Потенциал и использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в генной и клеточной терапии ретинопатий и оптических нейропатий

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CRISPR – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами; ГКС – ганглиозные клетки сетчатки; LHON – наследственная оптическая нейропатия Лебера; DOA – аутосомно-доминантная атрофия зрительного нерва; ПР – пигментный ретинит; ЭСК – эмбриональные стволовые клетки; ИПСК – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; ЭРГ – электроретинограмма; ЭТЦ – электрон-транспортная цепь; АФК – активные формы кислорода; HDR – гомологически направленная репарация; NHEJ – негомологичное соединение концов; OCR – скорость потребления кислорода; LCA – врожденный амавроз Лебера.

ВВЕДЕНИЕ

В 2007 году показали, что зрелые соматические фибробласты можно перепрограммировать в состояние стволовых клеток за счет сверхэкспрессии четырех плюрипотентных транскрипционных факторов (так называемых факторов Яманака) – OCT3/4, SOX2, C-MYC и KLF4 [1]. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) имеют морфологию эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека и экспрессируют их генетические маркеры.

Сверхэкспрессия коктейля транскрипционных факторов позволяет репрограммировать cоматические клетки пациента в ИПСК [1–3], которые обладают такими важными характеристиками, как:

– способность дифференцироваться в клетки всех зародышевых листков (эктодерма, мезодерма и энтодерма);

– способность неограниченно размножаться при сохранении нормального кариотипа, что позволяет постоянно получать клеточный материал [4–6].

Развитие методологии работы с ИПСК человека привело к созданию концепции «болезни в чашке» («disease-in-a-dish»). B настоящее время комбинация ИПСК с технологией редактирования генома, анализом регуляции метаболических путей и оценка фенотипа до редактирования и после являются мощным инструментом изучения развития глазных болезней, включая редкие формы наследственных заболеваний сетчатки глаза, и позволяют разрабатывать способы тестирования эффективности лекарственных препаратов и новых терапевтических подходов.

Генная терапия зачастую является единственным вариантом коррекции наследственных заболеваний. Чаще всего используют заместительную терапию, при которой генетический дефект исправляют путем введения функциональной копии гена в клетки пациента. ИПСК, полученные из первичных клеток пациентов, являются релевантной и удобной моделью как для in vitro скрининга и оценки эффективности генотерапевтических препаратов, так и для предсказания потенциальных побочных эффектов терапии и увеличения профиля безопасности продукта.

Для доставки генетического материала используют катионные полимеры, липидные наночастицы и векторные системы на основе различных вирусов. Катионные полимеры способны проникать внутрь клеточного ядра, при этом они могут разрушать клеточные мембраны и оказывать таким образом токсическое действие на клетку [7]. Липидные наночастицы, заключающие ДНК в липосомы, сливаются с клеточной мембраной, высвобождая генетический материал в клетку [8]. К недостаткам доставки с использованием липидных наночастиц ДНК относится низкая эффективность, обусловленная деградацией комплексов липосом с ДНК лизосомами клетки. В качестве векторов чаще всего используют вирусы, обеспечивающие при однократном введении эффективную доставку и экспрессию терапевтического гена, приводящую к длительному ответу на терапию пациентов с тяжелыми генетическими заболеваниями. Разнообразие вирусных векторов дает возможность варьировать специфичность доставки к клеткам [9]. Однако при выборе вирусного вектора следует обязательно учитывать его потенциальную иммуногенность, а также риски инсерционного мутагенеза при использовании интегративных вирусов.

Достижения в области редактирования генома и получения ИПСК открыли новую ветвь генной терапии в сочетании с клеточной терапией. Методика редактирования патогенных генотипов пациента in vitro и введения скорректированных ИПСК для коррекции фенотипа лишены минусов классической генной терапии, поскольку обеспечивают иммуносовместимость с реципиентом и позволяют контролировать качество ИПСК до трансплантации [10].

Следует отметить, что основным трендом в использовании ИПСК в генной терапии является разработка способов редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9 и ее аналогов, тогда как работы по заместительной генной терапии практически полностью отсутствуют. Далее будут представлены данные об использовании ИПСК в качестве моделей в основном для оценки эффективности редактирования аутосомно-доминантных мутаций.

