты и наличия опубликованных протоколов. Для управляемой трофобластной дифференцировки использовали Cdx2 в составе химерного белка с лигандсвязывающим доменом глюкокортикоидного рецептора (GR), активация которого требовала добавления в среду дексаметазона (Dex). Финальная конфигурация линий ЭСК Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 и Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 представлена на рис. 3А.

 

Рис. 3. Используемые линии клеток и протокол эксперимента. А – схематическое изображение сравниваемых линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Обозначения: «Δ/Δ» – линия ЭСК Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 с делецией эндогенного промотора Pou5f1; «-/-» – линия ЭСК Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 c интактным эндогенным промотором и инактивирующей indel-мутацией в первом экзоне гена; P – промотор, 1–5 – экзоны гена Pou5f1, 2A-PuroR – сайт P2A и ген устойчивости к пуромицину PuroR, GR – лигандсвязывающий домен глюкокортикоидного рецептора, NeoR – ген устойчивости к G418/неомицину. Б – схема дифференцировки ЭСК в трофобластном направлении (см. «Экспериментальную часть» для текстового описания). Обозначения: Fgf4 – фактор роста фибробластов 4, Hep – гепарин, Dex – дексаметазон, IFNγ – интерферон-гамма, LPS – липополисахарид, ТПК – трофобластоподобные клетки. Рисунок создан с использованием BioRender

 

Так как эффективность дифференцировки ЭСК в трофэктодермальном направлении при форсированной экспрессии Cdx2 зависит от стадии плюрипотентности, на которой находятся клетки [24], на первом этапе дифференцировки ЭСК Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 и Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 переводили в наивное состояние посредством 7-дневного культивирования в среде 2i/L. Кроме того, данную экспериментальную точку использовали в качестве дополнительной для отслеживания динамики изменения экспрессии исследуемых генов. Второй, основной, точкой исследования был 6 день культивирования клеток в присутствии дексаметазона, что соответствовало 14 дню всего эксперимента (рис. 3Б).

По мере прохождения стадий дифференцировки, клетки куполообразных колоний, характерных для ЭСК в сывороточной среде S/L, и шарообразных колоний, характерных для «наивных» ЭСК, к 6 дню культивирования в присутствии Dex формировали плоские колонии с хорошо различимыми границами клеток угловатой формы, типичными для описанных ранее [22, 23] колоний трофобластных стволовых клеток (рис. 4А).

 

Рис. 4. Подтверждение способности линий ЭСК Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 и Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 к дифференцировке в трофобластном направлении. А – морфологические характеристики клеток на разных этапах дифференцировки: сывороточные (S/L) условия культивирования (слева), наивные (2i/L) условия культивирования (в центре) и индуцированные обработкой Dex в течение 6 дней трофэктодермальные клетки (справа). Б – анализ экспрессии трофобластных маркеров (Cdx2, Tcfap2C, Mash2, Hand1) в ходе дифференцировки в сравнении с плацентой. Обозначения как на рис. 3А. *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001 по ANOVA

 

При анализе профиля экспрессии маркеров на 6-й день дифференцировки в присутствии дексаметазона в обеих линиях выявили существенное снижение уровня мРНК Oct4 (в сравнении с наивными ЭСК) и повышение уровня мРНК трофэктодермальных маркеров. В качестве контроля уровня экспрессии мРНК трофобластных маркеров мы использовали плаценту мыши. Уровень общего Cdx2 в обеих линиях ЭСК был значительно выше, чем в плаценте. При дифференциальном анализе уровня эндогенного Cdx2 и мРНК, синтезированной за счет экзогенного GR-Cdx2, стало ясно, что подобное различие в уровне общего Cdx2 обусловлено индуцированной сверхэкспрессией GR-Cdx2. При этом уровень эндогенного Cdx2 также возрастал и был сопоставим с уровнем Cdx2 в плаценте. Не обнаружено статистически значимых различий в экспрессии Cdx2 между линиями Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 и Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2, что важно для правильной интерпретации результатов. Показана также экспрессия других трофоэктодермальных маркеров в полученных ТПК (Tcfap2C, Mash2, Hand1) (рис. 4Б).

