Effect of retinal laser photocoagulation on the risk of choroidal neovascularization in experimental animals

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Studies were performed on 5 mice of the C57Black/C line and nonlinear albino mice. The mice retinas were exposed to laser treatment followed by ophthalmoscopy and pathohistological examination on 14 days of the experiment. After 2 weeks, grade I–IV coagulations were determined ophthalmoscopically. Damage of the retinal pigment epithelium in mice by laser irradiation with a wavelength of 532 nm and doses from 0.05 to 0.37 W/cm2 did not lead to the formation of pathological choroidal neovascularization.

Full Text

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) – одна из основных причин слепоты у людей старше 50 лет, характеризующаяся ростом аномальных хориоидальных сосудов в наружном слое сетчатки, вызывая появление субретинальной жидкости, кровоизлияний и фиброза, что, в конечном итоге, приводит к потере центрального зрения [1].

Возрастная макулярная дегенерация – мультифакториальное заболевание, факторами риска которой являются возраст, курение, окислительный стресс, метаболический синдром и атеросклероз, приводящие к нарушению кровотока в хориоидальных сосудах сетчатки и повышению экспрессии гена VEGF-A. Ранние стадии ВМД связывают с атрофией сосудов и ишемией сетчатки, тогда как поздние стадии характеризуются хориоидальной неоваскуляризацией (ХНВ) сосудов сетчатки [2].

Классически выделяют две формы ВМД – атрофическая, или сухая, возникающая в 80–90 % случаев и проявляющаяся в виде апоптоза пигментного эпителия, сосудов хориоидеи и фоторецепторов, и, экссудативная, или влажная, встречающаяся в 10 % случаев, для которой характерен патологический рост аномальных хориоидальных сосудов в наружном слое сетчатки, прорастающих через мембрану Бруха и вызывающих появление субретинальной жидкости, кровоизлияний и фиброза [3].

Воспроизведение модели хориоидальной неоваскуляризации на животных позволяет проводить фундаментальные исследования с целью разработки новых методов лечения данной патологии. По данным литературы, известен метод создания модели хориоидальной неоваскуляризации у мышей при выполнении последовательной лазерной коагуляции сетчатки [4]. Авторы продемонстрировали возможность создания модели хориоидальной неоваскуляризации с помощью лазера Iridex (США) с длиной волны 532 нм у мышей за счет последовательного повреждения пигментного эпителия сетчатки.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Анализ результатов влияния энергии лазерного воздействия на риск возникновения хориоидальной неоваскуляризации у мышей.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования были проведены на 5 пигментированных половозрелых мышах линии C57Black/C и 5 половозрелых нелинейных мышах-альбиносах весом 20–25 г (ООО «НПК БиоТех», г. Москва), прошедших 2-недельный карантин в виварии НЦИЛС ФГБОУ ВО ВолгГМУ.

Все манипуляции с лабораторными животными и условия их содержания сопровождались соблюдением всех требований лабораторной практики при проведении доклинических исследований в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики»). Все экспериментальные исследования проводились в соответствии со статьей 11 Федерального закона от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» и согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики»). Процедуры с участием лабораторных животных осуществлялись с учетом этических норм обращения с животными, принятыми в Директиве Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. «О защите животных, использующихся для научных целей». Экспериментальное исследование одобрено этическим комитетом (справка № 2022/043 от 02.12.2022 года).

Непосредственно перед экспериментом животные наркотизировались путем внутрибрюшинного введения хлоралгидрата в дозе 400 мг/кг. Медикаментозный мидриаз достигался инстилляцией 15 мкл мидримакса (Sentiss Pharma Pvt. Ltd.) на конъюнктиву глаза.

На фоне седации при сохранении температуры тела животного на уровне осветителя ассистентом удерживалась мышь в положении на боку. Предметное стекло с каплей карбомера помещали на роговицу правого глаза и фокусировали световой поток щелевой лампы с лазерной апертурой на пигментный эпителий сетчатки вокруг диска зрительного нерва. Лазерные коагуляты на сетчатке формировали с помощью лазерной установки Iridex OcuLight GL (США). В отличие от человеческого глаза у глаза мыши нет четко выраженной макулы, поэтому лазерное воздействие выполнялось вокруг диска на расстоянии 1 ДД от его края, с получением микровзрыва мембраны Бруха и парагазового пузырька.