В обзоре рассмотрены in vitro моделирование двух наиболее распространенных типов патологий зрительной системы – наследственных нейропатий и ретинопатий, и разработка терапевтических стратегий с использованием ИПСК. Обсуждаются также трансляционные достижения клеточной и генной терапии.

ГЕННАЯ И КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ НЕЙРОПАТИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИПСК

Оптические нейропатии, обусловленные гибелью ганглиозных клеток сетчатки и дегенерацией аксонов зрительного нерва, являются основной причиной потери зрения и слепоты во всем мире [11, 12]. Ганглиозные клетки сетчатки (ГКС) – это специализированные нейроны, аксоны которых образуют зрительный нерв, проводящий информацию от глаза к мозгу [13]. Глаукома – прогрессирующая оптическая нейропатия, характеризующаяся структурными изменениями диска (головки) зрительного нерва и необратимой потерей зрения, – наиболее распространенная патология, диагностированная более чем у 60 млн человек [14–19]. Другие оптические нейропатии, такие, как наследственная нейропатия Лебера (LHON) и аутосомно-доминантная атрофия зрительного нерва (DOA), проявляются в более раннем возрасте и вызываются мутациями в митохондриальных генах.

Генная терапия нейропатий

LHON – характеризуется потерей центрального зрения и встречается преимущественно у мужчин. Большая часть мутаций при этом заболевании найдена в митохондриальных генах, кодирующих белки первого комплекса электрон-транспортной цепи (ЭТЦ), MT-ND4 (m.11778G>A), MT-ND1 (m.3460G>A), MT-ND6 (m.14484T>C). Патогенез LHON связан со сниженной генерацией АТР и накоплением активных форм кислорода (АФК), что приводит к гибели ГКС, атрофии зрительного нерва и, соответственно, к потере центрального зрения сначала в одном глазу, а далее во втором.

Исследователями из Австралии были получены ИПСК от пациента с гомоплазматическими двойными мутациями мтДНК (m.4160T>C и m.14484T>C), приходящиеся на гены MT-ND1 и MT-ND6 соответственно. Такой генотип приводит к так называемой «LHON plus», при которой дополнительно развиваются неврологические симптомы, отличные от оптической нейропатии, например, двигательные расстройства. С помощью цибридной технологии митохондрии в этих ИПСК заменили на митохондрии без мутаций. Уровни апоптоза и АФК в ГКС, полученных из отредактированных ИПСК, были ниже, чем в контрольных ГКС, содержащих мутации [20].

DOA – заболевание, вызываемое митохондриальной дисфункцией, проявляется снижением остроты зрения в раннем возрасте и далее слепотой. При DOA наблюдается повреждение ГКС и их аксонов, образующих зрительный нерв. В основном мутации, приводящие к DOA, локализованы в гене OPA1, кодирующем белок внутренней мембраны митохондрий, дисфункция которого влияет на слияние митохондрий, продукцию АТР, сигналинг апоптотических факторов, метаболизм кальция и поддержание целостности митохондриального генома [21].

В ИПСК, полученных от пациента с мутацией 1334G>A (R445H) в OPA1, проведена коррекция мутации с помощью комбинации технологии CRISPR/Cas9 и механизма гомологичной рекомбинации (HDR), где в качестве матрицы использовали ssDNA. Скорость потребления кислорода (OCR) в отредактированных ИПСК была выше, чем в клетках с мутациями, которые характеризовались снижением митохондриальной фрагментации, а также более низкой продукцией апоптотических сигналов [21].

Клеточная терапия нейропатий

Заместительная клеточная терапия с использованием ИПСК является привлекательным подходом к лечению нейропатий и ретинопатий, особенно на более поздних стадиях патологического процесса, когда произошла значительная потеря клеток. Также считается, что в некоторых случаях трофические факторы, высвобождаемые стволовыми клетками, могут способствовать процессу регенерации при трансплантации. На животных моделях оптической нейропатии была доказана эффективность клеточной терапии на основе ИПСК [22, 23]. Ганглиозные клетки, происходящие из ИПСК, могут интегрироваться и выживать после трансплантации в сетчатку мышей, служащих моделью заболевания [22]. Более того, трансплантация клеток-предшественников, полученных из ИПСК, способствовала заживлению повреждения зрительного нерва у крыс со значительным восстановлением вызванных потенциалов [23].

Следует отметить, что клеточная терапия нейропатий зрительного нерва может использоваться для получения клеток, отличных от ганглиозных. Так, Abu-Hassan D.W. и соавт. показали, что трансплантация клеток трабекулярной сети, полученных из ИПСК, может восстанавливать гомеостатическую функцию в ex vivo перфузированной модели органной культуры переднего сегмента глаза человека [24], открывая тем самым новый интересный подход к лечению глаукомы.

В настоящее время отсутствуют сообщения о проведении клинических испытаний клеточной терапии при нейропатии зрительного нерва, однако проводятся клинические испытания по замещению клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из ИПСК [25, 26]. Недавно компания Advanced Cell Technology, специализирующаяся на стволовых клетках, сообщила об успешном завершении фазы I/IIa клинических испытаний суспензии клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из ЭСК, трансплантированных при связанной с возрастом макулярной дегенерации и болезни Штаргардта [25, 26]. Сообщалось об улучшении зрения без серьезных побочных эффектов или иммунных реакций после трансплантации низкой дозы дифференцированных из ЭСК клеток в один глаз у 18 пациентов. Не получено данных об отторжении трансплантированных клеток, неконтролируемой пролиферации или серьезных глазных или системных проблемах. Отмечено улучшение зрительных функций у большей части пациентов, а испытания достигли целевых конечных точек по безопасности. Кроме того, команда под руководством профессора Масайо Такахаши из Японии готовится к проведению клинических испытаний с использованием ретинального эпителия, полученного из ИПСК, для лечения связанной с возрастом макулярной дегенерации [26]. Эти клинические испытания подтвердят концептуальную возможность использования плюрипотентных стволовых клеток для восстановления функциональности пораженных тканей, предоставив новый альтернативный вариант эффективного и безопасного лечения слепоты, вызванной различными патологическими процессами.

ГЕННАЯ И КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ РЕТИНОПАТИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИПСК

Наследственной ретинопатией считается любое генетическое заболевание, приводящее к поражению сетчатки глаза и, как следствие, к ухудшению зрения. Распространенность этой группы заболеваний составляет около 3 человек из 100. Наиболее частыми симптомами ретинопатий являются изменение полей зрения, неспособность адаптироваться к плохому освещению, искажение форм, размеров объектов и изменение цветовосприятия. Данные о молекулярных процессах заболеваний получены в основном на моделях фибробластов, так как получить образцы сетчатки не представляется возможным. Использование с этой целью ИПСК может позволить получить более релевантную модель заболевания.

По своему типу различают ретинопатии макулярные и периферические. При макулярных ретинопатиях (например, болезнь Штаргардта и Беста) поражается центральная часть сетчатки – макула. При периферических ретинопатиях нарушается периферическое зрение. К наиболее распространенным заболеваниям этой группы относятся пигментный ретинит и хороидеремия [27].

Самыми тяжелыми и ранними формами наследственных заболеваний сетчатки считаются различные типы врожденного амавроза Лебера (LCA), приводящего к потере зрения при рождении или вскоре после него. При этом заболевании возможно также развитие повышенной светочувствительности, непроизвольное движение глаз (нистагм) и дальнозоркость. В редких случаях наблюдается задержка умственного развития.

Применение генотерапевтических подходов к лечению наследственных ретинопатий

Существует не менее 20 типов LCA, обусловленных разными мутациями в разных генах, а также фенотипическими проявлениями. К наиболее распространенным патологическим мутациям при LCA относятся мутации в генах CEP290, CRB1, GUCY2D, RPE65. При этом примерно в 30% случаев молекулярно-генетические причины LCA не найдены [28]. Так белок, кодируемый геном CEP290, участвует в клеточном делении, сборке микротрубочек, формировании центросом и ресничек. Мутации в этом гене приводят к наиболее тяжелой форме LCA – LCA типа 10 [29]. До 15% всех мутаций CEP290 представлены мутацией IVS26 – 2991+1655 A>G в интроне 26, приводящей к включению экзона со стоп-кодоном (С998Х). Получаемый в случае этой мутации укороченный пептид обеспечивает лишь частичную активность CEP290. Модель ИПСК, полученная от пациента с таким генотипом, была отредактирована с помощью CRISPR/Cas9. По сравнению с мутациями в кодирующей части гена, где требуется использование матрицы для рекомбинации, мутации сайта сплайсинга можно скорректировать специфической делецией. Так, редактирование ИПСК с удалением сайта сплайсинга в области IVS26 привело к повышенной продукции функционального CEP290 [29].

Генная терапия с использованием некодирующей РНК, нацеленной на IVS26, оказалась эффективной в модели 3D-органоида сетчатки, полученной из ИПСК пациента. Полностью фосфоротиоированный и 2’-O-метил-модифицированный РНК-олигонуклеотид (QR-110) корректировал дефект сплайсинга CEP290 и восстанавливал дикий тип мРНК. Показано дозозависимое восстановление ресничек фоторецепторов [30].

LCA типа 4, обусловленный мутациями в гене AIPL1, характеризуется тяжелым нарушением зрения в младенчестве и прогрессирующей атрофией фоторецепторных клеток. C помощью CRISPR/Cas9 и HDR с эффективностью 30% был отредактирован органоид сетчатки, полученный от ИПСК пациента с мутацией 834 G>A (Trp278X) гена AIPL1. Показано восстановление экспрессии AIPL1, повышение количества сGMP и PDE6 в клетках после редактирования [31].

LCA типа 7, составляющий около 2% всех LCA, характеризуется ранней дисфункцией фоторецепторов, вызванной мутациями в гене CRX (кодирует гомеобокссодержащий белок колбочек-палочек). Опосредованное NHEJ (негомологичное соединение концов) CRISPR/Cas9-редактирование мутации 263А>C (K88Q) в гене CRX в модели органоидов сетчатки способствовало развитию и созреванию фоторецепторных клеток. Интересно, что стратегия редактирования предполагала внесение двух двухцепочечных разрывов. Один был нацелен на мутацию, а другой – на аллель-специфические SNP между экзонами 2 и 4 гена CRX [32].

Пигментный ретинит (ПР) – затрагивающее сетчатку глаза наследственное заболевание с прогрессирующей потерей фоторецепторных клеток. Пациенты ощущают проблемы с ночным и периферическим зрением, хотя полная слепота достаточно редка. Манифестация начинается, как правило, в детском возрасте. Одной из возможных причин ПP является мутация в гене родопсина (RHO) [33]. Родопсин – зрительный пигмент, содержащийся в палочках сетчатки, является трансмембранным рецептором, связанным с G-белками, конформация которого изменяется при поглощении квантов света. Родопсин активирует G-белок трансдуцин, активирующий cGMP-зависимую фосфодиэстеразу, что в дальнейшем приводит к изменению проницаемости cGMP-зависимых ионных каналов, гиперполяризации мембраны и возникновению нервного импульса [34]. Используя зависимый от вируса-помощника аденовирусный вектор (HDAdV), осуществляли редактирование мутации в ИПСК пациента с мутацией, ведущей к замене E181K в молекуле родопсина. Дифференцированные в фоторецепторные клетки ИПСК после редактирования характеризовались сниженным уровнем аутофагии за счет подавления апоптоза, вызванного стрессом ЭПР. Перенос генов HDAdV осуществляли путем гомологичной рекомбинации без внесения разрывов в ДНК [34].

Удалось также отредактировать с помощью CRISPR/Cas9 мутацию 68C>A (P23H) в этом же гене на модели ИПСК. В клетках дикого типа (контрольных) не наблюдали неспецифического редактирования, в то время как в мутантных клетках в результате редактирования происходили сдвиг рамки считывания и терминация (трансляции), что приводило к инактивации мутантного аллеля [29].

Пигментный ретинит, сцепленный с X-хромо­сомой, встречается у мужчин с частотой 1 на 15 000 человек и проявляется потерей ночного зрения, а затем периферического зрения и полной слепотой к 40 годам. Мутации в этом случае локализуются в гене RPGR, кодирующем регулятор GTP-азы пигментного ретинита, влияющим на развитие фоторецепторных клеток, так как является компонентом взаимодействия центросомы и ресничек. Около 16% случаев ПP связаны с мутациями в RPGR. С помощью CRISPR/Cas9 и HDR проведено редактирование ИПСК пациента с мутацией 3070 G>T в гене RPGR, где одноцепочечная матрица не имела мутации. Несмотря на то, что этот ген является GC-богатым и содержит нуклеотидные повторы, эффективность редактирования составила 13% [35]. Известны случаи делеции в экзоне 14 гена RPGR, приводящие к сдвигу рамки считывания и потере последовательноcтей, кодируемых экзонами 15–19. Такие мутации приводят к нарушению цилиогенеза, поэтому реснички фоторецепторных клеток у пациентов с таким дефектом укорочены. ИПСК, полученные от пациентов с вариантами мутаций RPGR (1685_1686delAT, 2234_2235delGA и 2403_2404delAG), были отредактированы с помощью CRISPR/Cas9 с использованием HDR. Полученные 3D-органоиды сетчатки имели нормальную морфологию, экспрессировали рековерин, содержали большее количество палочек и колбочек по сравнению с контролем [36].

Другим Х-сцепленным заболеванием является Х-сцепленный ювенильный ретиношизис, который характеризуется дегенеративной нейропатией и отслоением сетчатки. Ювенильный ретиношизис развивается преимущественно у мужчин, а его частота составляет примерно 1:10000. Это заболевание обусловлено мутациями в гене RS1, вовлеченном в клеточную организацию сетчатки и межклеточную адгезию. Получены модели ИПСК от пациентов с мутациями 625C>T (R209C) и 488G>A (W163X). Отредактированные c помощью CRISPR/Cas9 и HDR ИПСК показали 50% эффективность редактирования, но также и наличие инсерций. Эффективность опосредованного Cas9-ABE7.10 редактирования оснований в случае 625C>T оказалась сравнимой с подходом, использующим принцип HDR [37].

Мутации в генах PRPF, приводящие к ПP типа 13, являются аутосомно-доминантными и объединяют около 15% случаев пигментного ретинита. Белок, кодируемый PRPF8, играет важную роль в сплайсинге пре-мРНК, он является основным компонентом сплайсосомы типа U2 и U12 и отвечает за размещение сплайсосомы на пре-мРНК. С помощью CRISPR/Cas9-Gem (эндонуклеаза Cas9 и белок геминин) проведено редактирование ИПСК с мутацией 6901 C>T (P2301S) в гене PRPF8 за счет HDR. В отредактированных ИПСК, дифференцированных в эпителиальные клетки сетчатки, восстановились морфология и апикально-базальная полярность, способность фагоцитировать внешние сегменты фоторецепторов. Cas9-Gem использовали для деградации системы в фазе G0/G1 для снижения вероятности инсерций, вызванных NHEJ [38].

С помощью системы CRISPR/Cas9 и HDR проведено редактирование ИПСК пациента с мутацией 1115_1125del11 в гене PRPF31, кодирующем компонент сплайсосомного комплекса пре-мРНК (11-й тип пигментного ретинита). Такое редактирование привело к восстановлению молекулярных и клеточных фенотипов индуцированных органоидов сетчатки [39].

Ген MERTK, мутации в котором приводят к аутосомно-рецессивному пигментному ретиниту, кодирует рецепторную тирозинкиназу, передающую сигналы из внеклеточного матрикса в цитоплазму. Этот фермент участвует в процессах дифференцировки, выживания клеток и фагоцитозе апоптотических клеток. Мутация 992_993delCA в гене MERTK была скорректирована в ИПСК, полученных от пациента, системой CRISPR/Cas9 и HDR. Дифференцированные в пигментные клетки сетчатки редактированные ИПСК восстановили экспрессию MERTK и функции фагоцитов по сравнению с мутантными вариантами [40, 41].