Оценка влияния промоторной области Pou5f1 на экспрессию генов локуса Pou5f1-МНС

В ходе эксперимента клетки были разбиты на группы и подвергнуты воздействию IFNγ или липополисахарида (LPS). IFNγ и LPS часто используются в различных in vitro и in vivo моделях воспаления, исходя из чего мы предполагали, что индукция провоспалительных сигналов будет способствовать повышенной экспрессии генов, связанных с иммунным ответом, в том числе генов MHC, что позволит оценить различия в экспрессии исследуемых генов между клеточными линиями с большим разрешением. Тем не менее различия в экспрессии ряда генов MHC (H2-K1, H2-T23, H2-Bl, H2-Dmb1, H2-Q6,8, H2-Q7,9) были вызваны только условиями культивирования, но не отличались между Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 и Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 ЭСК (рис. 5А). Единственным из генов, чья экспрессия статистически значимо различалась между ЭСК двух генотипов, был Tcf19 (рис. 5Б). Следует отметить, что в недифференцированных ЭСК Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2, культивируемых в наивных (2i/L) условиях, экспрессия Tcf19 была уже повышена по сравнению с ЭСК Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 (рис. 5В).

 

Рис. 5. Сравнение экспрессии генов локуса Pou5f1-MHC между линиями Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 и Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 в стандартных и провоспалительных условиях культивирования. А, Б – сравнение относительного уровня мРНК между линиями ЭСК Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 и Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 спустя 6 дней культивирования с дексаметазоном (Dex) в стандартных и провоспалительных (с добавлением IFNγ или LPS) условиях. Представлены результаты анализа экспрессии генов МНС классов I и II (А) и генов локуса Pou5f1-МНС с ранее показанной цис-регуляторной активностью в отношении Pou5f1 (Б). В – сравнение экспрессии генов из (Б) в недифференцированных ЭСК Pou5f1^Δ/Δ; Rosa26^Pou5f1/Cdx2 и Pou5f1^-/-; Rosa26^Pou5f1/Cdx2, культивируемых в 2i/L-условиях. Обозначения как на рис. 3А; *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001 по ANOVA. С использованием теста Тьюки сравнивали линии Δ/Δ и -/- при каждом условии культивирования, а также между условиями

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Наличие активности гена Pou5f1 вне общепринятой концепции плюрипотентности – вопрос, на который до сих пор нет однозначного ответа. С одной стороны, опубликованные работы свидетельствуют об отсутствии функциональной роли Pou5f1 в дифференцированных клетках млекопитающих, обосновывая это отсутствием фенотипического ответа на нокаут этого гена и потенциальными ошибками в интерпретации данных, полученных с использованием методов иммуноокрашивания и ОТ-ПЦР [25–27]. С другой стороны, достаточно убедительными выглядят и новые данные, полученные с использованием методов функциональной генетики, которые демонстрируют функцию Pou5f1 в соматических клетках. К таким исследованиям относятся работы, в которых описан эффект нокаута Pou5f1 в гладкомышечных и эндо­телиальных клетках, а также работа Zalc и соавт., которые обнаружили реактивацию Pou5f1 в краниальных клетках нервного гребня и обосновали ее роль в увеличении дифференцировочного потенциала этого типа клеток в ходе эмбриогенеза [15, 16, 28].

Наше предположение могло бы интегрировать описанные результаты с точки зрения цис-регуляторных свойств промотора Pou5f1, с одной стороны, подтверждая активность этого гена, а с другой – отвязывая ее от продукта этого гена, белка Oct4.

Выяснение точного механизма функционирования гена Pou5f1 в контексте атеросклероза является актуальной задачей, решение которой представляет не только фундаментальный интерес, но и крайне важно для последующего использования в медицине. Так, если, например, эффекты, описанные на моделях атеросклероза, ассоциированы с транскрипционным фактором Oct4, то в качестве потенциального эффекторного белка в терапии этого заболевания следует рассматривать именно Oct4. Если же атеросклеротический фенотип связан с цис-регуляторной активностью промотора Pou5f1, то акцент в терапии должен быть смещен в сторону модуляции этой активности.