Применяли следующие параметры лазерного воздействия: мощность лазерного импульса в диапазоне от 70 до 200 мВт, экспозиция от 0,05 до 0,1 мс и диаметр пятна в диапазоне от 50 до 150 мкм, количество импульсов – от 1 до 4. Дозу лазерного излучения (А) определяли по формуле:

А= Р × T/C,

где Р – энергия излучения (Вт), Т – время экспозиции (с), С – площадь светового пятна луча лазера (см2) = ПD2/4.

На 14-й день эксперимента лабораторные животные подвергались эвтаназии под наркозом (400 мг/кг хлоралгидрата внутрибрюшинно), глазные яблоки были энуклеированы, для фиксации был использован свежеприготовленный модифицированный раствор Давидсона [5].

Далее материал подвергался обезвоживанию в спиртах восходящей крепости и заключался в парафиновую среду Histomix. С помощью микротома были получены срезы толщиной 4–6 мкм, которые далее фиксировали на предметном стекле. Срезы окрашивали гематоксилином и эозин-флоксином по стандартной методике [6]. Изучение и фотофиксация микропрепаратов производилась на микроскопе AxioScope A1, оборудованном цифровой камерой AxioCam MRc5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При первичной офтальмоскопии до начала манипуляций диск зрительного нерва у мышей был бледно-розовым, границы четкие. Сосуды ДЗН дихотомически делились с равным калибром на 2, 4, 8 и 10 часах. Сетчатка была серовато-розового цвета без анатомических ориентиров макулы и отсутствием фовеолярного рефлекса. С помощью лазерного воздействия наносились ожоги на сетчатку по вышеописанной технологии с получением коагулята от серого до интенсивно белого цвета. Через неделю при осмотре визуализировался атрофический с пигментом очажок без офтальмоскопических признаков хориоидальной неоваскуляризации.

Через 2 недели при офтальмоскопии определялись коагуляты I–IV степени по классификации L’Esperance F. Хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ) не выявлена ни в одном из случаев.

В табл. представлены значения лазерного воздействия при выполнении коагуляции сетчатки и обнаруженные визуальные изменения в сетчатке во время процедуры и через 2 недели после ее завершения.

По данным патоморфологического исследования сетчатки пигментированных мышей и мышей-альбиносов выявлены признаки отека в слое нервных волокон, перицеллюлярный отек в ганглионарном слое от выраженной степени до умеренно выраженной.

 

Доза лазерного воздействия и визуальные изменения в сетчатке у мышей во время и через 2 недели после вмешательства

Номер мыши

Параметры лазерного воздействия

Доза лазерного излучения,
Вт/см
2

Изменения 
в сетчатки
после ЛК

Степень лазерного
коагулята
через 2 недели

1–3

Мощность 70 мВт, экспозиция 0,05 мс, диаметр пятна 100 мкм

0,045

Белое пятно без перифокального отека

1

4

Энергия лазерного импульса 90 мВт, экспозиция 0,08 мс, диаметр пятна 100 мкм

0,092

Бело-серое пятно без перифокального отека

2

5

Мощность 100 мВт, экспозиция 0,08 мс, диаметр пятна 100 мкм

0,102

Бело-серое пятно без перифокального отека

2

6–9

Мощность 150 мВт, экспозиция 0,1мс, диаметр пятна 100 мкм

0,19

Белое пятно с перифокальным отеком

2

10

Энергия лазерного импульса 90 мВт, экспозиция 0,08 мс, диаметр пятна 50 мкм

0,37

Белое ватообразное пятно с перифокальным отеком

4

 

Обнаружены выраженные дистрофические изменения в нейронах ганглионарного слоя в виде набухания перикарионов и появления сморщенных нейронов с пикнотичными ядрами. Кроме того, явления умеренно выраженного перицеллюлярного отека были выявлены во внутреннем ядерном слое, в отдельных случаях – в наружном ядерном слое. В единичных случаях выявлялись аневризматически расширенные капилляры. Во внутреннем ядерном слое были обнаружены дистрофические изменения в перикарионах нейронов.

Во всех случаях были выявлены признаки выраженного или умеренно выраженного отека в слое палочек и колбочек (рис.).

 

Рис. Гистологическое строение сетчатки глаза мыши на 14-й день после лазерной процедуры. Окраска гематоксилин-эозином. Общее увеличение ×400

 

Таким образом, через 2 недели при офтальмоскопии определялись коагуляты I–IV степени по классификации L’Esperance F. Хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ) не выявлена ни в одном из случаев.

Вероятно, для достижения результата модели лазер-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации необходимо последовательно, более длительно, поэтапно оказывать лазерное воздействие с повреждением пигментного эпителия сетчатки до возникновения хориоидальной неоваскуляризации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Повреждение у мышей пигментного эпителия сетчатки лазерным излучением с длиной волны 532 нм и дозами от 0,05 до 0,37 Вт/см2 характеризовалось появлением коагулятов I–IV степеней по классификации L’Espe-rance F без признаков хориоидальной неоваскуляризации.

Гистологически у подопытных животных развивались выраженные дистрофические изменения в нейронах ганглионарного слоя сетчатки, что сопровождалось явлениями отека, наиболее выраженным в слое нервных волокон, ганглионарном слое и в слое палочек и колбочек без признаков роста хориоидельной неоваскуляризации.

 

***

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

×

About the authors

Sergey V. Ivanov

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Author for correspondence.
Email: mntk@isee.ru
ORCID iD: 0000-0002-6303-9493

Candidate of Medical Sciences, Director

Russian Federation, Volgograd

Yulia Yu. Khzardzhan

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Email: mntk@isee.ru
ORCID iD: 0000-0002-2996-5960

Candidate of Medical Sciences, Head of the Ophthalmological Department

Russian Federation, Volgograd

Alexey V. Smirnov

Volgograd State Medical University

Email: milanaumenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5351-6105

MD, Head of the Department of Pathological Anatomy

Russian Federation, Volgograd

Lyudmila V. Naumenko

Volgograd State Medical University

Email: milanaumenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2119-4233

MD, Professor, Department of Pharmacology and Bioinformatics

Russian Federation, Volgograd

Alena S. Taran

Volgograd State Medical University

Email: milanaumenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8477-254X

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics

Russian Federation, Volgograd

Alina M. Chebanko

Volgograd State Medical University

Email: milanaumenko@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-3140-5040

Assistant Professor at the Department of Pharmacology and Bioinformatics

Russian Federation, Volgograd

Maria A. Balalina

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Email: mntk@isee.ru

Ophthalmologist at the Ophthalmological Department

Russian Federation, Volgograd

Victoria V. Chubarikova

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Email: mntk@isee.ru

Ophthalmologist at the Ophthalmological Department

Russian Federation, Volgograd

Maxim A. Korotkov

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Email: mntk@isee.ru

Ophthalmologist at the Ophthalmological Department

Russian Federation, Volgograd

Irina V. Solovyova

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Email: mntk@isee.ru

Ophthalmologist at the Ophthalmological Department

Russian Federation, Volgograd

References

  1. Yangieva N.R., Tuychibaeva D.M., Agzamova S.S., Abaskhanova N.Kh. Assessment of the state of organization of ophthalmological care for patients with age-related macular degeneration in primary health care. Oftal’mologiya. Vostochnaya Evropa = Ophthalmology. Eastern Europe. 2024;14(2):250. (In Russ.).
  2. Markovets A.M., Kolosova N.G. Age-related macular degeneration and participation of vascular endothelial growth factor in its pathogenesis. Rossiiskii oftal’mologicheskii zhurnal = Russian Ophthalmological Journal. 2009;2(3):51–58. (In Russ.).
  3. Fayzrakhmanov R.R., Bosov E.D., Bogdanova V.A. et al. Morphofunctional features of the retinal pigment epithelium in norm and in age-related macular degeneration. Literature review. Oftal’mologiya = Ophthalmology. 2024;21(1):44–50. (In Russ.).
  4. Lambert V., Lecomte J., Hansen S. et al. Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice. Nature protocols. 2013;8(11):2197–2211.
  5. Latendresse J.R., Warbrittion A.R., Jonassen H. fixation of testes and eyes using a modified davidson’s fluid: comparison with bouin’s fluid and conventional davidson’s fluid. Toxicologic pathology. 2002;30(4):524–533.
  6. Sarkisov D.S., Perov Yu.L. Microscopic technique. Manual. Moscow: Medicine, 1996. 544 p. (In Russ.).

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
2. Fig. Histological structure of the mouse retina on the 14th day after the laser procedure. Hematoxylin and eosin staining. Total magnification ×400

Download (380KB)

Copyright (c) 2025 Иванов С.V., Хзарджан Ю.Y., Смирнов А.V., Науменко Л.V., Таран А.S., Чебанько А.M., Балалина М.A., Чубарикова В.V., Коротков М.A., Соловьева И.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».