Основной причиной рецессивного пигментного ретинита у этнических евреев является инсерция Alu длиной 354 п.н. в гене MAK, кодирующем серин/треониновую протеинкиназу, участвующую в регуляции клеточного цикла и важную для регуляции длины ресничек и выживания фоторецепторных клеток. Опосредованное CRISPR/Cas9 редактирование с HDR ИПСК с инсерцией Alu привело к восстановлению транскрипта MAK [29].

Синдром усиленного ответа S-колбочек опосредован мутацией гена NR2E3, кодирующего транскрипционный фактор, активатор развития палочек и репрессор развития колбочек. Для этого синдрома характерна атрофия сетчатки с последующей потерей зрения. S-колбочки – один из трех типов колбочек сетчатки, наименее распространенный в нормальной сетчатке человека. Мутации в гене NR2E3 приводят к дефектам дифференцировки с образованием большого количества S-колбочек и отсутствию палочек. Нокаут мутантного аллеля в ИПСК пациента с мутацией 166G>A (G56R) в гене NR2E3, проведенный с помощью CRISPR/Cas9 и NHEJ, привел к нормальному функционированию и развитию фоторецепторов палочек в дифференцированных органоидах сетчатки [42].

Синдром Ашера – заболевание, на поздних стадиях которого наблюдается потеря зрения (в результате пигментного ретинита), а ранее – потеря слуха, возможны также нарушения вестибулярного аппарата. Одной из причин заболевания является мутация гена MYO7A, который кодирует миозин – моторный белок сетчатки, участвующий в обновлении наружных дисков фоторецепторов, способствующий распределению и миграции меланосом и фагосом пигментного эпителия сетчатки, а также связанный с регуляцией транспорта опсина в фоторецепторах сетчатки. Полученные от пациента с мутациями MYO7A (c.1184 G>A и c.4118C>T) ИПСК были редактированы с помощью CRISPR/Cas9 и HDR. После чего наблюдали морфологическое (в виде слипания стереоцилии) и функциональное (в виде восстановления мембранного потенциала) восстановление дифференцированных отредактированных волосковых клеток [43]. Также синдром Ашера ассоциирован с мутациями в гене USH2A, кодирующим белок ушерин, который участвует в процессах звуко- и световосприятия в комплексе USH2. В фоторецепторах сетчатки комплекс USH2 поддерживает комплекс перицилиарной мембраны, который играет роль в регуляции внутриклеточного транспорта белков. В ИПСК пациентов использовали CRISPR-eSpCas9 и HDR для исправления мутаций 2276G>T (C759F) и 2299delG (E767Serfs*21), расположенных на расстоянии 22 п.н. друг от друга в экзоне 13 гена USH2A. Достигнуты 15% эффективность редактирования и восстановление экспрессии USH2A, кроме того, ИПСК сохранили геномную стабильность и плюрипотентность [44, 45].

Клеточная терапия ретинопатий

На животных моделях ретинопатий доказана эффективность клеточной терапии на основе ИПСК. Так, сетчатку, полученную из ИПСК человека, трансплантировали в субретинальное пространство обезьян с лазер-индуцированным повреждением сетчатки и иммунодефицитным крысам с пигментным ретинитом. Трансплантированные клетки интегрировались в сетчатку крысы и образовывали синаптические связи с биполярными клетками хозяина. В модели обезьян трансплантированные клетки интегрировались в сетчатку хозяина; зафиксировано и улучшение электроретинограммы (ЭРГ) [46]. Аналогично, в модели пигментного ретинита у мышей субретинальная трансплантация ретинальных сфероидов, полученных из ИПСК, задерживала истончение сетчатки, увеличивала уровень фактора, производного пигментного эпителия (PEDF), уменьшала количество апоптотических клеток, а также уменьшала инфильтрацию микроглии в сетчатку [47]. У крыс с наследственной мутацией гена протоонкогенной тирозинкиназы MER (MERTK) как модели дегенерации сетчатки субретинальная трансплантация клеток РПЭ, полученных из ИПСК, значительно восстанавливала зрительную функцию, измеренную порогами оптокинетического отслеживания. Ни у одного животного не было выявлено аномальной пролиферации или образования тератом [48]. Интересно, что совместная трансплантация различных типов ретинальных клеток, полученных из ИПСК, показывала лучшие результаты по сравнению с трансплантацией отдельных типов клеток, это приводило к лучшему зрительному ответу и сохранению внешнего нуклеарного слоя в модели дегенерации сетчатки у крыс [49]. В животной модели пигментного ретинита субретинально трансплантированные предшественники фоторецепторов, экспрессирующие CRX, происходящие из ИПСК, встраивались во внутренний ядерный слой клеток. Пересаженные клетки экспрессировали маркер аррестин 3, что указывало на их дальнейшее созревание [50].

В доклиническом исследовании на крысах и свиньях ИПСК, полученные из клеток CD34+ пациентов с макулярной дистрофией сетчатки, при дифференцировке в клетки ретины интегрировались и восстанавливали сетчатку. В этом исследовании обнаружено, что для достижения терапевтического эффекта при пересадке монослоя требовалось в 10 раз меньше клеток, чем при использовании суспензии клеток. При этом клетки ретины, трансплантированные в виде суспензии, не смогли интегрироваться в слой ретинальных клеток крысы, каркас на основе поли(молочно-когликолевой кислоты) (PLGA) способствовал интеграции трансплантированного слоя клеток в мембрану Бруха крысы [51].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хотя использование ИПСК в исследованиях оптических нейропатий и ретинопатий является относительно новым подходом, нет сомнений в том, что эта технология обладает высоким потенциалом как с точки зрения изучения патогенеза заболеваний, так и с точки зрения апробации и оптимизации методов генной терапии и генетического редактирования (рис. 1, табл. 1). Моделирование заболеваний с использованием ИПСК позволяет изучать основные механизмы, ведущие к потере ганглиозных или ретинальных клеток, а заместительная клеточная терапия с использованием ИПСК, полученных из собственных соматических клеток пациента, имеет минимальный риск иммунного отторжения после трансплантации и уже демонстрирует высокую эффективность на различных моделях. Генная терапия в сочетании с заместительной клеточной терапией может быть использована для коррекции генетических дефектов в клетках, полученных из ИПСК, перед трансплантацией.

 

Таблица 1. Изучение потенциала генотерапевтических подходов и генетического редактирования наследственных ретинопатий и оптических нейропатий на моделях ИПСК

Заболевание	Мутация	Тип наследования	Подход к лечению	Основные эффекты/результат
LHON*1	m.4160T>C(MT-ND1) и m.14484T>C(MT-ND6)	Материнское, митохондриальное	Замена митохондрий, создание цибридов	Снижение апоптотических эффектов и уровня АФК*2 в дифференцированных ГКС*3 [20]
DOA*4	1334G>A (OPA1)	Аутосомно-доминантный	CRISPR-редактирование с HDR*5	Увеличение OCR*6 в редактированных ИПСК*7 и уменьшение сигналов апоптоза [21]
LCA*8	2991+1655A > G (CEP290)	Аутосомно- рецессивный	CRISPR-редакти­рование с NHEJ*9, РНК-интерференция	Повышенная продукция функционального CEP290. Восстановление ресничек фоторецепторов [29, 30]
	834G>A (AIPL1)	Аутосомно- рецессивный	CRISPR-редактирование с HDR	Восстановление экспрессии AIPL1, повышение количества cGMP*10 и PDE6 в клетках органоида сетчатки [31]
	263А>C (CRX)	Аутосомно- рецессивный	CRISPR-редактирование с NHEJ	В модели органоидов сетчатки, полученных от ИПСК пациентов, способствовало развитию и созреванию фоторецепторных клеток [32]
Пигментный ретинит	541 G>A (RHO)	Аутосомно-доминантный	Рекомбинация с геномом HDAdV	Дифференцированные в фоторецепторные клетки ИПСК после редактирования проявили сниженную аутофагию [34]
	68C>A (RHO)	Аутосомно-доминантный	CRISPR-редактирование с NHEJ	Инактивация мутантного аллеля [29]
	3070G>T (RPGR)	Х-сцепленный	CRISPR-редактирование с HDR	Восстановление нуклеотидной последовательности [35]
	1685_1686delAT, 2234_2235delGA и 2403_2404delAG (RPGR)	Х-сцепленный	CRISPR-редактирование с HDR	Органоиды сетчатки демонстрировали нормальную морфологию [36]
	6901C>T (PRFP8)	Аутосомно-доминантный	CRISPR-редактирование с HDR	Морфология, способность фагоцитировать были восстановлены в дифференцированных, отредактированных ИПСК в эпителиальные клетки сетчатки [38]
	1115_1125del11 (PRPF31)	Аутосомно-доминантный	CRISPR-редактирование с HDR	Восстановление молекулярных и клеточных фенотипов в индуцированных органоидах сетчатки [39]
	992_993delCA (MERTK)	Аутосомно-рецессивный	CRISPR-редактирование с HDR	Восстановление экспрессии MERTK и функции фагоцитов [40, 41]
	Инсерция Alu длиной 354 п.н. (MAK)	Аутосомно-рецессивный	CRISPR-редактирование с HDR	Восстановление транскрипта MAK [29]
Х-сцепленный ювенильный ретиношизис	625C >T, 488G>A (RS1)	Х-сцепленный	CRISPR-редактирование оснований при помощи ABE7.10	Восстановление нуклеотидной последовательности [37]
Синдром усиленного ответа S-колбочек	166G>A (NR2E3)	Аутосомно-рецессивный	CRISPR-редактирование с NHEJ	Нормальное функционирование и развитие фоторецепторов палочек в дифференцированных органоидах сетчатки [42]
Синдром Ашера	c.1184G>A и c.4118C>T (MYO7A)	Аутосомно-рецессивный	CRISPR-редактирование с HDR	Морфологическое (в виде слипания стереоцилии) и функциональное восстановление (в виде восстановления мембранного потенциала) [43]
	2276G>T (USH2A)	Аутосомно-рецессивный	CRISPR-редактирование с HDR	Восстановление нуклеотидной последовательности [44, 45]