В отличие от подхода, представленного в настоящей работе, модели, созданные ранее для изучения гена Pou5f1, были разработаны прежде всего для исследования его функции в ПСК, а плюрипотентное состояние клеток поддерживали с помощью трансгенной кДНК Pou5f1 под управлением промоторов с конститутивной экспрессией [3, 29]. Наш подход не только позволил получить изогенную пару линий с инактивируемой в процессе направленной дифференцировки экспрессией Pou5f1, но и дал возможность сравнивать их за счет идентичной локализации экзогенного Pou5f1, что было бы невозможно с использованием, например, лентивирусных векторов. Мы полагаем, что разработанная модель сможет помочь ответить на вопрос об активности гена Pou5f1 в дифференцированных клетках. Эта работа стала первым шагом в этом направлении. И хотя мы не обнаружили масштабного влияния удаления промоторной области Pou5f1 на экспрессию генов локуса MHC, один из исследуемых генов, Tcf19, оказался восприимчивым к внесенным модификациям. Интересно, что этот ген является ближайшим соседом Pou5f1, что, возможно, облегчает взаимодействия между их регуляторными последовательностями. С другой стороны, учитывая, что наблюдаемые различия между линиями появляются на плюрипотентной стадии, наиболее вероятным можно считать механистический сценарий действия внесенной делеции. Так, в случае конкуренции со стороны транскрипционной машинерии расположенных друг напротив друга генов Tcf19 и Pou5f1, блокируя транскрипцию одного из них – Pou5f1 (за счет удаления его промотора), мы освобождаем пространство для экспрессии второго – Tcf19. И, хотя мы совершенно не ожидали такого точечного эффекта, он наиболее логичен с точки зрения основной концепции плюрипотентности. Являясь транскрипционно активным в плюрипотентных клетках, Pou5f1, изменяя свою активность (за счет, например, определенных мутаций), может влиять на экспрессию Tcf19, вызывая цепную реакцию нарушения в регуляции генов в дочерних клетках, в том числе не плюрипотентных, что уже в свою очередь может приводить к различным патологиям. Это неплохо объясняет результаты изучения полиморфизмов Pou5f1, ассоциированных с псориазом [12], особенно учитывая связь Tcf19 с этим заболеванием [30, 31]. Интересно, что Tcf19 также может участвовать в воспалительных реакциях, что связывает наши результаты с данными, полученными на моделях атеросклероза [32, 33]. Точкой расхождения в данном вопросе то, что в экспериментах, проведенных на мышиных моделях атеросклероза, нокаут Pou5f1 был условным, т.е. индуцируемым в гладкомышечных или эндотелиальных клетках сосудов. Тем не менее, не исключено, что удаление даже метилированной области Pou5f1 может приводить к усилению экспрессии Tcf19, что требует дополнительного изучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе мы смогли создать уникальную генетическую модель для исследования значимости последовательности промотора гена Pou5f1 в регуляции активности генов, не играющих ключевую роль в плюрипотентных клетках и, как следствие, поиска его неклассических функций в дифференцированных клетках. Нам удалось частично подтвердить гипотезу о цис-регуляторной активности промоторной области Pou5f1 в отношении генов локуса Pou5f1-MHC, а точнее, в отношении его ближайшего соседа – гена Tcf19. Дальнейшие исследования будут направлены на уточнение регуляторного ландшафта локуса Pou5f1-MHC в дифференцированных клетках других типов.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2021-1075 от 28.09.2021 г.) – получение и культивирование линий клеток, а также гранта Российского научного фонда № 24-75-10131, https://rscf.ru/project/24-75-10131/ – дифференцировка и количественная ОТ-ПЦР.

Об авторах

В. В. Ермакова

Институт цитологии Российской академии наук

Email: a.kuzmin@incras.ru
Россия, Санкт-Петербург

Е. В. Александрова

Институт цитологии Российской академии наук

Email: a.kuzmin@incras.ru
Россия, Санкт-Петербург

А. А. Кузьмин

Институт цитологии Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: a.kuzmin@incras.ru
Россия, Санкт-Петербург

А. Н. Томилин

Институт цитологии Российской академии наук

Email: a.tomilin@incras.ru
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы