Comparison of bee samples stored in different concentrations of two alcohols

Full Text

Для консервирования проб пчел с целью измерения их экстерьера используют в основном метилкарбинол (С₂Н₆О), в других отраслях, наряду с метилкарбинолом, все более широкое применение находит диметилкарбинол (C₃H₈O), так как он менее летуч. В настоящее время диметилкарбинол применяют в качестве заменителя во многих областях использования метилкарбинола, в том числе в медицине и товарах личной гигиены – так как в качестве антисептика он не уступает метилкарбинолу [1], обладает относительно низкой токсичности [2] и не является веществом, подлежащим особому контролю.

Для измерения экстерьера консервирование пчел производят, в основном, в растворе метилкарбинола концентрации 70 об. % [3], но в литературе присутствуют данные о консервировании в концентрации 50 об. % [4].

Цель исследования – снижение расходов на консервирование одной пробы и поиск альтернативного консерванта. Для этого нами проведено сравнение двух спиртов (метилкарбинола и диметилкарбинола) различных концентраций. Эксперимент проводили в лаборатории ФГБНУ «ФНЦ пчеловодства». Объектами исследования были пробы пчел, хранящиеся в концентрациях 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 70 об. % метилкарбинола и диметилкарбинола.

Для определения влияния на пробы пчел диметилкарбинола, а также различных концентраций метилкарбинола и диметилкарбинола были заготовлены образцы пчел и законсервированы в этих спиртах с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 70 об. %. По истечении 6, 18 и 36 месяцев пробы пчел были отправлены для определения общего микробного числа (ОМЧ) в Центр стандартизации и метрологии. Общее микробное число определялось по ГОСТ 10444.15-94 путем посева глубинным методом десятичного ряда разведений в гидролизате рыбной муки (ГРМ), агаре и инкубации при температуре 37º С в течение 72 ч. Результаты представлены в табл. 1, фотографии выросших колоний – на рисунке.

 

Таблица 1

Сравнение трех сроков хранения по общему микробному числу

Table 1

Comparison of three sample storage periods by the total microbial number

Концентрация спирта, %	Вид спирта	ОМЧ, КОЕ/г
		6 месяцев (группа 1)	18 месяцев (группа 2)	36 месяцев (группа 3)
10	Метилкарбинол	50	12000	22000
	Диметилкарбинол	˂1	10	˂10
20	Метилкарбинол	˂100	100	110
	Диметилкарбинол	˂100	280	40
30	Метилкарбинол	160	-	20
	Диметилкарбинол	40	˂1	40
40	Метилкарбинол	100	100	30
	Диметилкарбинол	˂100	60	13000
50	Метилкарбинол	164	-	150
	Диметилкарбинол	2000	40	40
60	Метилкарбинол	-	100	10
	Диметилкарбинол	10	40	˂10
70	Метилкарбинол	6000	10	140
	Диметилкарбинол	˃30000	20	10

 

Рисунок. Фотографии выросших колоний: а) споры и вегетативные клетки картофельной палочки под микроскопом (х 600); б–д) колонии картофельной палочки; е) очень мелкие колонии.

Figure. Photographs of grown colonies: a) spores and vegetative cells of potato bacillus under the microscope (x 600); б-д) – colonies of potato bacillus; е) very small colonies.

 

На 24-е сутки хранения в спиртах (диметилкарбиноле и метилкарбиноле), с концентрацией спирта в растворе 10 об. %, наблюдалось вздутие крышек, а на дне банок – белый осадок. Банки были открыты и снова закрыты, и в дальнейшем у них не отмечалось вздутия крышек. Большое число КОЕ/г в пробе, хранящейся в 10%-ном метилкарбиноле и 40%-ном диметилкарбиноле, возможно, связано с исходным загрязнением проб пчел этими бактериями, а их сохранность вполне можно объяснить их спорообразованием.

Далее проведено сравнение проб пчел разных сроков хранения и хранящихся в различных спиртах и разных концентрациях этих спиртов между собой с применением непараметрических критериев. Результаты представлены в табл. 2–5. Рассчитанные (эмпирические) критерии затем сравнивали с табличными (критическими) [5, прил. 1 (критерий Манна-Уитни – табл. 2; критерий Вилкоксона – табл. 6; критерий Фридмана – табл. 9, а для с=3, n˂9 – табл. 7а; критерий Крускала-Уоллиса – при c=3 и n≤5 по табл. 3; при c˃3 или n˃5 по табл. 9].

Критерий Манна-Уитни используется для сравнения независимых выборок, с его помощью проверяли две противоположные гипотезы: Н₀ – уровень признака в одной группе не отличается от уровня признака в другой группе; H₁ – уровень признака в одной группе отличается от уровня признака в другой группе. Различия между выборками оказались достоверными в двух случаях (табл. 2, помечены «*»).

 

Таблица 2

Рассчитанный критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney) (U_эмп) для различных группирующих переменных

Table 2

The calculated Mann-Whitney criterion (U_emp) for different grouping variables

Переменная	n	Uэмп	p-level	2×1 sided exact p
Сравнение двух сроков хранения по ОМЧ, кое/г (два спирта)
ОМЧ, кое/г (6 мес./18 мес.)	14	71,0	0,215	0,227
ОМЧ, кое/г (6 мес./36 мес.)	14	70,5	0,206	0,210
ОМЧ, кое/г (18 мес./36 мес.)	14	94,5	0,871	0,874
Сравнение метилкарбинола и диметилкарбинола по ОМЧ, кое/г
Сроки хранения 6 и 18 месяцев	14	57,0*	0,060	0,062
Сроки хранения 18 и 36 месяцев	14	64,0	0,118	0,125
ОМЧ6мес, кое/г	7	18,0	0,406	0,456
ОМЧ18мес, кое/г	7	10,5*	0,074	0фи,073
ОМЧ36мес, кое/г	7	16,5	0,307	0,318
Сравнение двух сроков хранения по ОМЧ, кое/г
ОМЧ метилкарбинол, кое/г (6 мес./18 мес.)	7	19,5	0,523	0,535
ОМЧ метилкарбинол, кое/г (6 мес./36 мес.)	7	19,0	0,482	0,535
ОМЧ метилкарбинол, кое/г (18 мес./36 мес.)	7	21,5	0,701	0,710
ОМЧ диметилкарбинол, кое/г (6 мес./18 мес.)	7	17,0	0,338	0,383
ОМЧ диметилкарбинол, кое/г (6 мес./36 мес.)	7	18,0	0,406	0,456
ОМЧ диметилкарбинол, кое/г (18 мес./36 мес.)	7	23,5	0,898	0,902

Примечание. Различия между выборками можно считать значимыми (* – р˂0,05), если U_эмп ≤ U_0,05, и тем более достоверными (** – р˂0,01), если U_эмп ≤ U_0,01, тогда H₀ отвергается.

Условные обозначения. Здесь и в табл. 3–5: n - количество наблюдений в одной группе; N – количество наблюдений во всех группах (n₁+n₂+...+ n_х);

U_0,05 и U_0,01 – критические значения критерия Манна-Уитни для соответствующего уровня значимости; T_0,05 и T_0,01 - критические значения критерия Вилкоксона для соответствующего уровня значимости; ν – степень свободы, определяется как с-1; с – количество сравниваемых выборок (групп) (при сравнении независимых групп), либо количество наблюдений для группы (при сравнении зависимых групп).

Note. Differences between samples can be considered as significant (* - p˂0.05) if U_emp ≤ U_0.05 and even reliable (** - p˂0.01) if U_emp ≤ U_0.01, then H₀ is rejected.

Symbols used here and in Tables 3–5: n – number of observations in one group; N – number of observations in all groups (n₁+n₂+...+ n_х); U_0.05 and U_0.01 – critical values of the Mann-Whitney criterion for the corresponding significance level; T_0.05 and T_0.01 – critical values of the Wilcoxon criterion for the corresponding significance level; ν - degree of freedom calculated as c-1; c – number of samples (groups) to be compared (when comparing independent groups) or number of observations per group (when comparing dependent groups).

 

Далее был применен критерий Вилкоксона для зависимых выборок, которым проверяли описанные выше гипотезы. Параллельное использование критериев для независимых и зависимых выборок обосновано тем, что:

1. результаты измерений выполнены на разных пробах и их, с одной стороны, можно считать независимыми;
2. с другой стороны, пчелы в разных пробах от одной семьи связаны родством по меньшей мере по материнской линии.

Из табл. 3 видно, что критерий Т оказался значимым на первом уровне достоверности в трех случаях, а на втором – в семи. Наибольший интерес представляет критерий Вилкоксона, полученный для сочетания пар: «6 месяцев, ОМЧ кое/г & 18 месяцев, ОМЧ кое/г» и «6 месяцев, ОМЧ кое/г & 36 месяцев, ОМЧ кое/г».

 

Таблица 3

Рассчитанный критерий Вилкоксона (Wilcoxon) (T_эмп) для различных пар переменных

Table 3

The calculated Wilcoxon criterion (T_emp) for different pairs of variables

Группы	n	Tэмп	p-level
Все (два спирта, два срока хранения 6 и 18 мес.) Концентрация спирта, % & ОМЧ, кое/г	28	50,5**	0,001
Все (два спирта, два срока хранения 6 и 36 мес.) Концентрация спирта, % & ОМЧ, кое/г	28	60,0**	0,002
Все (два спирта, два срока хранения 18 и 36 мес.) Концентрация спирта, % & ОМЧ, кое/г	28	97,5**	0,048
Все группы
6 месяцев, ОМЧ кое/г & 18 месяцев, ОМЧ кое/г	14	20,0*	0,248
6 месяцев, ОМЧ кое/г & 36 месяцев, ОМЧ кое/г	14	24,0*	0,239
18 месяцев, ОМЧ кое/г & 36 месяцев, ОМЧ кое/г	14	35,5	0,784
Концентрация спирта, % & 6 месяцев, ОМЧ кое/г	14	6,0**	0,004
Концентрация спирта, % & 18 месяцев, ОМЧ кое/г	14	22,5*	0,108
Концентрация спирта, % & 36 месяцев, ОМЧ кое/г	14	28,5	0,235
Метилкарбинол
Концентрация спирта, % & ОМЧ (6 и 36 месяцев) кое/г	14	8,0**	0,005
Концентрация спирта,% & ОМЧ (18 и 36 месяцев) кое/г	14	14,0**	0,016
6 месяцев, ОМЧ кое/г & 18 месяцев, ОМЧ кое/г	7	4,0	0,715
6 месяцев, ОМЧ кое/г & 36 месяцев, ОМЧ кое/г	7	8,0	0,310
18 месяцев, ОМЧ кое/г & 36 месяцев, ОМЧ кое/г	7	12,0	0,735
Концентрация спирта, % & 6 месяцев, ОМЧ кое/г	7	0,0**	0,018
Концентрация спирта, % & 18 месяцев, ОМЧ кое/г	7	3,5	0,076
Концентрация спирта, % & 36 месяцев, ОМЧ кое/г	7	6,0	0,176
Диметилкарбинол
Концентрация спирта, % & ОМЧ (6 и 36 месяцев) кое/г	14	25,5	0,162
Концентрация спирта,% & ОМЧ (18 и 36 месяцев) кое/г	14	35,0	0,754
6 месяцев, ОМЧ кое/г & 18 месяцев, ОМЧ кое/г	7	8,0	0,310
6 месяцев, ОМЧ кое/г & 36 месяцев, ОМЧ кое/г	7	5,0	0,500
18 месяцев, ОМЧ кое/г & 36 месяцев, ОМЧ кое/г	7	7,0	0,893
Концентрация спирта,% & 6 месяцев, ОМЧ кое/г	7	4,0	0,091
Концентрация спирта,% & 18 месяцев, ОМЧ кое/г	7	8,5	0,675
Концентрация спирта, % & 36 месяцев, ОМЧ кое/г	7	10,5	1,000

Примечание. «Типичный» сдвиг является достоверно преобладающим по интенсивности, если Т_эмп ≤ Т_0,05 (* - р˂0,05), и тем более достоверно преобладающим, если Т_эмп ≤ Т_0,01 (** - р˂0,01) [6].

Note. “Typical” shift is significantly dominant by intensity if T_emp ≤ T_0.05 (* - р˂0.05) and even more significantly dominant if T_emp ≤ T_0.01 (** - р˂0.01) [6].

 

Затем были рассчитаны критерии, позволяющие провести множественные сравнения. Это критерии Крускала-Уоллиса (для независимых групп) и Фридмана (для зависимых переменных). Проверяли две противоположные гипотезы: H₀ – различия между разными концентрациями спиртовых растворов по ОМЧ случайны, т. е. выборки не различаются, и Н₁ – различия между разными концентрациями спиртовых растворов по ОМЧ не случайны (т. е. выборки различаются). Результаты представлены в табл. 4–5.

 

Таблица 4

Рассчитанный критерий Крускала-Уоллиса^* (Kruskal-Wallis) (H_эмп) (группирующая переменная – концентрация спирта, %)

Table 4

The calculated Kruskal-Wallis criterion* (H_emp) criterion (grouping variable - alcohol concentration, %)

Группа	ν	N	Hэмп	p
Все (два спирта, три срока хранения)	2	42	2,2	0,337
Метилкарбинол (три срока хранения)	2	21	0,7	0,702
Диметилкарбинол (три срока хранения)	2	21	1,1	0,567
6 месяцев (два спирта)	6	14	10,5	0,107
18 месяцев (два спирта)	6	14	4,8	0,573
36 месяцев (два спирта)	6	14	4,7	0,587
два спирта, три срока хранения	6	42	6,0	0,421

Примечание. ^* Различия между двумя распределениями могут считаться достоверными, если H_эмп ≥ X²_0,05, и тем более достоверными, если H_эмп ≥ X²_0,01. Если H_эмп ≥ критическое значение X², Н₀ отвергается.

Note. * Differences between two distributions can be considered as reliable if H_emp ≥ X²_0,05 and even more reliable if H_emp ≥ X²_0,01. If H_emp ≥ critical value X², Н₀ is rejected.

 

Таблица 5

Рассчитанные критерий Фридмана^# (Friedman) (X_r²) и коэффициент согласованности Кенделла (Kendall) (W_k)

Table 5

The calculated Friedman criterion^# (X_r²) and Kendall consistency coefficient (W_k)

Группа	n	ν	Критерий Friedman		Коэффициент согласованности
			Xr2эмп	p	Wk	r*
Сравнение разных концентраций между собой по ОМЧ кое/г
Метилкарбинол+ диметилкарбинол, ОМЧ кое/г	3	13	16,97	0,201	0,435	0,153
Метилкарбинол, ОМЧ кое/г	3	6	4,00	0,677	0,222	0,167
Диметилкарбинол, ОМЧ кое/г	3	6	10,10	0,120	0,561	0,342
Сравнение трех сроков хранения между собой по ОМЧ кое/г
Два спирта, ОМЧ кое/г	14	2	1,51	0,470	0,054	-0,019
Метилкарбинол, ОМЧ кое/г	7	2	1,52	0,468	0,109	-0,040
Диметилкарбинол, ОМЧ кое/г	7	2	0,33	0,846	0,024	-0,139

Примечание. * r – cредний ранг.

^# Различия между двумя распределениями могут считаться достоверными, если X_r²_эмп ≥ X²_0,05, и тем более достоверными, если X_r²_эмп ≥ X²_0,01.

Note. * r – mean rank.

^#Differences between two distributions can be considered as reliable if X_r²_emp ≥ X²_0.05, and even more reliable if X_r²_emp ≥ X²_0.01.

 

В итоге проведенных множественных сравнений с использованием критериев Крускала-Уоллиса и Фридмана достоверных различий не установлено. В нашем случае принимается H₀, т. е. различия случайны.

Выводы

1. При анализе материала, хранящегося в двух спиртах в разных их концентрациях 36 месяцев, установлено, что ОМЧ только в двух случаях (10%-ный метилкарбинол и 40%-ный диметилкарбинол) было высоким. В этих случаях бактерии были представлены спорообразующими формами, т. е. способными переживать неблагоприятные условия.
2. Сравнение проб пчел, хранящихся в растворах двух спиртов разных концентраций 6, 18 и 36 месяцев с помощью непараметрических критериев парного сравнения, в отдельных случаях выявило достоверные различия. Так, при сравнении проб пчел по общему микробному числу, хранящихся в двух спиртах, установлено достоверное различие по критерию Манна-Уитни на первом уровне значимости. По критерию Вилкоксона было установлено достоверное отличие на первом уровне значимости между следующими парами сравнения: «6 месяцев, ОМЧ кое/г и 18 месяцев, ОМЧ кое/г» и «6 месяцев, ОМЧ кое/г и 36 месяцев, ОМЧ кое/г».
3. Сравнение проб пчел, хранящихся в растворах двух спиртов разных концентраций 6, 18 и 36 месяцев с помощью непараметрических критериев множественного сравнения, не выявило достоверных различий.
4. Для консервирования проб пчел экономически выгоднее использование диметилкарбинола из-за его более низкой стоимости и простоты приобретения.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Andrey S. Berezin

Federal Beekeeping Research Centre

Author for correspondence.
Email: mellifera@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7622-0673
SPIN-code: 2595-5944
ResearcherId: ABO-7310-2022

Senior Researcher at the Selection and Honey Bees’ Breeding Department 

Russian Federation, 22 Pochtovaya st., Rybnoe, Ryazan Region, 391110

References

Supplementary files