*¹ – наследственная оптическая нейропатия Лебера; *² – активные формы кислорода; *³ – ганглиозные клетки сетчатки; *⁴ – аутосомно-доминантная атрофия зрительного нерва; *⁵ – гомологически направленная репарация; *⁶ – скорость потребления кислорода; *⁷ – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; *⁸ – врожденный амавроз Лебера; *⁹ – негомологичное соединение концов; *¹⁰ – циклический гуанозинмонофосфат.

 

Рис. 1. Подходы к генной терапии наследственных ретинопатий/нейропатий на моделях ИПСК. А – замена митохондрий, создание цибридов на модели LHON. Б – CRISPR-редактирование с HDR на модели DOA. В – CRISPR-редактирование NHEJ на модели LCA. Г – РНК-интерференция на модели LCA. Д – рекомбинация с геномом вируса HDAdV на модели пигментного ретинита. Е – CRISPR-редактирование оснований при помощи ABE7.10 на модели Х-сцепленного ювенильного ретиношизиса

 

ИПСК обладают огромным трансляционным потенциалом в широком спектре терапевтических областей, а отработка и совершенствование протоколов для повышения эффективности и чистоты полученных из ИПСК ганглиозных и ретинальных клеток будут иметь решающее значение для создания стандартизированной методологии использования ИПСК в моделировании заболеваний, скрининге лекарств, токсикологических исследованиях, клеточной и генной терапии, регенеративной медицине.

Финансирование проекта осуществлялось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-10-2021-093; Проект GTH-RND-2112).

Об авторах

Е. В. Лапшин

Научный центр трансляционной медицины, Научно-технологический университет «Сириус»

Автор, ответственный за переписку.
Email: evgeniy_lapshins@list.ru
Россия, 354340, Краснодарский край, пгт Сириус

Ю. Г. Гершович

Научный центр трансляционной медицины, Научно-технологический университет «Сириус»

Email: jg.gershovich@gmail.com
Россия, 354340, Краснодарский край, пгт Сириус

А. В. Карабельский

Научный центр трансляционной медицины, Научно-технологический университет «Сириус»

Email: karabelskiy.av@talantiuspeh.ru
Россия, 354340, Краснодарский край, пгт Сириус

Список литературы

Дополнительные файлы